El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la modulación de receptores acoplados a proteínas G por canales de potasio, utilizando biosensores ópticos sin etiqueta basados en la gradación de longitud de onda de resonancia para lograrlo. Células HEK 293 no modificadas y células HEK 293 que expresan establemente el canal de potasio activado por sodio tipo Slack B de rata se siembran en una placa de biosensor óptico de 384 pocillos y se incuban durante la noche. A continuación, se realiza una medición de referencia de la masa cercana a la membrana plasmática y se añaden agonistas de receptores acoplados a proteínas G endógenos o GPCR. Como paso final, se mide el cambio en la señal resultante de la activación del GPCR y se calcula la modulación del canal de potasio sobre esta respuesta.

En última instancia, este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neurociencia y la señalización celular mediante la medición cuantitativa de los mecanismos de señalización entre receptores acoplados a proteínas G y canales de potasio. Las principales ventajas de utilizar esta técnica frente a los métodos existentes para estudiar las interacciones entre canales y proteínas, por ejemplo, los ensayos de co-precipitación, son que el ensayo puede realizarse utilizando células vivas y no requiere el uso de marcadores exógenos, los cuales podrían alterar la estructura de la proteína que interactúa.

Y finalmente, dentro de las células vivas, es posible seguir las interacciones en tiempo real. Aunque este método puede proporcionar información sobre la señalización entre receptores acoplados a proteínas G y canales de potasio, también puede utilizarse para estudiar las respuestas celulares resultantes de cambios inducidos por ligandos en la adhesión y extensión celular, toxicidad, proliferación, migración, y cualquier cambio en la proximidad de la membrana plasmática respecto al biosensor óptico.

La técnica también tiene el potencial de utilizarse en el descubrimiento de nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades causadas por alteraciones en canales iónicos o receptores, como muchas canalopatías, ya que puede emplearse como un método de alto rendimiento para evaluar los efectos de agentes farmacológicos sobre las proteínas de canal. Interacciones proteicas. Tuvimos por primera vez la idea de utilizar este método cuando comprendimos que era necesario desarrollar un ensayo capaz de analizar las interacciones de las proteínas de canal en células vivas.

Comience el recubrimiento de la placa óptica biosensora de 384 pocillos hidratando una placa de dióxido de titanio con 20 microlitros por pocillo de agua estéril para cultivo de tejidos durante 15 minutos. Luego, utilice un pipeteador de 16 canales para lavar la placa una vez con 50 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS por pocillo.

A continuación, agregue 20 microlitros de una solución de trabajo de fibronectina preparada a cada pocillo antes de incubar durante dos horas a temperatura ambiente para crear la matriz extracelular o ECM tras la incubación. Lave la placa una vez con 50 microlitros de PBS por pocillo y luego agregue 40 microlitros de una solución de trabajo de ovoalbúmina preparada a cada uno.

Incubar bien la placa durante la noche a cuatro grados Celsius para bloquear la placa tras la unión de ovoalbúmina. Lavar la placa tres veces con 50 microlitros de PBS por pocillo. Las placas recubiertas con ECM pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta cuatro ocho horas.

Retire el medio de crecimiento de las células HEK 293 no resecadas y de las células HEK 293 que expresan establemente Slack B, las cuales han sido cultivadas según se describe en el protocolo del texto. A continuación, agregue tripsina para desprender las células de la placa. Recolecte las células mediante centrifugación a 1000 ×g durante un minuto.

Elimine el medio de tripsina y resuspenda las células en medio de crecimiento. Utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado, determine la concentración de las células para minimizar los efectos de la evaporación durante la incubación; diluya las células para obtener el número deseado de células por pocillo. En un volumen de 50 microlitros de medio de crecimiento para estos experimentos, 1000 células por pocillo.

Se sembraron en el biosensor después de pipetear 50 microlitros de las células diluidas en cada pocillo; se dejó que las células asentadas se incubaran durante la noche en medio de crecimiento a 37 grados Celsius, 5 %CO2. Para preparar el ensayo del biosensor óptico por calibración de longitud de onda de resonancia o RWG. Retire el medio de crecimiento de las células tras la incubación.

Lave las células una vez con solución salina balanceada de Hank y luego agregue 25 microlitros de la solución a cada una. Coloque la placa de biosensor en el escáner de unión y permita que las células se equilibren a temperatura ambiente durante una a dos horas. Mientras tanto, prepare una placa de compuestos separada de la cual se agregarán los ligandos de interés a la placa de biosensor durante el ensayo.

Para estos ensayos, se añadieron 25 microlitros de solución que contenía el compuesto a cada pocillo de la placa de biosensor, obteniendo un volumen total de 50 microlitros. Para realizar el ensayo de biosensor óptico RWG, tome una medición de línea base con el sistema de escaneo para los pocillos desde A1 hasta P12, que representan la mitad de la placa de 384 pocillos. Utilice una resolución máxima de 3,75 micrómetros por píxel para los 1,5 milímetros centrales de cada pocillo mediante el software de escaneo bind scan; este escaneo de línea base tomará aproximadamente 30 minutos.

Luego, agregue 25 microlitros de las soluciones del compuesto a cada pocillo de los pocillos A1 a P12. A continuación, realice una medición inicial de los pocillos A13 a P24. Después de obtener la medición inicial de estos pocillos, agregue 25 microlitros de las soluciones del compuesto a cada uno de los pocillos A13 a P24.

Como paso final, tome una medición posterior a la edición del compuesto para los pocillos de A1 a P12 y repita para los pocillos de A13 a P24. Para analizar los datos del ensayo, abra los datos del ensayo de unión para la medición de línea base en ventanas y haga clic en el botón del editor de cuadrícula para habilitar la selección de celdas. El software calculará las métricas de interés definidas por el usuario; abra los complementos, que incluyen el buscador de celdas, y establezca los parámetros de la función de línea base en el buscador de celdas para que las celdas sean distinguibles del fondo del biosensor.

Exporte el archivo de mapa de células, que contiene los datos del buscador de células para la medición de referencia. Repita estos pasos para los datos posteriores a la adición del compuesto. A continuación, abra la referencia o el complemento e importe el mapa de células de la medición de referencia.

El software calculará el desplazamiento en el valor de longitud de onda pico o PWV entre los datos de fondo y los datos posteriores al compuesto. Seleccione celda delta media para obtener como resultado el desplazamiento medio en PWV para las células. Luego, los datos pueden exportarse a Microsoft Excel para un análisis adicional.

Slack b transfectado establemente, HEK 2 93. Las células y las células HEK 2 93 de control no transfectadas se sembraron a 1000 células por pocillo en placas biosensoras RWG de 384 pocillos recubiertas con ECM. Se generaron mapas de gradiente de densidad de masa antes y 30 minutos después de la adición del compuesto con el escaneo de unión.

Las áreas del software mostradas en rojo representan píxeles identificados como pertenecientes a células, y las líneas amarillas distinguen las células del fondo gris de la placa. Se utilizó el software bind view para determinar el cambio en la PWV tras la adición del agonista del receptor acoplado a proteína G, restando la PWV posterior a la adición del compuesto de la PWV basal. Esto se muestra mediante un gradiente de color en el que el rojo representa un cambio positivo en el valor de longitud de onda máxima y el azul representa ausencia de cambio.

El receptor muscarínico M1 endógeno frente al carbacol se aplicó tanto a células HEK 293 de control no resecadas como a células HEK 293 que expresaban establemente slack B, y provocó un aumento positivo en el valor de longitud de onda máxima en comparación con las células de control. Las células transfectadas con slack B presentaron un mayor aumento en el valor de longitud de onda máxima. El péptido S-F-L-L-R NH₂, sal de trifluoroacetato, y el péptido pentapéptido activador del receptor de trombina terminal, que exhibe actividad agonista frente al receptor acoplado a proteína G (GPCR) activado por proteasa uno, también mostraron respuestas diferenciales en células no resecadas y células transfectadas con slack B.

Estos resultados muestran que la presencia del canal Slack B aumenta significativamente el desplazamiento en la velocidad de onda del pulso (PWV) que ocurre tras la activación del receptor acoplado a proteína G endógeno en las células K, y demuestran la viabilidad de utilizar este ensayo para estudiar interacciones entre proteínas de canal. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y realizar un ensayo de biosensor óptico sin marcado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en el transcurso de dos días si las células y los reactivos se han preparado cuidadosamente durante el intento de este procedimiento.

Es importante recordar que los parámetros del ensayo, como el número de células a sembrar, el tiempo de incubación de los ligandos, etc., deben optimizarse para diferentes líneas celulares. Una vez que haya llevado a cabo este procedimiento, puede utilizar otros métodos, como R e IA, para intentar determinar qué proteínas específicas son necesarias para el cambio observado en la señal. No olvide que trabajar con cultivos celulares humanos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una cabina de seguridad biológica, al realizar este procedimiento.