Name: Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a generar matrices nativas de fibroblastos para evaluar la invasión de células tumorales en cultivos 3D. Este método permite estudiar las interacciones tumor-estroma sin sustratos sintéticos.

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APS es apoyado por la Fundación Debra Piel británica e internacional. YZN es apoyado por A * STAR - Universidad de Programa de Doctorado Dundee Partnership.

Este estudio se realizó de acuerdo a la Declaración de Principios de Helsinki y fue aprobado por los Comités de Ética apropiados. 1. Preparación de Medios y Reactivos <ol><li> Preparación de 200x de ácido L-ascórbico 2-fosfato de stock <ol><li> Disolver 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 ml de medio de Eagle modificado (DMEM) solución de Dulbecco y filtrar a través de 0,22 micras filtro de membrana. Tienda como 0,25 ml alícuotas estériles en -20 ° C. </li><li> Añadir 0,25 ml de alícuota de ácido L-ascórbico de stock 200x 2-fosfato a cada 50 ml de medio de fibroblastos (DMEM con 1% de L-glutamina y suero bovino fetal al 10%) en el día requerido, para una concentración final de 0,1 mM de L ácido ascórbico-2-fosfato. </li></ol></li><li> Preparación de medio de crecimiento de queratinocitos <ol><li> Aislamiento y cultivo de queratinocitos primarios SCC se han descrito previamente 21. Preparación de medio de crecimiento de queratinocitos se describeen él también. </li><li> En pocas palabras, la preparación de los medios de comunicación de la siguiente manera: 300 ml de DMEM y 100 ml de medio de Ham F-12 suplementado con 10% de FBS 0,4 mg / ml de hidrocortisona 5 mg / ml de insulina 10 ng / ml de EGF 5 mg / ml de transferrina 8,4 ng / ml de toxina del cólera 13 ng / ml liothyronine Solución de penicilina-estreptomicina 1x </li></ol></li></ol> 2. In Vitro La construcción de la Matriz Nativo derivados de fibroblastos en ácido L-ascórbico 2-fosfato suplementado Medios <ol><li> Seed 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de 6 pocillos (20.000 células / cm 2) en medios suplementados con fibroblastos de ácido L-ascórbico 2-fosfato. Vuelva a introducir cada 2-3 días con 2-5 ml de medio. (Nota: Realimentación frecuencia y el volumen se pueden ajustar para adaptarse a las necesidades individuales de las diferentes células Ver &quot;discusiones&quot;.). </li><li> Una gruesa capa de células embebidas en la matriz extracelular se forma al final de las 6 semanas, visibles a simple vista ( <strong&gt; Figura 1). Para liberar esta capa de la placa de cultivo de tejidos, raspar suavemente la circunferencia de la matriz con una punta de micropipeta 1 ml y luego tire de los bordes de la matriz hacia el centro del pozo. Esta capa de células y la matriz (matriz nativa) debe ser fácilmente separable de la superficie de la placa, y ahora ser flotante en los medios de comunicación. Extienda la matriz nativa en los medios de comunicación para evitar que plegar sobre sí misma. </li><li> Deje que el flotador matriz nativa y remodelar por 5 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. Debido a la resistencia a la tracción y la remodelación intrínseca dentro de la matriz, la matriz se contraerá drásticamente reducida y se convierten a una matriz nativa más pequeño, pero más grueso, y está listo para ser utilizado para el ensayo de invasión. </li></ol> 3. Ensayo de invasión tumoral SCC con queratinocitos <ol><li> Recoge la matriz nativa suavemente con unas pinzas romas y traslado al Nylon red. Una vez en la red de nylon, se extendió la matriz suavemente para estar lo más plana posible utilizando una micropipeta 1 mlpunta y fórceps romos. </li><li> Preparar los cilindros clonales estériles untando una pequeña cantidad de vaselina estéril en un extremo. </li><li> Coloque los cilindros clonales en la matriz nativa, con la cara hacia abajo vaselina. Esto es para asegurar un sello hermético entre la matriz nativa y los anillos clonales. </li><li> Añadir células CSCC a los cilindros clonales (250.000 células en 100 l de medio de crecimiento de queratinocitos). </li><li> Retire los cilindros clonales después de 6 horas cuando las células CSCC se han establecido en la matriz materna. </li><li> Levante la red de nylon con la matriz nativa y células CSCC para interfase aire-líquido sobre soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado. </li><li> Añadir medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con ácido ascórbico hasta que el nivel de los medios de comunicación toca la parte inferior de la matriz nativa. </li><li> Cambie medios cada 2-3 días y la cosecha a las 7 y 14 días después de la siembra de células CSCC. </li></ol> 4. La recolección de las Culturas en 3D y Preparación para Histología <ol><li> Fijar en el 4% nominaldurante la noche aformaldehyde a temperatura ambiente. </li><li> Biseccionar las muestras y de inserción en la cera de parafina para fijado en formol e incrustados bloques, con la superficie cortada hacia el exterior. </li><li> Alternativamente, incrustar las muestras bisectados en octubre y snap-congelado inmediatamente en nitrógeno líquido para bloques frescas de tejido congelado. </li><li> Cortar 4 micras secciones de microtomo y desparafinado (si es necesario). Teñir utilizando hematoxilina y eosina estándar. Para visualizar las células CSCC, anticuerpo monoclonal de ratón contra la queratina 14 (LL001, en-casa) se puede utilizar en la tinción inmunohistología. </li></ol>

<ol><li>Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+tissue+formed+in+vitro+and+accepted+as+skin-equivalent+tissue+of+full+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness.</a> Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).</li>
<li>Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis+and+induction+of+the+67+kD+keratin+polypeptide+by+culture+of+human+keratinocytes+at+the+liquid-air+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.</a> Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).</li>
<li>Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).</li>
<li>Prunieras, M., Régnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+culturing+human+epidermal+cells+on+allogenic+or+xenogenic+skin%3A+preparation+of+recombined+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chir.+Plast%22%5BJournal%5D)">New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts.</a> Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-%CE%BAB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+collagen+and+other+proteins+of+the+skin+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits.</a> Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).</li>
<li>Ehrmann, R. L., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+cells+on+a+transparent+gel+of+reconstituted+rat-tail+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen.</a> J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+active+growth+factors+in+basement+membrane+Matrigel+suggests+caution+in+interpretation+of+cellular+activity+related+to+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components.</a> Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BD+Biosciences+-+Discover+Labware%5BTitle%5D)+AND+%22SPC-356230+Rev+5.0+at+Rev+5.0%22%5BJournal%5D)">BD Biosciences - Discover Labware.</a> SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://SPC-356230 Rev 5.0">http://SPC-356230 Rev 5.0</a> Forthcoming.</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Predisposition+to+Cutaneous+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+human+type+VII+collagen.+Complete+primary+sequence+of+the+alpha+1%28VII%29+chain+and+identification+of+intragenic+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms.</a> J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).</li>
<li>Hovnanian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+to+the+type+VII+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).</li>
<li>Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+type+VII+collagen+%28COL7A1%29+to+dominant+dystrophic+epidermolysis+bullosa+in+families+with+abnormal+anchoring+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils.</a> J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).</li>
<li>Ng, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-derived+dermal+matrix+drives+development+of+aggressive+cutaneous+squamous+cell+carcinoma+in+patients+with+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).</li>
<li>Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+15%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 15.</a> Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+human+skin+produced+in+vitro+and+grafted+on+athymic+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice).</a> Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+squamous+cell+carcinoma+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines.</a> Methods Biol. 731, 151-159 (2011).</li>
<li>Pinnell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+collagen+biosynthesis+by+ascorbic+acid%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review.</a> Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).</li>
<li>Hata, R., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+2-phosphate+stimulates+collagen+accumulation%2C+cell+proliferation%2C+and+formation+of+a+three-dimensional+tissuelike+substance+by+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts.</a> J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a la naturaleza de este experimento, el tiempo total requerido para la terminación puede ser de hasta dos meses. A lo largo de este tiempo, se deben emplear las prácticas de cuidado de cultivo y del tejido estéril todo lo posible para evitar la contaminación microbiana. Aparte de su papel como un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina de colágenos, ácido ascórbico estimula el colágeno específica la expresión del ARNm en los fibroblastos <...

El uso de biomaterial en cultivo de tejido 3D ha permitido a los investigadores a estudiar el comportamiento de células en el laboratorio bajo condiciones fisiológicas más similares a un entorno in vivo que el de uno recapitulado con la adhesión 2D y un sustrato de plástico. En particular, los grandes avances se han hecho en el modelado de epitelio estratificado con la adopción de métodos de cultivo en 3D en la interfase aire-líquido 1-4. Dichas técnicas fielmente imitan la diferenciación de los queratinocitos y la invasión de las células tumorales que permite una mayor flexibilidad y fidelidad para los investigadores que estudian estos procesos. La elección de sustrato biomaterial para imitar el entorno del estroma ha implicado principalmente el uso de colágeno de tipo I, de Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón y la dermis-epidermized DE. Por ejemplo, se ha demostrado que los fibroblastos asociados con el cáncer de contribuir hacia la invasión del cáncer 5, la iniciación y la progresión a través de interacciones estroma epitelial 6,7 wheN crecido en tales sustratos. El estándar de oro para imitar el entorno del estroma en la piel, las mayores y más ampliamente estudiados epitelios estratificados utilizando estas técnicas, se considera que se des-epidermized dermis humana (DED). Preparación de la DED implica la eliminación de la epidermis a través de tripsinización o disociación física a partir de 3,4 piel de cadáver humano. Sin embargo, el acceso a dicha piel puede ser muy difícil para los laboratorios no asociados con instituciones clínicas y dermis enfermas es casi imposible de obtener. Como alternativa, los laboratorios utilizan con frecuencia una combinación de colágeno de tipo I (aislado de colas de rata) y / o matriz de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón. Después de que el descubrimiento en 1927 por Nageotte 8 que el colágeno puede ser fácilmente aislado utilizando ácido acético y la precipitación de sales, su aplicación al cultivo de tejidos fue posteriormente iniciado por Huzella y colegas 9. Recubrimiento de colágeno resultó ser superior al vidrio para cultivo de células de 29 cepas y explantes de tejido como interrogados por Ehrmann y Gey 9. En la actualidad, el principal tipo de colágeno utilizado en el cultivo de tejidos se aísla de los tendones de cola de rata, y por lo general se compra a partir de fuentes comerciales. Sin embargo, el inconveniente de recapitulación sustrato fieles es que el colágeno de cola de rata no es idéntico al colágeno humano o la dermis humana, en los que están presentes como constituyentes principales de tipo I y III colágeno, y aislado de colágeno de cola de rata es invariablemente fragmentado. Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón es una mezcla de proteína gelatinosa secretada por cultivos de células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm 10. Los principales constituyentes son laminina, colágeno tipo IV, proteoglicanos de sulfato de heparina, entactina y nidogen y las proporciones exactas de estas proteínas pueden variar de lote a lote. Aparte de pro estructuralproteínas, esta matriz también contiene niveles significativos de factores de crecimiento tales como la transformación de β factor de crecimiento, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina 1, factor de crecimiento de fibroblastos bovino, y factor de crecimiento derivado de plaquetas que pudieran alterar el comportamiento celular 11,12. Apuntando hacia la gran complejidad de Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón, se identificaron un total de 1.851 proteínas en un estudio proteómico reciente 13. A la luz de la naturaleza rica y compleja de esta matriz, la precaución ha sido advertido en la interpretación y comparación de diferentes experimentos con el uso de la misma 11. Nuestros laboratorios tienen un gran interés en enfermedades de la piel genéticos, particularmente aquellos con una predisposición a desarrollar cutánea de carcinoma de células escamosas (CSCC) 14. En el caso de epidermolisis bullosa distrófica recesiva (RDEB), una enfermedad grave con ampollas germinal mutaciones en el gen COL7A1 <shasta&gt; 15 a 17, se ha determinado que el microambiente dérmica en estos pacientes es la promoción del tumor 18. Durante el transcurso de este estudio no fue posible evaluar el tumor propiedades promotoras de fibroblastos dérmicos incrustados en colágeno I / Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón e investigados formas de evaluar propia matriz de células, nativo. Para lograr esto, hemos modificado la técnica anterior del laboratorio de Lucie Germain de trabajo en la piel humana equivalentes 19,20. La técnica de Germain fue capaz de reconstruir la piel humana con la membrana basal bien organizado usando cultivos de queratinocitos humanos y de fibroblastos primarios en ausencia de un andamio sintético o de cadáver. En este trabajo los pasos utilizados para recapitular el microambiente del estroma del tumor cutáneo (matriz nativa) derivan directamente de los fibroblastos del estroma primarias in vitro se describen 18. Matrices nativos produced por cultivo a largo plazo de los fibroblastos fueron utilizados como un equivalente dérmico a ensayo para la invasión de células CSCC. Se presentan los datos utilizando la matriz nativa derivada ya sea de la matriz extracelular secretada por los fibroblastos RDEB (deficiencia de colágeno tipo VII (C7)) o de los fibroblastos RDEB retroviralmente transducidas con un colágeno tipo VII expresando construir y demostrar el profundo efecto de una sola colágeno de tumor la invasión de células.

<table><tbody><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutamina, 4.500 mg/L de D-glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros clonales</td><td>Sigma</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>Disco de filtro de red de nailon hidrófilo 100 &#956; m 25 &#956; m de diámetro 100/pk</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Las dimensiones se hicieron para que la malla encajara en placas de 6 pocillos</td></tr></tbody></table>

ingeniería de tejidos de tumor del estroma microambiente con aplicación a la invasión de células cancerosas

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Cultivos organotípicos 3D de células epiteliales en una matriz incrustada con células mesenquimales son ampliamente utilizados para estudiar la diferenciación de las células epiteliales y la invasión. Tipo de cola de rata colágeno I y / o una matriz derivada de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón han sido empleado tradicionalmente como los sustratos para modelar la matriz o estroma microambiente en el que se llenan las células mesenquimales (generalmente fibroblastos). Aunque los experimentos utilizando tales matrices son muy informativo, se puede argumentar que, debido a una presencia dominante de una sola proteína (como en el colágeno tipo I) o un alto contenido de componentes de la membrana basal y factores de crecimiento (tales como en la matriz derivada de ratón Las células del sarcoma), estos sustratos no reflejan mejor la contribución a la composición de la matriz de las propias células del estroma. Para estudiar las matrices nativas producidas por los fibroblastos dérmicos primarios aislados de pacientes con un tumor propensos, trastorno de formación de ampollas genética (distrófica recesivaepidermolisis bullosa), hemos adaptado un protocolo de matriz nativa existente para estudiar la invasión de las células tumorales. Los fibroblastos son inducidas a producir su propia matriz durante un período prolongado en cultivo. Esta matriz nativa se separa entonces de la placa de cultivo y las células epiteliales se siembran en que antes de todo el cocultivo se eleva a la interfaz aire-líquido. Diferenciación y / o la invasión celular se puede evaluar en el tiempo. Esta técnica proporciona la capacidad para evaluar la interacción de células epiteliales mesenquimales en un entorno 3D sin la necesidad de una matriz sintética o extranjera con la única desventaja es el período de tiempo prolongado requerido para producir la matriz nativa. Aquí se describe la aplicación de esta técnica para evaluar la capacidad de una sola molécula expresada por los fibroblastos, colágeno de tipo VII, para inhibir la invasión de células tumorales.

<html> Esta técnica abre la posibilidad de examinar y comparar el comportamiento invasivo de las células tumorales (en este caso CSCC) bajo diferentes ambientes estromales 3D. Usando esta técnica, no sólo las matrices nativas C7-deficientes que recapitulados el medio ambiente dérmica EADR se pueden generar, sino también matrices adicionales que han sido modificados genéticamente para sobreexpresar C7 18. Como se ve en la Figura 2, la invasión de los queratinocitos EADR CSCC fue significativame...

De ingeniería tisular matriz nativa derivado de fibroblastos es un nuevo instrumento para generar un sustrato del estroma que apoya la proliferación de células epiteliales y la diferenciación. Aquí se presenta un protocolo de aplicación de esta metodología para evaluar el impacto de los diferentes tipos de células del estroma en la biología de las células tumorales.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es generar una matriz nativa a partir de fibroblastos para evaluar la invasión de células tumorales. Primero, esto se logra cultivando fibroblastos sobre plástico en un medio enriquecido con ácido sórbico para generar la matriz nativa. En una segunda etapa, la matriz nativa se separa y libera de la superficie de crecimiento de plástico, luego se siembran células tumorales sobre esta matriz y se eleva a la interfase aire-líquido tras un período determinado.Estas cultivos 3D se recolectan para el análisis histológico de la invasión de las células tumorales. En última instancia, los efectos de la matriz de fibroblastos nativa sobre la invasión de las células tumorales pueden evaluarse mediante análisis inmunohistoquímico. Así, la ventaja de esta técnica para generar cultivos 3D típicos es que podemos evaluar la matriz nativa producida por los propios fibroblastos, en ausencia de sustratos sintéticos o ajenos, como el colágeno tipo uno de especies diferentes. Comience sembrando 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de seis pocillos, utilizando medio para fibroblastos suplementado con ácido ascórbico recién preparado.Añada dos veces p

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

El flujo de fluido intersticial es elevada en los tumores sólidos y puede modular la invasión de células tumorales. Aquí se describe una técnica para aplicar el flujo de fluido intersticial a las células embebidas en una matriz y luego medir sus efectos sobre la invasión de células. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

Este video describe la técnica de utilizar una matriz nativa para estudiar la invasión de células tumorales. La técnica utilizada en este ensayo proporciona la capacidad de evaluar las interacciones entre células epiteliales y mesenquimales en un entorno 3D sin la necesidad de una matriz sintética o extraña.

Ensayo de invasión de células tumorales: un método 3D in vitro basado en matrices nativas para evaluar las interacciones entre las células epiteliales y mesenquimales

Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Aquí presentamos un protocolo para el cocultivo en tres dimensiones, que es útil para investigar las interacciones multicelulares y la modulación dependiente de la matriz extracelular del comportamiento de las células cancerosas. En este modelo experimental, las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno incrustados con fibroblastos asociados al cáncer humano.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que capturen la diafonía heterocelular para estudiar la metástasis del cáncer. Nuestro estudio presenta la generación de estromas-epiteliales heteromulticelulares en un entorno de andamios y libres de andamios que pueden ser utilizados para estudiar la invasión y las distribuciones espaciales celulares.

Células estromales heteromulticelulares en cultivos 3D sin andamios de células de cáncer epitelial para impulsar la invasión

Aprende a generar matrices nativas de fibroblastos para evaluar la invasión de células tumorales en cultivos 3D. Este método permite estudiar las interacciones tumor-estroma sin sustratos sintéticos.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

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