Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

El objetivo general del siguiente procedimiento es generar una matriz nativa a partir de fibroblastos para evaluar la invasión de células tumorales. Esto se logra primero mediante el cultivo de fibroblastos en plástico en un medio enriquecido con ácido sórbico para generar la matriz nativa. En el segundo paso, la matriz nativa se separa y se libera de la superficie de crecimiento plástica, y luego esta matriz se siembra con células tumorales y se eleva a la interfaz de aire líquido después de un período fijo.

Estos cultivos 3D se recolectan para el análisis histológico de la invasión de células tumorales. En última instancia, los efectos de la matriz de fibroblastos nativos sobre la invasión de células tumorales pueden evaluarse mediante análisis inmunohistológico. Por lo tanto, la ventaja de esta técnica para generar cultivos típicos en 3D es que podemos evaluar la matriz nativa producida por los propios fibroblastos en ausencia de sustratos sintéticos o extraños, como el colágeno de tipo uno de especies cruzadas. Comience sembrando 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de seis pocillos en medios de fibroblasto, suplementados con ácido IC recién preparado.

Dos fosfatos refeman las células cada dos o tres días con dos a cinco mililitros de medios frescos. Una gruesa capa de células incrustadas en una matriz extracelular visible a simple vista se formará al final de las seis semanas. Dependiendo de las células utilizadas, la matriz visible puede formarse tarde o temprano y puede comenzar a desprenderse de la placa como se ve aquí.

Para liberar esta capa de la placa de cultivo de tejidos, raspe suavemente la circunferencia de la matriz con una punta de micropipeta de un mililitro y, a continuación, empuje los bordes de la matriz hacia el centro del pocillo. Las células y la matriz nativa deberían desprenderse fácilmente de la superficie de la placa y ahora estar flotando en el medio. Extienda la matriz nativa dentro del medio para evitar que se pliegue sobre sí misma.

Deje que la matriz nativa flote y se remodele durante cinco días, continuando cambiando el medio cada dos o tres días debido a la resistencia a la tracción y la remodelación intrínseca. La matriz se contraerá drásticamente y se reducirá a una matriz nativa más pequeña pero más gruesa, momento en el que estará lista para ser utilizada. Para el ensayo de invasión.

Para el ensayo de invasión. Primero use pinzas romas para transferir la matriz nativa suavemente a una red de nailon. Una vez en la red, utilice una punta de micropipeta de un mililitro y unas pinzas romas para extender suavemente la matriz y dejarla lo más plana posible.

A continuación, unte una pequeña cantidad de vaselina en un extremo de un cilindro clonal estéril por matriz. A continuación, coloque los cilindros sobre las matrices nativas con el lado de la vaselina hacia abajo para asegurar un sellado hermético entre la matriz nativa y los anillos clonales. Ahora agregue 250.000 células cutáneas de carcinoma de células escamosas o células SCC en medios de crecimiento en quilates a los cilindros.

Una vez que las células SCC cutáneas se hayan asentado en la matriz nativa, retire los cilindros, luego levante la matriz nativa de red de nailon y las células SEC cutáneas a la interfaz de aire líquido y colóquelas en un soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado. Por último, añadir el medio de crecimiento de queratinocitos, suplementado con ácido sórbico hasta que el nivel del medio toque el fondo de la matriz nativa, cambiando el medio cada dos o tres días y cosechando a los siete y 14 días después de la siembra de las células cutáneas del CCE. Esta técnica abre la posibilidad de examinar y comparar el comportamiento invasivo de las células tumorales bajo diferentes ambientes estromales 3D.

Como se observa en estas imágenes, la invasión de los queratinocitos cutáneos de SCC RDEB se retrasó significativamente en C seven con matrices nativas de sobreexpresión en los paneles derechos en comparación con los controles de RDEB deficientes de C seven en los paneles izquierdos. El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores evaluar directamente la influencia de la matriz nativa producida por los fibroblastos en procesos de las células tumorales como la invasión.