Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

El objetivo general del siguiente procedimiento es generar una matriz nativa a partir de fibroblastos para evaluar la invasión de células tumorales. Primero, esto se logra cultivando fibroblastos sobre plástico en un medio enriquecido con ácido sórbico para generar la matriz nativa. En una segunda etapa, la matriz nativa se separa y libera de la superficie de crecimiento de plástico, luego se siembran células tumorales sobre esta matriz y se eleva a la interfase aire-líquido tras un período determinado.

Estas cultivos 3D se recolectan para el análisis histológico de la invasión de las células tumorales. En última instancia, los efectos de la matriz de fibroblastos nativa sobre la invasión de las células tumorales pueden evaluarse mediante análisis inmunohistoquímico. Así, la ventaja de esta técnica para generar cultivos 3D típicos es que podemos evaluar la matriz nativa producida por los propios fibroblastos, en ausencia de sustratos sintéticos o ajenos, como el colágeno tipo uno de especies diferentes. Comience sembrando 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de seis pocillos, utilizando medio para fibroblastos suplementado con ácido ascórbico recién preparado.

Añada dos veces por semana dos a cinco mililitros de medio fresco a las células. Al final de seis semanas, se formará una capa gruesa de células embebida en una matriz extracelular visible a simple vista. Dependiendo de las células utilizadas, la matriz visible puede formarse antes o después y puede comenzar a desprenderse del recipiente, como se observa aquí.

Para liberar esta capa de la placa de cultivo celular, raspe suavemente la circunferencia de la matriz con la punta de una micropipeta de un mililitro y luego empuje los bordes de la matriz hacia el centro del pocillo. Las células y la matriz nativa deben desprenderse fácilmente de la superficie de la placa y ahora flotar en el medio. Extienda la matriz nativa dentro del medio para evitar que se pliegue sobre sí misma.

Deje que la matriz nativa flote y se remodele durante cinco días, continuando con el cambio del medio cada dos o tres días debido a la resistencia a la tracción y al remodelado intrínseco. La matriz se contraerá drásticamente y se reducirá a una matriz nativa más pequeña pero más gruesa, momento en el cual estará lista para ser utilizada. Para el ensayo de invasión.

Para el ensayo de invasión. Primero, use pinzas romas para transferir suavemente la matriz nativa a una red de nailon. Una vez sobre la red, use una punta de micropipeta de un mililitro y pinzas romas para extender suavemente la matriz, dejándola lo más plana posible.

A continuación, extienda una pequeña cantidad de vaselina sobre un extremo de un cilindro clonal estéril por matriz. Luego coloque los cilindros sobre las matrices nativas con el lado de vaselina hacia abajo para asegurar un sello hermético entre la matriz nativa y los anillos clonales. Ahora agregue 250.000 células de carcinoma cutáneo de células escamosas o células SCC en medio de crecimiento para sitio de injerto a los cilindros.

Después de que las células de carcinoma de células escamosas cutáneo se hayan asentado sobre la matriz nativa, retire los cilindros, luego levante la matriz nativa de malla de nailon junto con las células SEC cutáneas hasta la interfase aire-líquido y colóquelas sobre un soporte curvado de malla de alambre de acero inoxidable. Finalmente, agregue medio de crecimiento para queratinocitos suplementado con ácido sórbico hasta que el nivel del medio toque la parte inferior de la matriz nativa, cambiando el medio cada dos o tres días y realizando la recolección a los siete y 14 días posteriores a la siembra de las células de carcinoma de células escamosas cutáneo. Esta técnica abre la posibilidad de examinar y comparar el comportamiento invasivo de las células tumorales en diferentes entornos estromales tridimensionales.

Como se observa en estas imágenes, la invasión de los queratinocitos de carcinoma de células escamosas cutáneo en EBDR fue significativamente retardada en las matrices nativas sobreexpresadas por C siete en los paneles derechos, en comparación con los controles de EBDR deficientes en C siete en los paneles izquierdos. El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores evaluar directamente la influencia de la Matriz Nativa producida por los fibroblastos sobre procesos celulares tumorales como la invasión.