Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

El objetivo general del siguiente video es presentar un enfoque de registro de imágenes para histología tridimensional y reconstrucción de volúmenes, con el fin de estudiar los cambios en la macroestructura celular de la glándula mamaria. Para ello, se extraen glándulas mamarias de ratones tres días después del inicio de la lactancia, tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones nulos para la proteína fijadora del factor de crecimiento similar a la insulina siete, IGF BP siete. A continuación, las glándulas se procesan y se incluyen en bloques de parafina para su seccionamiento.

A continuación, se capturan imágenes del bloque óptico de la cara del tejido y se secciona el bloque de tejido. Se capturan imágenes de las secciones y, mediante un software personalizado, cada sección se alinea con su imagen correspondiente de la cara del bloque para reconstruir el volumen histológico de la glándula mamaria. Los datos resultantes resaltan las diferencias de tamaño entre las glándulas mutantes y de tipo silvestre.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal tridimensional doble es que proporciona información sobre un alcance espacial mucho mayor. Este método también puede utilizarse para investigar y validar técnicas y algoritmos novedosos en imágenes médicas volumétricas y terapias, así como para crear análisis tridimensionales de alta resolución de diferentes órganos. Este volumen de histología reconstruido representa una representación confiable de la muestra del proceso sin errores de registro propagados.

La idea de este método surgió cuando observamos que los ratones nulos para IGF P siete tienen tamaños de camada más pequeños y son incapaces de mantener varias camadas grandes, por lo que decidimos investigar la estructura de sus glándulas mamarias. Una vez que el tejido esté incluido en parafina, utilice un micrótomo rotatorio para recortar el bloque hasta eliminar la parafina sobrante. A continuación, utilizando una fresadora vertical, taladre orificios de un milímetro en al menos dos esquinas del bloque de parafina perpendicularmente al casete y monte el bloque de tejido en el micrótomo rotatorio.

A continuación, para configurar el sistema de imagen de la cara del bloque frente al micrótomo, coloque una cámara con un objetivo teleobjetivo en un ángulo ligero respecto a la superficie del bloque de tejido. La cámara debe estar conectada a una computadora situada frente al micrótomo. Luego, coloque una fuente de luz frente al bloque de manera que la cámara capture el reflejo de la luz proveniente del bloque.

Ajuste el ángulo de la cámara hasta que el tejido en la superficie del bloque se distinga fácilmente de la parafina circundante. Capture una imagen óptica de la cara del bloque. Luego, utilizando el micrótomo, corte cintas de cuatro secciones, de cinco micrómetros de grosor.

Transfiera las tiras a un baño de agua fría, separe las secciones de la tira y luego retire con una espátula la segunda y cuarta sección del agua fría hacia un portaobjetos. Trasládelas a un baño de agua tibia para eliminar las arrugas. Elegir la segunda y cuarta sección proporciona un espacio de cinco micrones entre las secciones.

Una vez que estén desarrugadas, vuelva a montar las secciones sobre las laminillas del microscopio mediante una cucharilla. Como antes, tenga en cuenta que cortar, montar y desarrugar las secciones puede provocar algunas distorsiones, como desgarros, pliegues, contracción y expansión. Estos artefactos complican el registro de las secciones de histología.

Tiña los cortes con h y d utilizando un tinción automática. Luego, cubra las laminillas utilizando un cubreobjetos automático y digitalice las laminillas con un escáner digital de histología a la resolución de interés. Para este protocolo, el aumento es de 20 x y la resolución es de 0,47 micrones.

Esta sección del video ofrece una visión general del proceso de registro de imágenes, que se lleva a cabo utilizando un software personalizado desarrollado en nuestro laboratorio combinado con MATLAB c plus plus. Utilizando ITK, comience por submuestrear las imágenes de histología hasta la resolución de las imágenes de la superficie del bloque. Esto reducirá las imágenes de histología por un factor de 0,026.

A continuación, para la segmentación de imágenes y la selección de puntos, abra algunas imágenes de la superficie del bloque en MATLAB y utilice la herramienta de cursor de datos para medir los valores de píxeles de los orificios de registro. Utilice el valor promedio de píxeles como umbral fijo para segmentar los orificios de registro. Para eliminar los segmentos adicionales, use la circularidad y el área de los objetos segmentados para conservar los orificios y eliminar los segmentos extra.

A continuación, para cada glándula mamaria, seleccione una imagen de la superficie del bloque como referencia. Alinee los centros de los orificios de registro del resto de las imágenes de la superficie del bloque con los centros de los orificios de registro de la imagen de referencia. Luego, utilizando las transformaciones obtenidas para los orificios de registro, alinee manualmente las imágenes de la superficie del bloque y segmente o extraiga el tejido del fondo para las secciones h y d.

Utilice la técnica de umbralización OSU para segmentar las imágenes del fondo y crear máscaras binarias de las imágenes de histología. A continuación, utilizando el histograma de los objetos etiquetados, identifique y seleccione el objeto más grande en cada máscara. Extraiga los puntos del contorno de un píxel de ancho de ambas máscaras, la de histología y la de la superficie del bloque.

A continuación, utilice un algoritmo de descriptores de Fourier para hallar la transformación rígida inicial entre los puntos del contorno de la histología y sus correspondientes imágenes de la superficie del bloque. Esta transformación inicial incluye los factores de traslación, rotación y escala. Transforme cada imagen de histología con la transformación inicial obtenida en el paso anterior.

Para perfeccionar el registro rígido, elimine las secciones de borde de alta curvatura del contorno histológico utilizando un filtro de bola rodante. A continuación, seleccione aleatoriamente 500 puntos de los puntos restantes del límite histológico utilizando una distribución uniforme. Transforme los puntos del límite histológico con la transformación inicial obtenida a partir de los descriptores de Fourier.

Utilice los puntos límite del bloque facial y el algoritmo de puntos más cercanos iterativos para hallar la transformación rígida entre los puntos límite del bloque, los puntos límite faciales y la histología. Puntos límite aleatorios. Luego transforme las imágenes de histología obtenidas en el paso anterior para crear una imagen visual del volumen de histología en el software de visualización 3D.

En Me vis lab, elija los módulos, seleccione archivos varios y agregue el módulo de composición 3D a partir de archivos 2D. Luego, elija imagen en el menú y agregue el módulo de conversión de propiedades de imagen. Finalmente, agregue un módulo de vista 3D desde los módulos de visualización de visores 3D.

Haga doble clic en componer 3D a partir de archivos 2D para cargar las imágenes y haga clic en crear 3D. Ajuste el tamaño del vóxel haciendo doble clic en la conversión de propiedades de imagen y establezca el tamaño del vóxel como 0.018 0.018 0.01. Visualice el volumen haciendo doble clic en ver 3D.

Finalmente, observe la pila de imágenes a cinco aumentos siguiendo los pasos descritos en el documento adjunto. Para caracterizar mejor el déficit del ratón nulo para I-G-F-B-P siete, se realizó la reconstrucción tridimensional de glándulas mamarias como se describe en el presente documento. Estas figuras muestran los volúmenes de histología reconstruidos de las glándulas mamarias de tipo salvaje y nulas.

Téngase en cuenta que la glándula mutante de la derecha es más corta y estrecha que la de tipo silvestre de la izquierda, pero tiene aproximadamente la misma profundidad, siendo la glándula de tipo silvestre de 1,06 milímetros y la glándula nula de 1,02 milímetros de profundidad. Asimismo, obsérvese que las glándulas de tipo silvestre de la izquierda presentan poco tejido estromal, indicado por la tinción rosa de eosina, mientras que las glándulas nulas de la derecha parecen ser predominantemente tejido estromal. Aquí, la tinción con hematoxilina, que identifica las células nucleadas, muestra que la glándula nula mantiene su densidad, mientras que la glándula de tipo silvestre parece contener principalmente estructuras glandulares.

Para investigar más a fondo, aquí se alinearon imágenes de mayor resolución de la zona del ganglio linfático. Se observan estructuras grandes que habrían estado llenas de leche. En contraste, la glándula nula para I-G-F-B-P siete presenta pocas estructuras bien desarrolladas.

Además, estas estructuras están llenas de células similares a fibroblastos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo crear una reconstrucción tridimensional de un órgano mediante la reconstrucción de secciones seriadas de escaneo. Bien. Ahora, al intentar este procedimiento, es importante recordar nombrar de forma consistente las diapositivas y los escaneos, ya que habrá un gran número de ambos, y la organización secuencial es clave para el éxito al seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica para marcadores celulares y de enfermedad específicos, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como, ¿cómo permea la vasculatura un tumor?