Name: Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a reconstruir volúmenes histológicos tridimensionales de glándulas mamarias de ratón mediante registro de imágenes. Este método permite analizar cambios en la macroestructura celular y comparar diferencias entre tipos silvestre y mutantes.

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Los autores desean agradecer al Laboratorio de Investigación de Imágenes de Biomarcadores (BIRL) del Instituto de Investigación Sunnybrook por sus servicios de histología. El apoyo para este trabajo fue proporcionado por la Fundación Terry Fox, la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama-Prairie-NWT, así como una subvención del CIHR, #MOP-97996.

1. Espécimen <ol><li> Impuestos especiales de las glándulas mamarias quirúrgicamente de tipo salvaje CDH1 así como los ratones IGFBP7 nulo tres días publican inicio de la lactancia. </li><li> Separe las glándulas en portaobjetos de vidrio para ayudar a recuperar la morfología de la glándula mamaria nativo. </li></ol> 2. La fijación y procesamiento de tejidos <ol><li> Fijar las glándulas mamarias en neutro tamponado al 4% PFA O / N a 4 ° C. </li><li> Guarde las glándulas en etanol al 70% antes de la elaboración de tejidos. </li><li> Transferir las glándulas para pequeños casetes de procesamiento de tejidos. </li><li> Procesar los tejidos usando un procesador automatizado de tejido <ol><li> Deshidratar los tejidos en el aumento de etanol y xileno baños de etanol al 70% durante 45 minutos, 2 veces en etanol al 95% durante 45 min, 3 veces en etanol al 100% durante 1 hora y 2 veces en xileno durante 45 min. </li><li> Permear los tejidos con parafina 3 veces durante 1 hora cada uno en el vacío con la presión aplicada. </li></ol></li><li> Incrustar los tejidos en parafina para formar bloques, Para seccionar. </li></ol> 3. Histología y Blockface Imaging <ol><li> Recorte los bloques de parafina utilizando un micrótomo rotatorio hasta que se elimina el exceso de parafina. </li><li> Use una máquina de fresado vertical para perforar agujeros de 1 mm en al menos dos esquinas del bloque de parafina perpendicular a la casete. </li><li> Monte el bloque de tejido en el micrótomo rotatorio. </li><li> Establecer el sistema de formación de imágenes 19 blockface delante del microtomo. </li><li> Captura de imagen blockface óptica antes de seccionar. </li><li> Cortar las cintas de cuatro secciones a las 5 micras de espesor en el microtomo. <ol><li> Transfiera las cintas para el baño de agua fría. </li><li> Separar las segunda y cuarta secciones de la cinta y montarlos en portaobjetos de microscopio. La elección de las segunda y cuarta secciones proporciona una brecha de 5 m entre las secciones. </li><li> Amplíe cada sección en un baño de agua caliente (48 º C) para desarrugar, luego volver a montarlo en el portaobjetos de un microscopio. NOTA: CUtting, montaje, unwrinkling las secciones causan algunas distorsiones en la sección, como desgarro, doblez, la contracción y la expansión. Estos artefactos complican el registro de las secciones histológicas. </li><li> Teñir las secciones con H &amp; E utilizando una tinción automática. </li><li> Cubreobjetos las diapositivas usando un cubreobjetos automático. </li><li> Digitalizar las diapositivas usando un escáner de diapositivas histología digital en la resolución de su interés. Para este protocolo el aumento es de 20x y una resolución de 0,47 micras. </li><li> Down-muestra las imágenes de histología a la resolución de las imágenes blockface, 18 micras. </li></ol></li></ol> 4. Registro de Imágenes <ol><li> Segmentación de imagen y el punto de selección <ol><li> En blockface imágenes miden los valores de píxeles de los orificios de registro y utilizar el valor medio como un umbral fijo al segmento de los orificios de registro en las esquinas del bloque de parafina. </li><li> Dado que algunas partes adicionales también pueden ser segmentados porutilizando el umbral fijo, utilizar la circularidad y el área de los objetos segmentados para encontrar los agujeros y descartar los objetos adicionales. Para hacer esto, escriba un pequeño código y encontrar la relación de (4π x área) / (perímetro) 2 para los objetos segmentados. Esta relación de objetos redondos es de 1. </li><li> Para cada glándula mamaria, seleccionar una imagen blockface como referencia y alinear el resto de las imágenes blockface a la referencia utilizando el centro de los orificios de registro y técnicas de registro basado en la señal. </li><li> Para las imágenes blockface alineados, segmento manualmente o extraer el tejido del fondo. Utilice el objeto más importante en la máscara para el resto del protocolo. </li><li> Para H &amp; E secciones siguen los siguientes pasos para la segmentación automática. <ol><li> Utilice una técnica de umbralización Otsu 20 a las imágenes del segmento de los antecedentes y crear máscaras binarias de las imágenes de histología. </li><li> Identificar y seleccionar el objeto más importante en cada máscara utilizando la histogram de los objetos etiquetados. </li><li> Extraiga los puntos de los límites de ancho de un píxel, tanto de la histología y máscaras blockface. </li><li> Utilice el algoritmo de código de cadena 21, para representar los puntos de los límites de una secuencia de tramos lineales se ajusta. </li></ol></li></ol></li><li> Registro rígido inicial <ol><li> Utilice Fourier Descriptores algoritmo 22, para encontrar el rígido inicial transformada entre los puntos de los límites de la histología y sus imágenes blockface correspondientes. Esta inicial incluye transformar los factores de traslación, rotación y escala. </li><li> Transformar cada imagen histología con la inicial transformada obtenido de la etapa anterior. </li></ol></li><li> Refinamiento del registro rígido <ol><li> Retire las secciones altas borde curvatura del contorno histología utilizando un filtro de balanceo de la bola 23. </li><li> Seleccione 500 puntos de los puntos de los límites de histología restantes utilizando aleatoriamente distribución uniforme. </li><li> Transformar el delhistología puntos limítrofes al azar con la transformación inicial obtenida a partir de los descriptores de Fourier. </li><li> Seleccione el conjunto de blockface puntos de los límites y el uso iterativos puntos más cercanos (ICP) del algoritmo 24 para encontrar la transformación rígida entre los puntos de los límites blockface, el destino y la histología puntos limítrofes aleatorios. </li><li> Transformar las imágenes de histología alineados obtenidos de la etapa anterior y la pila de imágenes de histología alineados crea el volumen histología. </li><li> Utilice un software de visualización 3D para crear una imagen visual del volumen histología. </li></ol></li><li> Visualización de la Pila de imágenes con un aumento de 5x <ol><li> Down-muestrear las imágenes histológicas originales a 5x de aumento. </li><li> Recortar la región de interés en una de las imágenes de histología. </li><li> Calcular la ubicación de esa región en otras imágenes de histología 5x utilizando la combinación de las transformaciones rígidas de los dos pasos de registro. </li><li> Recortar la regiComplementos de interés a la misma región de tamaño en todas las demás imágenes de histología. </li><li> Finalmente refinar el alineamiento entre las regiones de forma manual. Escriba un programa que se superpone dos imágenes y permite la selección de los valores de rotación y traslación de una de las imágenes más de la otra y luego guarda la imagen transformada cuando se acepta la alineación. </li><li> Ver las pilas de las regiones de histología 5x alineados utilizando un software de visualización 3D. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

En este estudio, hemos desarrollado un flujo de trabajo de registro de imágenes para reconstruir un volumen histología en 3D a partir de imágenes de histología en 2D de serie, que no requieren puntos de referencia internos seleccionados al azar o marcadores fiduciales implantados dentro del tejido, que puedan distorsionar el tejido. Mediante el método descrito, imágenes blockface ópticos mismos se utilizan como imágenes de referencia antes de seccionar. Utilizamos orificios externos perforados en el bloque de parafina p...

IGFBP7 (la insulina como factor de crecimiento de la proteína de unión a 7) es un miembro de la familia de proteínas de unión de IGF-, y se ha demostrado que se unen al receptor de IGF1 4. Down-regulación de IGFBP7 se sabe que se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de mama 5, mientras que la reintroducción de IGFBP7 en modelos de tumores de xenoinjertos inhibe en gran medida los tumores de crecimiento 6 a través de la inducción de la apoptosis y senescencia celular 7. Con el fin de estudiar los efectos de IGFPB7, un ratón-IGFBP7 nula fue creado 5 (datos no publicados). Mientras que estos ratones no desarrollan tumores, que muestran cambios en la histología del ovario, músculo y el hígado, así como defectos en los patrones de desarrollo de la glándula mamaria (datos no publicados). El fenotipo defectuoso fue indicado por primera vez como los ratones nulos tienen camadas más pequeñas y no son capaces de sostener múltiples camadas grandes (datos no publicados). Volúmenes de histología en 3D tienen el potencial de proporcionar Informat útilion para los análisis cuantitativos y comparativos y la evaluación de los hallazgos patológicos en las imágenes médicas volumétricas. Confocal tridimensional, la microscopía de dos fotones puede proporcionar células de alta resolución información morfológica de la glándula en extensión local 14, pero tiene un campo de visión limitado y profundidad. Reconstrucción volumen Histología proporciona más información sobre un mucho mayor extensión espacial. El uso de los enfoques tradicionales se prevé cierta distorsión durante la preparación de los cortes histológicos, tales como contracción, expansión, las lágrimas, y los pliegues. Estas distorsiones hacen que sea difícil para registrar imágenes histológicas de serie en una pila 3D para reconstruir un volumen 3D. Como el número de secciones consecutivas con defectos aumenta las similitudes entre las secciones intactas se reduce y por lo tanto hace que el proceso de registro más complicado. Se han propuesto diferentes métodos para registrar las secciones histológicas y para crear un VO histología continuolume. Algunas técnicas dependen de variaciones de intensidad 8, y otros se basan en la forma de las secciones 9. Para algunas muestras de las estructuras anatómicas se pueden utilizar como puntos de referencia 10,11, junto con métodos de registro basado-hito 12,13. Pero estas estructuras internas podrían no ser detectables a través de todo el volumen y para algunos especímenes no hay estructuras anatómicas confiables pueden ser identificados. Algunos grupos han utilizado un enfoque de registro de pares y registrado histología imágenes consecutivas de uno a otro utilizando contornos o estructuras anatómicas 16-18. Registro de secciones histológicas de serie el uno al otro sin el uso de imágenes de referencia puede propagar error de registro y cambiar la forma real del volumen de la histología. Enfoque de registro por pares se basa en la consistencia de la forma de las secciones de histología y las estructuras internas a lo largo de la pila de las imágenes; por lo tanto, requiere densa de muestreo de la muestra, la cualno siempre es posible, por ejemplo, para las muestras clínicas. En este gasoducto utilizamos imágenes blockface como un conjunto de imágenes de referencia para la reconstrucción del volumen histología 19. Imágenes Blockface se toman de los bloques de parafina de tejidos después de su montaje en el microtomo y antes se corta cada sección. Por lo tanto, el daño a individuo corte secciones en serie no interfiere con el registro de las secciones de serie 8,11,15. Capturamos las imágenes blockface de una manera diferente a los otros grupos. Las imágenes de la cara del bloque óptico se obtienen mediante un objetivo telecéntrico para eliminar o minimizar el cañón y la perspectiva de la distorsión, que generalmente ocurre cuando se utilizan objetivos regulares en la óptica. Esta es una de las ventajas del enfoque propuesto sobre los otros métodos publicados, que realizan de imágenes blockface usando lentes regulares. Las imágenes son tomadas en un ángulo oblicuo de leve a utilizar la reflexión de la superficie del bloque para el aumento del contraste entre el TISSsuperficie UE y de parafina y para eliminar la sombra del tejido en profundidad, bajo la superficie de parafina. Un filtro fotográfica también se utiliza para polarizar la luz procedente de la superficie del bloque y el tejido para equilibrar el contraste 19. Para corregir para el desplazamiento del bloque en el micrótomo rotatorio, de dos a tres agujeros son perforados en las esquinas del bloque, que son fácilmente detectables en las imágenes blockface. Los centroides de estos agujeros se utilizan junto con el registro rígido basado en hito para alinear las imágenes blockface.

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% Solución de paraformaldehído</td></tr><tr><td>Casetes de procesamiento de tejidos pequeños</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 procesador de tejidos automatizado</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> S25307B <td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>Parafina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast medio de inclusión de tejido</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 centro de inclusión</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo Leica</td><td>Fresadora Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H& E stain</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic stainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp;</td><td>VWR Internacional&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 cubreobjetos de cristal</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escáner de diapositivas Leica SCN400</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>Software</td></tr><tr>de desarrollo<td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>Software de visualización 3D</td></tr></tbody></table>

reconstrucción de 3-dimensional volumen histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Reconstrucción volumen Histología facilita el estudio de la forma 3D y el cambio de volumen de un órgano a nivel de macro-estructuras formadas por células. También se puede utilizar para investigar y validar nuevas técnicas y algoritmos en imágenes médicas volumétrica y terapias. La creación de los atlas 3D de alta resolución de los diferentes órganos 1,2,3 es otra aplicación de la reconstrucción del volumen histología. Esto proporciona un recurso para la investigación de las estructuras de tejido y la relación espacial entre diferentes características celulares. Presentamos un método de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histología, que utiliza un conjunto de imágenes blockface ópticos. El volumen histología reconstruida representa una forma fiable de la muestra procesada sin error de registro post-procesamiento propagado. Los hematoxilina y eosina (H &amp; E) manchadas secciones de dos glándulas mamarias de ratón se registraron a sus imágenes blockface correspondientes utilizando puntos de los límites extraídos del edbios de la muestra en la histología y blockface imágenes. La precisión del registro se evaluó visualmente. La alineación de las macroestructuras de las glándulas mamarias también se evaluó visualmente en alta resolución. Este estudio delinea las diferentes etapas de esta tubería de registro de imágenes, que van desde la escisión de la glándula mamaria a través de volumen histología reconstrucción 3D. Mientras que las imágenes de histología 2D revelan las diferencias estructurales entre pares de secciones, el volumen de la histología en 3D proporciona la capacidad de visualizar las diferencias en la forma y el volumen de las glándulas mamarias.

Una trampa de técnicas de microscopía tradicionales es que la comprensión de un órgano a nivel microscópico se limita a un campo de visión a la vez. Incluso diapositivas &quot;en total conformidad&quot;, que ofrecen secciones enteras de diapositivas, no proporcionan información tridimensional. Con el desarrollo de la diapositiva entera, tecnologías de análisis dinámicos, nuestra capacidad de ver una sección en su totalidad se ha incrementado, sin embargo la extrapolación de las estructuras requiere volumen histología re...

Presentamos un enfoque de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histológico en 3 dimensiones (3D), que facilita el estudio de los cambios de un órgano a nivel de macroestructuras formadas por células. Utilizando este enfoque, estudiamos los cambios en 3D entre las glándulas mamarias de tipo salvaje y las glándulas mamarias nulas de Igfbp7.

Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

El objetivo general del siguiente video es presentar un enfoque de registro de imágenes para histología tridimensional y reconstrucción de volúmenes, con el fin de estudiar los cambios en la macroestructura celular de la glándula mamaria. Para ello, se extraen glándulas mamarias de ratones tres días después del inicio de la lactancia, tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones nulos para la proteína fijadora del factor de crecimiento similar a la insulina siete, IGF BP siete. A continuación, las glándulas se procesan y se incluyen en bloques de parafina para su seccionamiento.A continuación, se capturan imágenes del bloque óptico de la cara del tejido y se secciona el bloque de tejido. Se capturan imágenes de las secciones y, mediante un software personalizado, cada sección se alinea con su imagen correspondiente de la cara del bloque para reconstruir el volumen histológico de la glándula mamaria. Los datos resultantes resaltan las diferencias de tamaño entre las glándulas mutantes y de tipo silvestre.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal tridimensional doble es que proporciona información sobre un alcance espacial mucho mayor. Este método también puede utilizarse para investigar y validar técnicas y algoritmos novedosos en imágenes médicas volumétricas y terapias, así como para crear análisis tridimensionales de alta resolución de diferentes órganos. Este volumen de histología reconstruido representa una representación confiable de la muestra del proceso sin errores de registro propagados.La idea de este método surgió cuando observamos que los ratones nulos para IGF P siete tienen tamaños de camada más pequeños y son incapaces de mantener varias camadas grandes, por lo que decidimos investigar la estructura de sus glándulas mamarias. Una vez que el tejido esté incluido en parafina, utilice un micrótomo rotatorio para recortar el bloque hasta eliminar la parafina sobrante. A continuación, utilizando una fresadora vertical, taladre orificios de un milímetro en al menos dos esquinas del bloque de parafina perpendicularmente al casete y monte el bloque de tejido en el micrótomo rotatorio.A continuación, para configurar el sistema de imagen de la cara del bloque frente al micrótomo, coloque una cámara con un objetivo teleobjetivo en un ángulo ligero respecto a la superficie del bloque de tejido. La cámara debe estar conectada a una computadora situada frente al micrótomo. Luego, coloque una fuente de luz frente al bloque de manera que la cámara capture el reflejo de la luz proveniente del bloque.Ajuste el ángulo de la cámara hasta que el tejido en la superficie del bloque se distinga fácilmente de la parafina circundante. Capture una imagen óptica de la cara del bloque. Luego, utilizando el micrótomo, corte cintas de cuatro secciones, de cinco micrómetros de grosor.Transfiera las tiras a un baño de agua fría, separe las secciones de la tira y luego retire con una espátula la segunda y cuarta sección del agua fría hacia un portaobjetos. Trasládelas a un baño de agua tibia para eliminar las arrugas. Elegir la segunda y cuarta sección proporciona un espacio de cinco micrones entre las secciones.Una vez que estén desarrugadas, vuelva a montar las secciones sobre las laminillas del microscopio mediante una cucharilla. Como antes, tenga en cuenta que cortar, montar y desarrugar las secciones puede provocar algunas distorsiones, como desgarros, pliegues, contracción y expansión. Estos artefactos complican el registro de las secciones de histología.Tiña los cortes con h y d utilizando un tinción automática. Luego, cubra las laminillas utilizando un cubreobjetos automático y digitalice las laminillas con un escáner digital de histología a la resolución de interés. Para este protocolo, el aumento es de 20 x y la resolución es de 0,47 micrones.Esta sección del video ofrece una visión general del proceso de registro de imágenes, que se lleva a cabo utilizando un software personalizado desarrollado en nuestro laboratorio combinado con MATLAB c plus plus. Utilizando ITK, comience por submuestrear las imágenes de histología hasta la resolución de las imágenes de la superficie del bloque. Esto reducirá las imágenes de histología por un factor de 0,026.A continuación, para la segmentación de imágenes y la selección de puntos, abra algunas imágenes de la superficie del bloque en MATLAB y utilice la herramienta de cursor de datos para medir los valores de píxeles de los orificios de registro. Utilice el valor promedio de píxeles como umbral fijo para segmentar los orificios de registro. Para eliminar los segmentos adicionales, use la circularidad y el área de los objetos segmentados para conservar los orificios y eliminar los segmentos extra.A continuación, para cada glándula mamaria, seleccione una imagen de la superficie del bloque como referencia. Alinee los centros de los orificios de registro del resto de las imágenes de la superficie del bloque con los centros de los orificios de registro de la imagen de referencia. Luego, utilizando las transformaciones obtenidas para los orificios de registro, alinee manualmente las imágenes de la superficie del bloque y segmente o extraiga el tejido del fondo para las secciones h y d.Utilice la técnica de umbralización OSU para segmentar las imágenes del fondo y crear máscaras binarias de las imágenes de histología. A continuación, utilizando el histograma de los objetos etiquetados, identifique y seleccione el objeto más grande en cada máscara. Extraiga los puntos del contorno de un píxel de ancho de ambas máscaras, la de histología y la de la superficie del bloque.A continuación, utilice un algoritmo de descriptores de Fourier para hallar la transformación rígida inicial entre los puntos del contorno de la histología y sus correspondientes imágenes de la superficie del bloque. Esta transformación inicial incluye los factores de traslación, rotación y escala. Transforme cada imagen de histología con la transformación inicial obtenida en el paso anterior.Para perfeccionar el registro rígido, elimine las secciones de borde de alta curvatura del contorno histológico utilizando un filtro de bola rodante. A continuación, seleccione aleatoriamente 500 puntos de los puntos restantes del límite histológico utilizando una distribución uniforme. Transforme los puntos del límite histológico con la transformación inicial obtenida a partir de los descriptores de Fourier.Utilice los puntos límite del bloque facial y el algoritmo de puntos más cercanos iterativos para hallar la transformación rígida entre los puntos límite del bloque, los puntos límite faciales y la histología. Puntos límite aleatorios. Luego transforme las imágenes de histología obtenidas en el paso anterior para crear una imagen visual del volumen de histología en el software de visualización 3D.En Me vis lab, elija los módulos, seleccione archivos varios y agregue el módulo de composición 3D a partir de archivos 2D. Luego, elija imagen en el menú y agregue el módulo de conversión de propiedades de imagen. Finalmente, agregue un módulo de vista 3D desde los módulos de visualización de visores 3D.Haga doble clic en componer 3D a partir de archivos 2D para cargar las imágenes y haga clic en crear 3D. Ajuste el tamaño del vóxel haciendo doble clic en la conversión de propiedades de imagen y establezca el tamaño del vóxel como 0.018 0.018 0.01. Visualice el volumen haciendo doble clic en ver 3D.Finalmente, observe la pila de imágenes a cinco aumentos siguiendo los pasos descritos en el documento adjunto. Para caracterizar mejor el déficit del ratón nulo para I-G-F-B-P siete, se realizó la reconstrucción tridimensional de glándulas mamarias como se describe en el presente documento. Estas figuras muestran los volúmenes de histología reconstruidos de las glándulas mamarias de tipo salvaje y nulas.Téngase en cuenta que la glándula mutante de la derecha es más corta y estrecha que la de tipo silvestre de la izquierda, pero tiene aproximadamente la misma profundidad, siendo la glándula de tipo silvestre de 1,06 milímetros y la glándula nula de 1,02 milímetros de profundidad. Asimismo, obsérvese que las glándulas de tipo silvestre de la izquierda presentan poco tejido estromal, indicado por la tinción rosa de eosina, mientras que las glándulas nulas de la derecha parecen ser predominantemente tejido estromal. Aquí, la tinción con hematoxilina, que identifica las células nucleadas, muestra que la glándula nula mantiene su densidad, mientras que la glándula de tipo silvestre parece contener principalmente estructuras glandulares.Para investigar más a fondo, aquí se alinearon imágenes de mayor resolución de la zona del ganglio linfático. Se observan estructuras grandes que habrían estado llenas de leche. En contraste, la glándula nula para I-G-F-B-P siete presenta pocas estructuras bien desarrolladas.Además, estas estructuras están llenas de células similares a fibroblastos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo crear una reconstrucción tridimensional de un órgano mediante la reconstrucción de secciones seriadas de escaneo. Bien. Ahora, al intentar este procedimiento, es importante recordar nombrar de forma consistente las diapositivas y los escaneos, ya que habrá un gran número de ambos, y la organización secuencial es clave para el éxito al seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica para marcadores celulares y de enfermedad específicos, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como, ¿cómo permea la vasculatura un tumor?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.

Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.

Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

Se describe un método de inyección intraductal de reactivos para una solución ablativa a base de etanol al árbol ductal mamario de ratón para imágenes in vivo y prevención del cáncer de mama. La inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales mamarias con un daño mínimo en el tejido colateral.

Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

Aprende a reconstruir volúmenes histológicos tridimensionales de glándulas mamarias de ratón mediante registro de imágenes. Este método permite analizar cambios en la macroestructura celular y comparar diferencias entre tipos silvestre y mutantes.

Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

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