Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear la interacción de dos proteínas expresadas en hojas de tabaco intactas. Esto se logra mediante el diseño de constructos apropiados, la fusión de los dos genes de interés para dividir proteínas fluorescentes y transformar estos constructos en agrobacterias. Como segundo paso, los cultivos de agrobacterias se mezclan y se inyectan en las hojas de tabaco, lo que conduce a la expresión de las proteínas y a una señal fluorescente reconstituida.

Si las proteínas se encuentran muy próximas, a continuación, se analizan bajo el microscopio hojas enteras o protoplastos aislados. Se obtienen resultados que muestran interacciones proteína-proteínas basadas en la señal fluorescente emitida detectada por microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica de métodos existentes como la inmunoprecipitación cor o la levadura a híbrido es que la interacción proteína-proteína se puede monitorear directamente en la célula vegetal viva.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como la formación de complejos proteicos en varios compartimentos celulares. Para comenzar este procedimiento, cultive las agrobacterias que se utilizarán para la transformación de las hojas de tabaco. Inocular 10 mililitros de medio LB que contenga los antibióticos apropiados con 50 microlitros de AG L, un cultivo madre de glicerol que contenga el plásmido de interés en un tubo estéril de 50 mililitros.

Incubar a 28 grados centígrados durante al menos 24 horas, agitando a 190 RPM hasta que el cultivo alcance un OD 600 entre 1,0 y 2,0 al día siguiente. Centrifugar las bacterias a 3000 veces G durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante resus, suspenda el pellet en un medio de infiltración recién hecho y ajuste la suspensión a un OD 600 de 1.0.

Incubar las células agrobacterianas en un agitador superior durante dos horas en la oscuridad a temperatura ambiente para la infiltración de las hojas de tabaco. Elija varias hojas viejas de una planta de tabaco de tres semanas de edad. Mezcle volúmenes iguales.

Tres mililitros cada una de las agrobacterias portadoras de los constructos de interés. Llene una jeringa de cinco mililitros sin aguja con la mezcla de suspensión celular para infiltrar la suspensión celular en las hojas de tabaco. Presione con cuidado la jeringa en la parte inferior de las hojas en varios lugares, riegue las plantas y déjelas cubiertas y protegidas de la luz durante dos días.

Para aislar los protoplastos de una hoja infiltrada, primero, coloque la hoja en una placa de Petri y agregue un poco de solución enzimática recién preparada. Con una hoja de afeitar nueva, corta la hoja en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros cuadrados. A continuación, transfiera los trozos de hoja con la solución enzimática al vacío.

Matraz de infiltración. Aspire infiltrar durante aproximadamente 20 segundos hasta que emerjan burbujas de aire de las hojas. Suelte la aspiradora con mucho cuidado.

Agite el matraz durante 90 minutos a 40 RPM en la oscuridad a temperatura ambiente después de 90 minutos. Libere los protoplastos agitando durante un minuto a 90 RPM. Filtre la solución a través de una gasa en un tubo de centrífuga de fondo redondo de 15 mililitros.

Superponga la solución de protoplastos con dos mililitros de tampón FPCN y centrifugue durante 10 minutos a 70 veces G con aceleración y desaceleración lentas a temperatura ambiente. Los protoplastos intactos se acumularán en la interfaz entre la solución enzimática y la FPCN utilizando un orificio ancho: la punta de la pipeta de un mililitro transfiere los protoplastos intactos a un tubo de centrífuga nuevo. Para el éxito de este procedimiento, utilice siempre puntas de orificio blancas para evitar la ruptura de los protoplastos intactos.

Llene el tubo con una centrífuga tampón W five durante dos minutos a 100 veces G con aceleración y desaceleración lentas. Para pellet los protoplastos, retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el pellet. En aproximadamente 200 microlitros de W cinco tampones, dependiendo de la cantidad de protoplastos.

Para preparar una muestra de protoplastos para microscopía de barrido láser, primero se colocan dos pequeñas tiras de sellador a unos dos centímetros de distancia en un portaobjetos de microscopio. Coloque 20 microlitros de la solución de protoplastos entre las tiras y coloque con cuidado un cubreobjetos encima. Las tiras de sellador evitarán que los protoplastos sean aplastados por el cubreobjetos.

Para preparar una muestra total de hojas para la microscopía de escaneo láser, corte un trozo de un centímetro de la hoja y colóquelo en un portaobjetos de microscopio con la parte inferior de la hoja hacia arriba. Agrega aproximadamente 30 microlitros de agua. Coloque un cubreobjetos encima y fíjelo firmemente con cinta adhesiva en ambos lados.

Las imágenes se realizan con un microscopio de barrido láser confocal de MICCA tipo TCS SP five para aumento. Utilice una lente objetivo con una magnitud de 63 x con glicerol como medio de imagen, utilice el software fluorescente avanzado del conjunto de aplicaciones Leica para la evaluación. Configure el láser Argonne al 30% y la potencia del láser a 488 nanómetros a una intensidad del 18%Para monitorear la señal a 515 nanómetros, establezca el primer ancho de banda de emisión del detector PMT de 495 a 550 nanómetros.

Para monitorizar la autofluorescencia de la clorofila. Establezca un segundo ancho de banda de emisión del detector PMT de 650 a 705 nanómetros. Para monitorizar la señal de cereza M, utilice el láser HENI 5 61.

Establezca la intensidad del láser al 18% y un tercer ancho de banda de emisión del detector PMT de 587 a 610 nanómetros. Asegúrese de que las imágenes de todos los canales del detector PMT se tomen con los mismos ajustes de ganancia. La ganancia debe estar entre 800 y 900 para excluir las señales de fondo.

Adquiera imágenes en este formato, ancho y alto de 1024 por 1024 píxeles con una velocidad de escaneo de 100 hercios. Para los apilamientos Z, utilice una distancia máxima de 0,5 micras entre cada pila. En este estudio, se utilizó el método BFC para monitorear la interacción de la chaperona molecular citosólica HSP 90 con las proteínas de acoplamiento de membrana TPR siete y a 64.

Como se muestra en este esquema, Venus está acoplado a la parte citosólica de TPR siete, que reside en el retículo endoplásmico, o a 64, que reside en la envoltura exterior del cloroplasto. Hs.P 90 es N fusionado terminalmente a SCFP permitiendo la interacción de los dominios TPR de talk 64 y TPR seven Con el HSP 90 C, Terminus, SCFP solo se expresa en el citosol como un control negativo para verificar la localización del complejo proteico TPR 7 HS P 90. El TPR 7 y el SA P 90 se transformaron conjuntamente con un marcador RE.

La fluorescencia se monitoreó en hojas intactas como control. El SCFP solo se expresó junto con la TPR siete y el marcador RE. En todas las imágenes mostradas, la barra de escala representa 10 micras.

Los paneles de la izquierda muestran fluorescencia reconstituida en verde monitoreada a 515 nanómetros. El marcador ER aparece en rojo. En los paneles centrales, la superposición de ambas señales se muestra en los paneles derechos.

Se supervisó una señal reconstituida para TPR siete junto con HS P 90 superpuesta con el marcador ER que aparecía en amarillo. Por el contrario, no se monitorizó ninguna señal para la TPR siete y el control negativo como CFP. En el siguiente ejemplo, la proteína del cloroplasto tox 64 se coexpresó con HS P 90 como control.

Tox 64 se coexpresó con SCFP solo. Al igual que antes, la fluorescencia reconstituida en verde se monitoreó a 515 nanómetros. Los paneles centrales muestran la autofluorescencia de la clorofila monitoreada a 480 nanómetros.

En rojo se muestra la superposición de ambas señales en los paneles derechos. Se observó fluorescencia reconstituida en las células coex que expresan tox 64 y HSP 90, pero no en las células. Coex que expresa tox 64 y SCFP solos.

Dado que la localización exacta de tox 64 y HSP 90 es difícil de determinar en imágenes microscópicas de las hojas enteras. Los protoplastos se aislaron de hojas de tabaco infiltradas para microscopía de fluorescencia. Al igual que antes, la fluorescencia reconstituida se monitoreó a 515 nanómetros, la autofluorescencia de clorofila se monitoreó a 480 nanómetros y se crearon imágenes superpuestas como se muestra en esta imagen superpuesta a 64 y HSP 90 se pueden detectar como estructuras en forma de anillo que rodean el cloroplasto apagado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar sus construcciones, transformar hojas de tabaco y cómo visualizar mejor la señal fluorescente que muestra la interacción de sus dos proteínas de interés.