Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear la interacción de dos proteínas expresadas en hojas intactas de tabaco. Esto se logra diseñando constructos apropiados, fusionando los dos genes de interés con proteínas fluorescentes divididas y transformando estos constructos en bacterias agrobacterianas. Como segundo paso, se mezclan cultivos de bacterias agrobacterianas y se inyectan en hojas de tabaco, lo que conduce a la expresión de las proteínas y a una señal fluorescente reconstruida.

Si las proteínas entran en proximidad cercana, a continuación, se analizan ya sea hojas completas o protoplastos aislados mediante microscopía. Se obtienen resultados que muestran interacciones entre proteínas basadas en la señal fluorescente emitida, detectada por microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la coinmunoprecipitación o el sistema levadura de doble híbrido es que la interacción entre proteínas puede monitorearse directamente en la célula vegetal viva.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como la formación de complejos proteicos en diversos compartimentos celulares. Para comenzar este procedimiento, cultive las bacterias agrobacterianas que se utilizarán para la transformación de las hojas de tabaco. Inocule 10 mililitros de medio LB que contenga los antibióticos apropiados con 50 microlitros del cultivo stock de glicerol AG L uno que contenga el plásmido de interés en un tubo estéril de 50 mililitros.

Incubar a 28 grados Celsius durante al menos 24 horas, agitando a 190 RPM hasta que el cultivo alcance una DO 600 entre 1,0 y 2,0 al día siguiente. Centrifugar las bacterias a 3000 ×g durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante resus, suspender el sedimento en medio de infiltración recién preparado y ajustar la suspensión a una DO 600 de 1,0.

Incube las células de bacterias agrobacterianas en un agitador rotatorio durante dos horas a temperatura ambiente y en la oscuridad para la infiltración de hojas de tabaco. Seleccione varias hojas más viejas de una planta de tabaco de tres semanas de edad. Mezcle volúmenes iguales.

Tres mililitros de cada una de las bacterias agrobacterias que portan los constructos de interés. Llene una jeringa de cinco mililitros sin aguja con la mezcla de suspensión celular para infiltrar la suspensión en las hojas de tabaco. Presione cuidadosamente la jeringa en la cara inferior de las hojas en varios puntos, riegue las plantas y déjelas cubiertas y protegidas de la luz durante dos días.

Para aislar protoplastos de una hoja infiltrada, primero coloque la hoja en una placa de Petri y agregue algo de solución enzimática recién preparada. Usando una cuchilla de afeitar nueva, corte la hoja en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros cuadrados. A continuación, transfiera los trozos de hoja junto con la solución enzimática a un vacío.

Matraz de infiltración. Realice la infiltración al vacío durante aproximadamente 20 segundos hasta que emerjan burbujas de aire de las hojas. Libere el vacío con mucha precaución.

Agite el matraz durante 90 minutos a 40 RPM en la oscuridad y a temperatura ambiente después de 90 minutos. Libere los protoplastos agitando durante un minuto a 90 RPM. Filtre la solución a través de gasa hacia un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros de fondo redondo.

Cubra la solución de protoplastos con dos mililitros de tampón FPCN y centrifugue durante 10 minutos a 70 ×g con aceleración y desaceleración lentas a temperatura ambiente. Los protoplastos intactos se acumularán en la interfase entre la solución enzimática y el FPCN; utilizando una punta de pipeta de un mililitro con orificio ancho, transfiera los protoplastos intactos a un tubo cónico nuevo. Para el éxito de este procedimiento, utilice siempre puntas con orificio blanco para evitar la ruptura de los protoplastos intactos.

Llene el tubo con tampón W cinco y centrifugue durante dos minutos a 100 × g con aceleración y desaceleración lentas. Para pelotar los protoplastos, retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el precipitado en aproximadamente 200 µL de tampón W cinco, dependiendo de la cantidad de protoplastos.

Para preparar una muestra de protoplastos para microscopía de barrido láser, coloque primero dos tiras pequeñas de sellador a unos dos centímetros de distancia sobre un portaobjetos. Coloque 20 microlitros de la solución de protoplastos entre las tiras y coloque cuidadosamente un cubreobjetos encima. Las tiras de sellador evitarán que los protoplastos sean aplastados por el cubreobjetos.

Para preparar una muestra total de hoja para microscopía de barrido láser, corte un trozo de un centímetro de la hoja y colóquelo sobre un portaobjetos con la cara inferior de la hoja orientada hacia arriba. Añada aproximadamente 30 microlitros de agua. Coloque un cubreobjetos encima y fíjelo firmemente con cinta adhesiva en ambos lados.

La imagen se obtiene con un microscopio confocal de barrido láser del tipo MICCA TCS SP cinco para la ampliación. Utilice una lente objetivo con una magnificación de 63x y glicerol como medio de observación, y emplee el software avanzado de fluorescencia de la suite de aplicaciones de Leica para la evaluación. Ajuste el láser de argón al 30 % y la potencia del láser a 488 nanómetros a una intensidad del 18 %. Para monitorear la señal a 515 nanómetros, configure el ancho de banda de emisión del primer detector PMT desde 495 hasta 550 nanómetros.

Para monitorear la autofluorescencia de clorofila, configure un segundo ancho de banda de emisión del detector PMT desde 650 hasta 705 nanómetros. Para monitorear la señal M cherry, utilice el láser HENI 5 61.

Establezca la intensidad del láser al 18 % y un ancho de banda de emisión de un tercer detector PMT desde 587 hasta 610 nanómetros. Asegúrese de que las imágenes de todos los canales del detector PMT se tomen con la misma configuración de ganancia. La ganancia debe estar entre 800 y 900 para excluir las señales de fondo.

Adquiera imágenes en este formato, con un ancho y alto de 1024 por 1024 píxeles y una velocidad de escaneo de 100 hercios. Para las acumulaciones en Z, utilice una distancia máxima de 0,5 micrómetros entre cada capa. En este estudio, se utilizó el método BFC para monitorear la interacción de la chaperona molecular citosólica HSP 90 con las proteínas de anclaje a la membrana TPR siete y a 64.

Como se muestra en este esquema, Venus está acoplado a la parte citosólica de TPR siete, que se localiza en el retículo endoplásmico, o a 64, que reside en la envoltura externa del cloroplasto. Hs.P 90 está fusionado en su extremo N-terminal a SCFP, lo que permite la interacción de los dominios TPR de talk 64 y TPR siete con el extremo C-terminal de HSP 90. SCFP solo se expresa en el citosol como control negativo para verificar la localización del complejo proteico TPR siete-HS P 90. TPR siete y HS P 90 se codtransformaron con un marcador del retículo endoplásmico.

Se monitoreó la fluorescencia en hojas intactas como control. Se expresó únicamente SCFP junto con TPR siete y el marcador del RE. En todas las imágenes mostradas, la barra de escala representa 10 micrones.

Los paneles de la izquierda muestran la fluorescencia reconstituida en verde, monitorizada a 515 nanómetros. El marcador del RE aparece en rojo. En los paneles centrales se muestra la superposición de ambas señales, que se observa en los paneles de la derecha.

Se monitoreó una señal reconstruida para TPR siete junto con HS P 90, que se solapaba con el marcador del RE que aparece en amarillo. En contraste, no se detectó señal para TPR siete ni para el control negativo como CFP. En el siguiente ejemplo, la proteína del cloroplasto tox 64 se coexpresó con HS P 90 como control.

Tox 64 se coexpresó con SCFP solo. Como antes, se monitoreó la fluorescencia reconstituida en verde a 515 nanómetros. Los paneles centrales muestran la autofluorescencia de clorofila monitoreada a 480 nanómetros.

En superposición roja de ambas señales se muestra en los paneles derechos. Se observó fluorescencia reconstituida en células que coexpresan tox 64 y HSP 90, pero no en células que coexpresan tox 64 y SCFP solamente.

Dado que la localización exacta de tox 64 y HSP 90 es difícil de determinar en imágenes microscópicas de hojas completas, se aislaron protoplastos de hojas de tabaco infiltradas para la microscopía de fluorescencia. Como antes, se monitoreó la fluorescencia reconstituida a 515 nanómetros, la autofluorescencia de clorofila se monitoreó a 480 nanómetros y se crearon imágenes superpuestas como se muestra en esta imagen superpuesta, en la que tox 64 y HSP 90 pueden detectarse como estructuras en forma de anillo que rodean el cloroplasto Off.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar sus constructos, transformar hojas de tabaco y cómo visualizar mejor la señal fluorescente que muestra la interacción entre sus dos proteínas de interés.