Name: Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprende a medir el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra mediante microscopía confocal y análisis citofluorométrico. Este protocolo permite la detección cualitativa y cuantitativa de especies reactivas de oxígeno en tejidos completos y células individuales.

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Support en el laboratorio de Massimo Santoro proviene de HFSP, Marie Curie Action, Telethon y AIRC. Agradecemos a Dafne Gays y Emiliano Panieri por la lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de Instrumentos y Working Solutions <ol><li> Preparar la solución de agua los peces. Hacer una solución madre disolviendo 2 g de sales marinas &#39;Instantánea Océano&#39; en 50 ml de agua destilada. Añadir 1,5 ml de existencias de peces de agua a 1 l de agua destilada para preparar listo para utilizar peces de agua (sales marinas 60 microgramos / ml concentración final). Autoclave listo para el uso del agua de pescado antes de su uso. Esta solución se utiliza como medio de embrión de pez cebra. </li><li> Preparar metilcelulosa para montaje embrión. Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 50 ml de agua estéril peces. Facilitar la disolución mediante el uso de un imán en una placa de agitación. La disolución completa del polvo puede requerir varias horas. Revise la solución para la claridad y la alícuota en pequeños tubos. Almacenar a -20 ° C durante meses y descongelar alícuotas a su uso. Centrifugar la metilcelulosa a 950 xg durante 5 min antes de usar. Evite los ciclos de congelación y descongelación de alícuotas. </li><li> Preparar 50 ml de tricaína / acetato de 3-aminobenzoato msal de etanosulfonato (solución madre) por disolución de 200 mg de tricaína en 100 ml de agua y ajustar el pH a 7,0 usando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde esta población a 4 º C durante no más de 30 días. PRECAUCIÓN: tricaína es tóxico. Use de acuerdo con las pautas de manejo apropiadas. </li><li> La inducción de estrés oxidativo en embriones de pez cebra <ol><li> Preparar una solución oxidante por medicamentos genéricos de inducción de estrés oxidativo: Hacer 50 ml de solución oxidante mediante la adición de H 2 O 2 solución madre (peróxido de hidrógeno; 100 mM) al agua los peces. Utilice H 2 O 2 de una concentración final entre 2 mM y 100 mM. Preparar esta solución poco antes de su uso. La solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. No guarde esta solución. PRECAUCIÓN: H 2 O 2 es peligroso y nocivo por inhalación y por ingestión. El contacto con material combustible puede causar fuego. Manipular bajo una campana de humos y desgaste pers apropiadasequipo de protección onal. </li><li> Preparar una solución oxidante para las mitocondrias derivadas del estrés oxidativo por inducción: Haga una solución de oxidante (5 mM) por disolución de 3,9 mg de rotenona en 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad. <ol><li> Disolver la rotenona solución madre a 10 ml de agua de pescado para hacer una solución lista para usar. Utilice rotenona a una concentración entre 5-50 mM. No utilice rotenona a concentraciones superiores a 100 mM. A concentraciones apropiadas, esta solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. PRECAUCIÓN: La rotenona es tóxico y peligroso. Proceder conforme consejos de prudencia apropiados. </li></ol></li><li> Inducir el estrés oxidativo al gen knock-down: Knock-down expresión génica nrf2a en embriones de pez cebra mediante microinyección morfolino como se informó anteriormente por Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Inducir oxidAtive estrés después de daño tisular: generar un margen de la herida en la aleta de la cola de embriones de pez cebra a las 72 HPF como se ha descrito previamente por Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Preparar 5 ml de solución de ROS-detección de una sola célula método ROS-detección: <ol><li> Solución para la detección de ROS en general: Disolver la sonda molecular de ROS-sensible genérico en HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM). Esta solución debe prepararse poco antes de su uso. </li><li> Solución para la detección específica de ROS inducida por las mitocondrias: Poco antes de su utilización, se disuelven una sonda ROS-sensible mitocondrial con DMSO hacer una solución madre 5 mM. Disolver solución madre en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM). NOTA: Evite la luz y el oxígeno de la exposición de las soluciones de trabajo ROS-detección y sus respectivas soluciones madre. Evite que el tubo de la luz mediante el uso deuna lámina de aluminio. No almacene o reutilización sondas disueltos en HBSS. Guarde las soluciones madre a -20 ° C durante un mes. PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares y DMSO bajo una campana de humos de acuerdo con las directrices pertinentes. </li></ol></li><li> Preparar 5 ml de solución de ROS-detección para la totalidad del método de montaje de ROS-detección: Disolver la solución de la sonda de stock de ROS-sensible genérico (estabilizado en DMSO) en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-5 M). Evite la luz y la exposición al oxígeno. Evite que el tubo de la luz. Preparar esta solución antes de su uso. No almacene o volver a utilizar esta solución. PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares bajo una campana de extracción de acuerdo con las directrices pertinentes. </li><li> Hacer 25 ml de solución de parada mediante la adición de 10 ml de suero fetal bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenga solución estéril. Almacenar esta solución a 4 ° C. Se requiere esta solución sólo para una sola célula - método de detección de ROS. </li><li> Ajustar la incubadora de aire de pez cebra a 28 y# 176; C. </li><li> Establecer la centrífuga a 4 ° C para el método de ROS-detección de una sola célula. </li></ol> 2. El apareamiento de peces adultos y selección de embriones de pez cebra <ol><li> Set-up de adultos par pez cebra cruza acuerdo con protocolos estándar 40. Seleccione la línea transgénica apropiada de acuerdo con las necesidades experimentales específicas. </li><li> Recoger los huevos y colocarlos en un plato de 90 mm con medio de los peces de agua / embrión. Mantenga los huevos a 28 ° C hasta que los embriones se desarrollan y crecen a la etapa deseada del desarrollo (por ejemplo, 48 HPF, 72 HPF; HPF: horas después de la fecundación). </li><li> Pantalla para el desarrollo de los embriones. Excluir todos los óvulos no fertilizados o embriones subdesarrollados. </li><li> Anestesie embriones mediante la adición de 1 ml de tricaína (solución madre) en 50 ml de agua los peces. </li><li> Seleccionar embriones fluorescentes Tg bajo un microscopio estereoscópico. </li></ol> 3. Tratamiento de los embriones con el agente oxidante <ol><li> Utilice por lo menos 30 embriones entre las 48 hpf y 72 HPF por diferentes condiciones. Lavar dos veces con embriones de peces de agua dulce para eliminar tricaína. </li><li> Dividir embriones fluorescentes en tres platos. No coloque más de 30 embriones / plato. </li><li> Retire la solución de lavado y añadir 10 ml de la solución oxidante o 10 ml de agua de pescado como solución de control. </li><li> Incubar los embriones durante 10 min a 1 hora a 28 ° C. El período de incubación depende por el nivel de estrés oxidativo a ser inducida en tejidos específicos. Los períodos cortos son los mejores como las células afectadas por el estrés oxidativo sufren progresivamente la muerte celular. </li><li> Transferencia de embriones en un nuevo plato que contiene HBSS y embriones de lavado por agitación. Pre-HBSS caliente a 28 ° C. </li></ol> 4. Toda Método de detección de Mount ROS <ol><li> Recoger los embriones después del tratamiento oxidante y poner no más de 10 embriones en un pequeño tubo. Enjuague con HBSS tanto como sea posible. Evite que el tubo de la luz utilizando papel de aluminio. </li><li> Añadir 1 ml de solución de ROS-detección paracada tubo. </li><li> Incubar los embriones en la oscuridad durante 15 min a 28 ° C para evitar la exposición a la luz. </li><li> Durante el tiempo de incubación preparar un portaobjetos de vidrio para el análisis de embriones conjunto. Ponga 300 l de metilcelulosa en una &quot;depresión&quot; portaobjetos de vidrio y lo extendió sobre la superficie de cristal con una punta de pipeta. Evitar burbujas mientras que la liberación de la metilcelulosa. </li><li> Al final del tiempo de incubación, retirar inmediatamente la solución de ROS-detección y lavar dos veces con 2 ml de HBSS. Lavar embriones invirtiendo el tubo varias veces. No pipetear o vórtice. </li><li> Embriones Aspirar hasta en una pipeta Pasteur de vidrio. Posición embriones cerca de la abertura de la pipeta y suavemente les expulsan a la metilcelulosa. Orientar los embriones apropiadamente con una línea de nylon fino. </li><li> Comparar la fluorescencia del control de los embriones con embriones tratados. Alternativamente, fijar los parámetros del microscopio estereoscópico de fluorescencia o un microscopio confocal de modo que todos los embriones son imágenes utilizando el mismola configuración de imagen. </li></ol> 5. Single Cell Método de detección de ROS <ol><li> Comience desde el paso: 3.5. Asegúrese de tener al menos 35 embriones para cada condición. </li><li> Transferencia de embriones en un nuevo plato. Eliminar el agua los peces tanto como sea posible. Añadir 10 ml de helado de PBS 1x y 400 l de inhibidores de la proteasa Cocktail. Dechorionate manualmente embriones con unas pinzas y quite el saco vitelino con una aguja fina. Nota: Al eliminar el saco vitelino asegura muestras limpias para el siguiente análisis FACS. Este paso se puede evitar de acuerdo con instrumento de FACS. </li><li> Transferencia de embriones de-yema en un 24 y placa de múltiples pocillos (15 embriones / pocillo) y retire toda el agua los peces. </li><li> Añadir 300 l de HBSS, 30 l colagenasa P, 50 l de tripsina-EDTA en cada pocillo. </li><li> Homogeneizar embriones pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de punta estrecha (1.000 l). </li><li> Incubar a 28 ° C durante 20 min y homogeneizar las muestras mediante pipeteo cada 5 min. </li><li> Compruebe DISR tejidouption observando una alícuota del homogeneizado en el microscopio compuesto. Facilitar la suspensión de células individuales con la pipeta. No incubar embriones durante más de 30 min. </li><li> Detener la reacción añadiendo 200 l de solución de parada. Mezclar suavemente con la pipeta. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de pre-refrigerada con la parte inferior apretado. Mantener el tubo en hielo y evitar exposición a la luz. </li><li> Se centrifuga durante 5 minutos a 250 xga 4 º C. </li><li> Retire la fase superior y volver a suspender las células con el hielo frío HBSS pipeteando suavemente. </li><li> Contar las células y asegúrese de que tiene el mismo número de células en cada una de sus muestras. No utilice a menos de 2 x 10 6 células. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 250 x g a 4 ° C. </li><li> Extraer el sobrenadante y suspender el sedimento con 1 ml de hielo enfriado HBSS que contenía la sonda de ROS-sensible. </li><li> Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 3 min en la oscuridad. Variar tiempo de incubación de acuerdo con el nivel de estrés oxidativo y para tque la sensibilidad de la sonda. </li><li> Transferir las células a un tubo de FACS. Mantener los tubos en hielo y evitar exposición a la luz antes del análisis FACS. </li><li> Clasificar células con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Longitudes de onda fijada de conformidad con Tg fluorescencia tejido (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias) y los espectros de excitación / emisión de la sonda molecular utilizada para la detección de ROS (por ejemplo, las sondas de ROS mitocondriales sensibles específicos, sondas ROS-sensibles genéricos). </li><li> Para cada condición, medir todas las muestras dentro de la misma sesión de análisis, aplicando los mismos parámetros de FACS. Calcular el porcentaje de células fluorescentes como la media de los diferentes biológicos repeticiones. Analizar al menos dos réplicas para cada condición. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos El procedimiento para la detección de estrés oxidativo en embriones de pez cebra en el presente documento se describen comprende dos métodos diferentes. Todo el método de montaje de ROS-detección es principalmente un ensayo cualitativo para la detección de ROS-, mientras que el método de detección de ROS celular única permite mediciones cuantitativas más específicos (Figura 1). Ambos métodos ofrecen una forma rápida y fácil de evaluar vivo ROS-detección...

El estrés oxidativo se define específicamente como una condición que resulta de un estado redox celular desequilibrada. Las complejas reacciones redox que ocurren de manera rutinaria dentro de las células determinan el estado redox celular. Las reacciones redox consisten en todas las reacciones químicas que consisten en la transferencia de electrones entre los átomos de las moléculas biológicas que producen la reducción y la oxidación de moléculas (es decir, reacciones redox). Estas reacciones son catalizadas por especies electrónicamente activadas (es decir, especies pro-oxidantes), que se caracterizan por una inestabilidad estructural extrema y la activación espontánea de electrones desequilibradas que intercambian con biomoléculas vecinos. Estas reacciones irregulares resultan en daño en el ADN, carboxilación de proteínas, y la oxidación de lípidos, y finalmente conducen a la muerte celular 1. Aumento de los niveles de estrés oxidativo se han asociado con el envejecimiento y la progresión de diversos estados patológicos 2. El estrés oxidativo tieneha informado que es responsable de alteraciones vasculares en la diabetes y enfermedades cardiovasculares 3,4. También juega un papel crítico en la degeneración neuronal en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson 5. Además, el estrés oxidativo se ha demostrado como un factor crítico en el gobierno de la progresión del cáncer y los acontecimientos metastásicos 6,7. Además, las respuestas inmunes y la inflamación pueden provocar y el estrés oxidativo más apoyo 8. En las células vivas, las especies pro-oxidativos derivan de oxígeno (ROS, especies reactivas de oxígeno) o nitrógeno (RNS, especies reactivas de nitrógeno). ROS incluyen el radical hidroxilo, el anión superóxido (OH). (O 2 -) y el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). El principal RNS es el óxido nitroso (NO.). Una serie de especies reactivas secundarias puede ser generada por interacciones espontáneas between de ROS y RNS o metales libres iones 9. Por ejemplo, el anión superóxido reacciona con el óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), mientras que H 2 O 2 reaccionar con Fe 2 + genera radicales hidroxilo. ROS y RNS, debido a su capacidad para reaccionar con varios biomoléculas, se consideran una amenaza peligrosa para el mantenimiento del estado redox fisiológica 10. Para mantener las células estado redox están equipadas con una serie de desintoxicación de moléculas anti-oxidantes y enzimas. La superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutatión peroxidasa y peroxirredoxinas constituye esencialmente el antioxidante enzimático-arsenal que proporciona protección celular a partir de especies pro-oxidantes incluyendo H 2 O 2, OH y OONO -. 11. También moléculas antioxidantes como la vitamina C y E, polifenoles y CoenzymeQ10 (CoQ10) son de importancia crítica para saciar ROS y su peligrosa derivatives 12,13. Sin embargo, una producción excesiva de ROS y RNS, o una disfunción en el sistema anti-oxidante, cambia el estado redox celular hacia el estrés oxidativo 14. Además de su connotación negativa, ROS puede desempeñar diversas funciones fisiológicas en células de origen diferente. Las células normalmente producen ROS como moléculas de señalización para mediar acontecimientos biológicos normales, tales como la defensa del huésped y la reparación de heridas 15-17. Normalmente las especies reactivas se producen en las células por las enzimas intracelulares tales como NOx (NADPH oxidasa) y XO (xantina oxidasa) en respuesta a factores de señalización, factores de crecimiento, y las fluctuaciones de los niveles de calcio intracelulares de 18,19. Se ha informado de que las ROS puede diferencialmente modular la actividad de los factores nucleares importantes tales como p53 o componentes celulares, tales como la ATM-quinasa, un regulador maestro de la respuesta al daño del ADN 20. Análogamente ROS influyen fuertemente en la señalización celular por mediación ªe oxidación e inactivación de proteína tirosina fosfatasas (PTP), que se establecen como reguladores críticos de la transducción de la señal 21. Por otra parte, las metodologías proteómicas basadas demuestran que RNS también son responsables de modificaciones y alteraciones de señalización molecular de proteínas específicas. RNS reaccionan con los grupos tiol de cisteína modificadores de ellos en S-nitrothiols (SNO) y desencadenantes vías moleculares concomitantes con estados patológicos tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunes 22,23. Desde los experimentos de cultivo de células se reproducen sólo parcialmente la multitud de factores que actúan in vivo, es de gran interés para llevar a cabo estudios redox en modelos animales 24,25. Para lograr esto, el pez cebra se ha considerado un modelo animal vertebrado adecuado para estudiar la dinámica de estrés oxidativo 26. El pez cebra es un nuevo modelo de sistema que otorga una serie de ventajas para el estudio de los eventos celulares y genéticos durante dev vertebradoselopment y la enfermedad. Grandes agrupaciones de embriones pueden ser generados y disponibles semanal para las necesidades experimentales. Además, la claridad óptica extraordinaria de embriones de pez cebra, así como su pequeño tamaño, permite imágenes de células única y el seguimiento dinámico en toda una organismos 27. En la última década, un número considerable de pez cebra mutantes se han generado para modelar las condiciones patológicas humanas, tales como el cáncer y enfermedades genéticas 28-31. Lo más importante, una multitud de líneas transgénicas ha sido producido para permitir amplias posibilidades de manipulaciones genéticas y biológicas 32. Por ejemplo, las líneas de pez cebra en tejidos específicos de transgénicos son utilizados regularmente por los estudios in vivo. Estas líneas expresan una proteína fluorescente bajo el control de un promotor seleccionado, ofreciendo la capacidad de identificar células individuales in vivo, así como la estructura anatómica que comprenden. Varios estudios toxicológicos ya han utilizado tque el pez cebra para evaluar el efecto in vivo de los productos químicos sobre la homeostasis redox, lo que sugiere la idoneidad de este vertebrado como un modelo animal para el campo del descubrimiento de fármacos y el estrés oxidativo 33-35. A pesar de que algunas sondas fluorescentes se han probado para controlar el estrés oxidativo en larvas de pez cebra 36,37, no hay ensayos establecidos para detectar y medir los niveles de estrés oxidativo en los tejidos del pez cebra y las células vivas. Aquí se describe un procedimiento para la cuantificación in vivo de estrés oxidativo en las células de embriones de pez cebra que viven. Herramientas de diagnóstico por imágenes, la separación FACS, sondas fluorescentes y las condiciones pro-oxidativos se combinan para generar un simple ensayo para la detección y cuantificación de especies oxidativas en los embriones y tejidos de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>NO ALMACENAR DILUICIONES</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Mezcla de sal marina</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Csonda genérica sensible a las ROS: CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Sonda sensible a las ROS específica de las mitocondrias: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>disuelve un vial con 13 &mu; l de DMSO</td></tr><tr><td>Hidroetidina</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Prepare 5 mM solución madre en DMSO.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-Bencil-7-(2-benzoxazolil)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirimidina</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>disuelve el polvo en DMSO; diluito en agua de pescado</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio&nbsp;</td><td>Sondas moleculares (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomicina D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Sondas moleculares (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>Colagenasa P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Disuelva el polvo a 100 mg/ml en HBSS estéril. Almacene las alícuotas a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel Completo de Inhibidores de la Proteasa Comprimidos</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Disolver un comprimido en 1 ml de agua</td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (10x), rojo sin fenol</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Prepare 1x solución de trabajo antes de usar</td></tr><tr><td>Microscopio compuesto&nbsp;</td><td>Microscopio</td> estereoscópico ZEISS <td></td><td></td></tr><tr><td>con iluminación fluorescente</td> Cámara <td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>para la adquisición de imágenes de fluorescencia</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células activadas por fluorescencia</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td>Tubos Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>Placa Multipocillo&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri esterilizadas, no tratadas 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden causar un cambio de estado redox celular hacia condiciones de estrés oxidativo. Esta situación provoca la oxidación de moléculas (lípidos, ADN, proteínas) y conduce a la muerte celular. El estrés oxidativo también afecta a la progresión de varias condiciones patológicas tales como la diabetes, retinopatías, la neurodegeneración, y el cáncer. Por lo tanto, es importante definir herramientas para investigar las condiciones de estrés oxidativo no sólo a nivel de células individuales, sino también en el contexto de organismos enteros. En este sentido, consideramos que el embrión de pez cebra como un útil sistema vivo en llevar a cabo este tipo de estudios y presentar un protocolo para medir in vivo de estrés oxidativo. Aprovechando fluorescentes sondas ROS y líneas fluorescentes transgénicos de pez cebra, se desarrollan dos métodos diferentes de medir el estrés oxidativo in vivo: i) un &quot;todo embrión método ROS-detección&quot; para la medición cualitativa de estrés oxidativo y ii) una &quot;una sola célula método de detección de ROS &quot;para mediciones cuantitativas de estrés oxidativo. En este documento, se demuestra la eficacia de estos procedimientos, aumentando el estrés oxidativo en los tejidos por agentes oxidantes y métodos fisiológicos o genéticos. Este protocolo se presta para pantallas adelante genéticos y ayudará relaciones dirección de causa-efecto de ROS en modelos animales de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, tales como trastornos neurológicos y cáncer.

Al aplicar el método aquí descrito, se puede medir fácilmente y detectar el estrés oxidativo (y los niveles de ROS) en tejidos de embriones de pez cebra. Después de cruzar el pez cebra adultos, se recogen los huevos y se dejan desarrollar a 28 ° C a 72 h después de la fertilización (HPF). Con el fin de inducir el estrés oxidativo, se proponen dos enfoques diferentes: 1) el tratamiento de los embriones con fuertes reactivos pro-oxidantes o 2) la promoción de la formación de ROS después de la lesión tisular. <p class=...

Aquí presentamos un protocolo para medir el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra. Este procedimiento permite la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) tanto en tejidos embrionarios completos como en poblaciones unicelulares. Este protocolo llevará a cabo análisis cualitativos y cuantitativos.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir cualitativa y cuantitativamente el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra. Esto se logra añadiendo una solución oxidante a embriones preparados para inducir estrés oxidativo, o creando un margen de herida en la aleta caudal del embrión. Luego, los embriones se procesan para la detección de estrés oxidativo mediante un método de célula individual o mediante un método de montaje completo.A continuación, las preparaciones se incuban con una sonda detectora de Ross. Los resultados pueden mostrar la cantidad de estrés oxidativo y el nivel de Ross mediante microscopía confocal de montajes completos o análisis citofluorométrico de células individuales. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunofluorescencia para marcadores de estrés oxidativo es que permite la detección directa en el contexto de un organismo vivo y la cuantificación a nivel de tejidos individuales.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación básica, como explorar condiciones de estrés oxidativo en el contexto de un estado patológico. Las personas nuevas en el procedimiento pueden tener dificultades debido a daños tisulares accidentales, ya que las sondas moleculares crudas y sensibles pueden ser una fuente no planificada de acidez. Y dado que niveles elevados de estrés oxidativo deben provocar la muerte celular, mientras que niveles muy bajos pueden ser difíciles de detectar con la práctica y la experimentación, estos problemas solo se manifestarán al preparar la solución para inducir estrés oxidativo en las mitocondrias compuesta de rotenona en DMSO, la cual debe prepararse con un stock de rotenona a una concentración entre cinco y 50 micromolar, y nunca por encima de 100 micromolar, ya que la rotenona es tóxica y peligrosa.Tenga en cuenta las precauciones indicadas. La solución de sonda para la detección de agujeros en Mount Ross no debe exponerse a luz ni oxígeno durante su preparación, y debe prepararse fresca para el método de detección de Ross en célula individual. Se debe preparar una solución de parada de FBS en PBS y mantenerse a cuatro grados Celsius.Otros preparativos incluyen ajustar el incubador de aire para peces cebra a 28 grados Celsius y enfriar la centrífuga a cuatro grados Celsius para el método de célula individual. Se realizan los cruces de peces cebra, la recolección de embriones y la anestesia. Mediante metodología estándar, recolecte embriones de interés entre 48 y 72 horas posteriores a la fertilización.Después de anestesiar los embriones, elimine el anestésico con dos lavados y luego cargue los embriones en tres platos, con no más de 30 por plato para la detección cruda de célula individual. Recolecte al menos 35 embriones por condición en varios platos. A continuación, agregue 10 mililitros de solución oxidante o, como control negativo, haga lo mismo.Aplique 10 mililitros de agua y luego espere de 10 a 60 minutos mientras los embriones se incuban a 28 grados Celsius. También precaliente el HBSS a 28 grados Celsius para el lavado. Después de la incubación, transfiera los embriones a una nueva placa con HBSS tibio y agite suavemente.Luego, continúe con la detección de Ross en preparación completa o en célula individual. Una opción más fisiológica consiste en generar estrés tras el daño tisular mediante la técnica de lesión de la aleta caudal descrita por NI Tomer y colaboradores. Después del tratamiento con el agente oxidante, transfiera grupos de hasta 10 embriones a tubos pequeños.Lávelos abundantemente con HBSS y protéjalos de la luz con papel de aluminio. A continuación, añada un mililitro de solución de detección cruda a cada tubo e incube los tubos durante 15 minutos a 28 grados Celsius mientras se incuban. Prepare un portaobjetos que contenga tanto la condición de control como la condición experimental.Cubra un portaobjetos con pocillo con 300 microlitros de metilcelulosa. No forme burbujas al expulsar la metilcelulosa. Después de la incubación de los embriones, reemplace rápidamente la solución en los tubos con dos mililitros de HBSS e invierta los tubos varias veces para lavar los embriones.Luego aspire los embriones hacia la punta de una micropipeta y expúlselos suavemente sobre el portaobjetos tratado. Oriente los embriones utilizando un hilo fino de nailon y proceda a analizarlos con un microscopio de barrido fluorescente o confocal. Asegúrese de analizar todos los embriones bajo las mismas condiciones.Transfiera los embriones desde el lavado con HBSS a un nuevo recipiente, eliminando la mayor cantidad posible de la solución. Ahora, desprenda manualmente la capa externa de los embriones. Esto es verdaderamente necesario para disociar los embriones en células individuales.A continuación, transfiera los embriones a una placa de 24 pocillos, colocando 15 embriones en cada uno. Idealmente, llene tres pocillos para cada condición. A continuación, retire toda la solución y sustitúyala por 300 microlitros de HBSS, 30 microlitros de colagenasa P y 50 microlitros de tripsina-EDTA.Utilizando una punta de pipeta de un mililitro, homogenice los embriones con el trier. Una vez que todas las pocilas estén preparadas, transfiera la placa a 28 grados Celsius durante al menos 20 minutos; cada cinco minutos, triture las muestras para asegurar una buena homogenización. También coloque algunos tubos microfuga en hielo para recoger los tejidos cuando estén listos.A los 20 minutos, tome una muestra y verifique que el tejido esté disgregado en una suspensión de células individuales bajo el microscopio. Si no es así, continúe la incubación hasta un máximo de 30 minutos en total. Cuando el tejido esté listo, detenga la reacción con otros 200 microlitros de solución de paro.Mezcle esto con TRI utilizando una punta de pipeta de un mililitro. A continuación, transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo microfuga previamente enfriado y mantenga estos tubos en hielo, protegidos de la luz. Luego, centrifugue las muestras a 250 GS durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Luego, elimine el sobrenadante por aspiración. Reuspenda el botón celular en HBSS frío con hielo mediante agitación suave y verifique que la suspensión contenga al menos 2 millones de células. A continuación, resuspenda las células en un mililitro de la solución bruta del reactivo sensible.Incúbese a temperatura ambiente y en la oscuridad durante aproximadamente tres minutos. Ajuste este tiempo de incubación empíricamente. A continuación, transfiera las células a tubos FACS protegidos de la luz.Continúe con los análisis de fax para detectar el marcador transgénico. Fluorescencia y fluorescencia de la sonda Ross durante su análisis. Calcule siempre los niveles de pérdida como aumentos en función comparados con las muestras de control para normalizar la fluorescencia de fondo.Se utilizó toda la detección de Mount Ross para examinar la acumulación de peróxido de hidrógeno en un sitio de herida. Se compararon colas intactas y dañadas tras 20 minutos de tratamiento con oxidante. Se detectó una señal no específica en ambas condiciones.El mismo experimento con el pretratamiento de los embriones para reducir los niveles de peróxido de hidrógeno. El uso del inhibidor OX VAs 28 70 reveló que las señales detectadas dependían efectivamente de la acumulación de Ross rot. También se examinaron embriones tratados conocidos mediante montaje completo.Bajo alta magnificación, se pudieron identificar regiones anatómicas. Eso produjo Ross, como se indicó mediante el recuento de fluorescencia de células positivas para Ross por fax, que se realizó para la detección de Ross en células individuales. Este análisis se llevó a cabo sin la inclusión de células muertas. Control.Las células sin tratamiento también fueron analizadas. Comparar estos resultados facilitó mucho la cuantificación de la acumulación de Ross. El ensayo resulta excelente para probar cualquier número de manipulaciones experimentales.Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en 90 minutos si se lleva a cabo correctamente. No olvide que trabajar con sondas moleculares podría ser extremadamente peligroso y la precursión. Siempre se debe usar guantes durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

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Biología

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