Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento es medir cualitativa y cuantitativamente el estrés oxidativo en embriones vivos de pez cebra. Esto se logra mediante la adición de una solución oxidativa a los embriones preparados para la inducción de estrés oxidativo, o mediante la creación de un margen de herida en la aleta caudal del embrión. A continuación, los embriones se procesan para la detección del estrés oxidativo mediante un método de una sola célula o mediante un método de montaje completo.

A continuación, las preparaciones se incuban con una sonda de detección Ross. Los resultados pueden mostrar la cantidad de estrés oxidativo y el nivel de Ross en función de la microscopía confocal de montajes de agujeros o el análisis citofluorométrico de células individuales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el inmunofluorado para marcadores de estrés oxi es que permite la detección en bruto en el contexto de un organismo vivo y la cuantificación a nivel de tejidos individuales.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación básica, como la exploración de las condiciones de estrés oxidativo en el contexto de un estado patológico. Los individuos nuevos en el ingreso pueden tener dificultades debido a un daño tisular accidental porque las sondas moleculares sensibles en bruto pueden ser una fuente no planificada de acidez. Y debido a que los altos niveles de estrés oxidativo deben resultar en la muerte celular, mientras que muy pocos pueden ser difíciles de detectar con la práctica y la experimentación, estos problemas solo resultarán solos. Al preparar la solución para inducir estrés oxidativo a las mitocondrias compuestas por podredumbre conocida en DMSO, debe hacerse con stock de podredumbre conocida a una concentración entre cinco y 50 micromolares y nunca por encima de 100 micromolares podridos conocidos como tóxicos y peligrosos.

Preste atención a las precauciones indicadas en la etiqueta. La solución de sonda para la detección de Ross de montaje de orificio no debe exponerse a ninguna luz u oxígeno durante su preparación, y debe prepararse fresca para el método de detección de Ross de celda única. Se debe preparar una solución de parada de FBS en PBS y mantenerla a cuatro grados centígrados.

Otras preparaciones incluyen ajustar la incubadora de aire de pez cebra a 28 grados centígrados y, para el método de una sola celda, enfriar la centrífuga a cuatro grados centígrados. Se realizan cruces de pez cebra, recolección de embriones y anestesia. Utilizando la metodología estándar, se recolectan los embriones de interés entre 48 y 72 horas después de la fertilización.

Después de anestesiar, los embriones lavan el anestésico dos veces, luego cargan los embriones en tres platos con no más de 30 por plato para la detección de una sola célula cruda. Recoja al menos 35 embriones por condición en varios platos. A continuación, aplique 10 mililitros de solución oxidante o como control negativo.

Aplique 10 mililitros de agua, luego espere de 10 a 60 minutos mientras los embriones incuban a 28 grados centígrados. También precaliente HBSS a 28 grados centígrados para el lavado. Después de la incubación, transfiera los embriones a un nuevo plato de HBSS tibio y revuelva.

A continuación, proceda con la detección Ross de montaje completo o de celda única. Una opción más fisiológica es generar estrés después del daño tisular mediante el uso de la técnica de herida de la aleta caudal descrita por NI Tomer y compañía. Después del tratamiento oxidante, transfiera grupos de hasta 10 embriones a pequeños tubos.

Enjuáguelos abundantemente con HBSS y protéjalos de la luz con papel de aluminio. A continuación, agregue un mililitro de solución de detección cruda a cada tubo e incube los tubos durante 15 minutos a 28 grados centígrados mientras incuban. Prepare un portaobjetos de vidrio que contenga tanto la condición de control como la experimental.

Cubra un portaobjetos de depresión con 300 microlitros de metilcelulosa. No haga burbujas al expulsar la metilcelulosa. Después de la incubación del embrión, reemplace rápidamente la solución en los tubos con dos mililitros de HBSS e invierta los tubos varias veces para lavar los embriones.

A continuación, aspire los embriones en la punta de una micropipeta y expúsquelos suavemente en el portaobjetos tratado. Oriente los embriones con una fina línea de nailon y proceda con el uso de un microscopio de barrido fluorescente o confocal para el análisis. Asegúrese de analizar todos los embriones en la misma configuración.

Transfiera los embriones del lavado de HBSS a un plato nuevo, eliminando la mayor cantidad posible de la solución. Ahora desenmascarar manualmente los embriones. Esto es realmente necesario para disociar embriones en células individuales.

A continuación, mueva los embriones a una placa de 24 pocillos, cargue 15 embriones en cada uno. Llene de manera óptima tres pocillos para cada condición. A continuación, retire toda la solución y reemplácela con 300 microlitros de HBSS, 30 microlitros de colagenasa p y 50 microlitros de tripsina EDTA.

Con una punta de pipeta de un mililitro, homogeneizar los embriones con trier. Una vez que todos los pocillos estén preparados, transfiera la placa a 28 grados centígrados durante al menos 20 minutos cada cinco minutos, tritrate las muestras para asegurar una buena homogeneización. También coloque algunos tubos de micro fuga en hielo para recoger los pañuelos cuando estén listos.

A los 20 minutos, tome una muestra y verifique que el tejido se rompa en una suspensión de una sola célula bajo un microscopio. De lo contrario, continúe la incubación hasta 30 minutos en total. Cuando el tejido esté listo, detenga la reacción con 200 microlitros adicionales de solución de tapón.

Mezcle esto con TRI usando una punta de pipeta de un mililitro. A continuación, transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo de micro fuga preenfriado y mantenga estos tubos en hielo fuera de la luz. A continuación, centrifugar las muestras a 250 GS durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Y luego eliminar el sobrenadante por aspiración. Vuelva a suspender el pellet de celda en HBSS helado con tri suave y verifique que la suspensión tenga al menos 2 millones de celdas. A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de la solución de sonda sensible sin procesar.

Incubarlos a temperatura ambiente y en la oscuridad durante unos tres minutos. Ajuste este tiempo de incubación empíricamente. A continuación, transfiera las celdas a tubos de fax protegidos de la luz.

Proceda con los análisis por fax para detectar el marcador transgénico. Fluorescencia y fluorescencia de la sonda Ross Durante el análisis. Siempre calcule los niveles de pérdida a medida que aumenta el pliegue en comparación con las muestras de control para normalizar la fluorescencia de fondo.

Todas las detecciones de Mount Ross se utilizaron para examinar la acumulación de peróxido de hidrógeno en el sitio de la herida. Se compararon las colas intactas y lesionadas después de 20 minutos de tratamiento oxidante. Se detectó señal inespecífica en ambas condiciones.

El mismo experimento con el pretratamiento de los embriones para reducir los niveles de peróxido de hidrógeno. El uso de inhibidores de OX VAs 28 70 reveló que las señales detectadas dependían efectivamente de la pudrición por acumulación de Ross. Los embriones tratados conocidos también fueron examinados por montura entera.

Bajo grandes aumentos se pudieron identificar regiones anatómicas. Eso produjo Ross, como lo indica el recuento de fluorescencia de las células positivas de Ross por fax, para la detección de Ross de una sola célula. Este análisis se llevó a cabo sin la inclusión de células muertas. Control.

También se analizaron células sin tratamiento. La comparación de estos resultados facilitó mucho la cuantificación de la acumulación de Ross. El ensayo demuestra ser excelente para probar cualquier número de manipulaciones experimentales.

Una vez dominado esto, se puede hacer una técnica en 90 minutos si se realiza correctamente. No hay que olvidar que trabajar con sondas moleculares puede ser extremadamente peligroso y la precursión. El uso de guantes siempre debe realizarse mientras se realiza este procedimiento.