El aislamiento de las células madre del cáncer de muestras de cáncer de próstata humano

El objetivo general de este procedimiento es describir el aislamiento de células madre de cáncer de próstata a partir de tejido humano por fax. Esto se logra procesando primero el tejido de cáncer de próstata extraído de muestras quirúrgicas. En el segundo paso, se genera una suspensión celular a partir de las secciones de tejido y las células se marcan con anticuerpos fluorescentes.

En el paso final, las células madre del cáncer de próstata se clasifican por hechos. En última instancia, los atributos moleculares y funcionales de las células aisladas se pueden caracterizar mediante xenotrasplantes y perfiles de expresión génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de próstata al facilitar la caracterización molecular y funcional de las células madre cancerosas a partir de muestras humanas.

Samuel Vidal, estudiante de doctorado en medicina, Aiden Quinn, estudiante de maestría, y Jania, demostrarán el procedimiento. Nuestra investigación A del laboratorio comienza recolectando el exceso de tejido a granel de las muestras de cáncer que no son necesarias para el diagnóstico clínico en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 15 mililitros de medio. Guarde inmediatamente el tubo a cuatro grados centígrados para su procesamiento dentro de las 24 horas posteriores a la resección, luego trabaje en un gabinete de bioseguridad con un bisturí estéril y fórceps.

Obtener secciones de tejido horizontal de dos a cuatro milímetros de espesor a partir de los nódulos tumorales macroscópicos dentro de la muestra de tejido canceroso. Coloque estas secciones en un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga medios. A continuación, separa una porción y fíjala en formol al 10% para su análisis histológico y confirmar la presencia de tejido de cáncer de próstata para generar suspensiones celulares a partir del tejido tumoral.

A continuación, transfiera cada una de las secciones de tejido de dos a cuatro milímetros a una placa de cultivo de 60 por 15 milímetros que contenga un mililitro de PBS estéril. Tritrate mecánicamente las muestras con un bisturí estéril y pinzas y agrupe las suspensiones celulares resultantes en un solo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue otro mililitro de PBS al plato de muestra, repitiendo la iteración tres o cuatro veces más hasta que cada sección de tejido esté completamente disociada. Y luego use una pipeta de cinco mililitros para mezclar la solución celular.

Agite las soluciones celulares a la velocidad máxima durante un minuto y luego filtre la suspensión celular resultante a través de un filtro celular de 35 micrómetros en un segundo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Gire las celdas filtradas durante 10 minutos a 450 veces G a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos.

Después de cinco minutos, vuelve a girar las celdas. Resus suspendiendo el pellet libre de glóbulos rojos en una pequeña cantidad de PBS suplementado con 5%FBS para el recuento por exclusión de azul de triano. Después de cuantificar el número de células viables, diluya las células a una suspensión de una por 10 a seis células por mililitro y guárdelas en hielo durante no más de una hora.

Para aislar las células madre del cáncer de próstata, comience marcando cinco tubos cónicos de 15 mililitros, ya que se ha demostrado que excluyen las células hematopoyéticas y endoteliales durante la clasificación. Divida la suspensión celular generada a partir de las secciones de tejido tumoral entre los cinco tubos y luego incube las células con los anticuerpos apropiados en una dilución de uno a 250 durante 30 minutos en hielo. A continuación, centrifugar las células y lavar los gránulos en PBS estéril suplementado con 10%FBS Después del lavado, incubar los gránulos en 10 microgramos por mililitro de DPI y filtrar las soluciones finales a través de tapas de filtro de 35 micrómetros en tubos de poliestireno de 12 por 75 milímetros.

Utilice los primeros cuatro tubos para configurar las puertas para la dispersión hacia adelante, la dispersión lateral, dpi, fite y pe. Por último, utilice el tubo cinco para recoger las poblaciones de HLA Clase uno negativo y HLA Clase uno positivo en tubos cónicos estériles individuales de 15 mililitros que contienen dos mililitros de RPMI suplementados con 10% de FBS. A continuación, centrifugar las suspensiones celulares clasificadas y resuspender los gránulos en 200 a 500 microlitros de medio para la cuantificación de las células viables por exclusión de azul triano.

El protocolo demostrado facilita el aislamiento de células madre de cáncer de próstata HLA de clase uno negativo de muestras quirúrgicas humanas. Estas imágenes ilustran los nódulos tumorales macroscópicos macroscópicamente visibles que pueden procesarse y luego confirmarse mediante microscopía. Como se ha demostrado, las células viables se aíslan por su tinción de dapi negativa, por lo que se puede determinar la frecuencia de las células madre de cáncer de próstata HLA de clase uno negativas.

El número de células madre de cáncer de próstata HLA de clase uno negativas varía entre los pacientes, pero generalmente representa del 0,5 al 8% de la población viva total después de este procedimiento. Se pueden utilizar otros métodos, como el perfil de expresión génica y el xenotrasplante, para caracterizar mejor los mecanismos que contribuyen a la resistencia a la quimioterapia y a la progresión de la enfermedad.