Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación
1 de mayo de 2014
Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.
El objetivo general del siguiente experimento es el monitoreo in vitro de grupos de perlas cardíacas derivadas de células madre embrionarias humanas en 3D, tiempo real y alta resolución espacial. Esto se logra primero cultivando y expandiendo células madre embrionarias hasta que forman cuerpos de Embry. A continuación, los grupos batidos se diseccionan y se recubren en filtros porosos de POLITETRAFLUOROETILENO o PTFE, lo que permite que se mantengan como aire a largo plazo.
Los cultivos líquidos, luego batiendo clústeres, se marcan con nanopartículas armónicas para realizar microscopía multifotónica en tiempo real. Los resultados obtenidos permiten analizar la elongación espacial y la frecuencia de las contracciones cardíacas a escala microscópica. Así que la principal ventaja de estas nanopartículas es que se puede utilizar cualquier longitud de onda, especialmente la infrarroja, por lo que se puede profundizar en el tejido y además son muy estables en el tiempo.
Por lo tanto, podemos monitorear nuestros procesos largos durante largos períodos de tiempo. Este método de cultivo de células madre puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la contracción funcional de los cardiomiocitos en tres dimensiones. En particular, la maduración cardíaca y la ingeniería de tejidos.
Las personas deben tener en cuenta que el procedimiento de marcaje con nanopartículas armónicas solo se puede utilizar para la microscopía multifotónica y no se puede transferir a otro tipo de sistemas de imagen. La primera vez que tuvimos la idea de utilizar nanopartículas armónicas fue en 2005. Estas nanopartículas presentan ventajas con respecto a los tintes fluorescentes y los puntos cuánticos.
De hecho, su señal no se desvanece con el tiempo y se pueden usar para monitorear muestras en desarrollo durante largos períodos de tiempo. La demostración visual de la preparación de la muestra es fundamental para la eficiencia y la reproducibilidad de los diferentes pasos, en particular cuando se realizan pruebas de drogas y también podría aplicarse a diferentes tejidos o enfermedades. Modelado de tejidos.
Después de cultivar y expandir células madre embrionarias humanas o ESC de acuerdo con el protocolo de texto e incubarlas con colagenasa tibia, cuatro durante 10 minutos, recolectar los fragmentos de la colonia en dos mililitros de diferenciación fresca, medio o DM y centrifugar a 115 veces la gravedad durante tres minutos. Cultivo, la colonia se fragmenta en suspensión en aditamentos ultra bajos. Placas de seis pocillos durante cuatro días para permitirles formar cuerpos embrionarios o ebs.
A continuación, coloque el EBS recién formado en placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% durante 15 a 30 días hasta la aparición de los racimos batidores. Retirar el PBS y utilizando acutus, disociar las colonias en celdas individuales después de centrifugar y resus, suspendiendo las celdas en placa de medio DM dos mililitros por agro. Pocilar en cámara e incubar a 37 grados centígrados durante un día.
Recoja el EBS recién formado y coloque tres por pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% después de dos a cuatro semanas en cultivo. Identifique grupos de cardiomiocitos latentes y, con una pipeta de pasta alargada y cortada bruscamente, diseccionelos manualmente. Deposite cuatro filtros de PTFE por inserto y colóquelos en un pocillo de una placa de seis pocillos.
Después de agregar un mililitro de DM en cada uno, agregue un grupo de batido diseccionado en cada filtro de PTFE. Para etiquetar los racimos, transfiera los filtros de PTFE con los colectores batidos a un plato con fondo de vidrio de 3,5 centímetros. Agregue un mililitro de nanopartículas de generación de segundo armónico a 50 microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius para realizar imágenes ópticas no lineales.
Después de transferir HEB marcados o grupos de latidos cardíacos a una cámara de imágenes, utilice imágenes de campo amplio bajo iluminación de luz blanca para identificar estructuras de interés dentro de EBS diferenciados o grupos de latidos activos. Realice un escaneo tridimensional rápido y de baja resolución para reconstruir la morfología general del cúmulo cardíaco y seleccione un plano de imagen dentro del volumen del cúmulo con varias nanopartículas visibles de segunda generación de armónicos para monitorear en tiempo real. Las contracciones del grupo cardíaco configuran el escáner óptico del microscopio en el modo más rápido, lo que permite la adquisición de imágenes bidimensionales de varios hercios.
Analice las imágenes utilizando el software MATLAB de acuerdo con el protocolo de texto, como se muestra aquí, antes de evaluar la actividad de golpeteo. La caracterización de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE se realiza para garantizar que el sustrato desnudo a la fluorescencia de fotones sea muy débil y no pueda impedir la medición de las muestras biológicas relevantes y la emisión de las muestras aisladas. Las nanopartículas de segunda generación de armónicos se pueden adquirir fácilmente mediante imágenes a través del sustrato en modo de detección epi.
En esta figura, se muestran las nanopartículas de segunda generación armónica marcadas con estructuras cardíacas y EBS. Los colores rojo, amarillo y verde corresponden a la autofluorescencia del NADH, mientras que los puntos de segundo armónico de color azul intenso provienen de nanopartículas aisladas de segunda generación de armónicos. Obsérvese el buen contraste óptico y el etiquetado relativamente escaso en comparación con los puntos cuánticos o las nanopartículas de conversión ascendente.
Esta figura ilustra una vista de corte de un grupo de nanopartículas de segunda generación de armónicos etiquetadas como latidos cardíacos. Como se muestra en esta película, las estructuras 3D se graban a alta velocidad para monitorear el patrón de contracción en la segunda celda. Generación de armónicos Nanopartículas agregadas para mantener una alta tasa de velocidad de adquisición para resolver el movimiento NP.
La sensibilidad de adquisición general no fue suficiente para registrar la autofluorescencia celular con emisión de segundo armónico de la generación de segundo armónico. El análisis de imágenes de nanopartículas realizado en fotogramas de película indica que dentro del mismo grupo cardíaco los desplazamientos son del orden de unos pocos micrómetros, y la frecuencia es constante para entrar y salir del movimiento de nanopartículas de segunda generación de armónicos simples. Cuando se domina la técnica de preparación de células, la disección del grupo de apuestas, el cultivo de líquido de aire y el parto se pueden realizar en 24 a 36 horas si se realizan correctamente.
Especialmente con esta técnica, se deben evitar los contactos al aire libre para evitar contaminaciones. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como los registros electrofisiológicos, utilizando múltiples guías de electrodos para responder a preguntas adicionales, como la correlación de los perfiles de potencial de acción con la frecuencia de batido en tres dimensiones. Nuestra novedosa técnica basada en la detección de la señal no lineal por nanopartículas armónicas puede desarrollarse aún más para estudios in vivo que infectan las longitudes de onda utilizadas para la obtención de imágenes y permiten una penetración más profunda en los tejidos.
Un posible desarrollo podría ser la integración de la estructura derivada de las células madre para aplicaciones de medicina regenerativa.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para el etiquetado in vitro de células madre embrionarias humanas (hESCs) utilizando nanopartículas generadoras de segundo armónico. Detalla metodologías para investigar hESCs mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Investigación de células madre
- Biología cardíaca
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- Las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en varios tipos celulares.
- Monitorear los grupos de cuentas cardíacas es crucial para entender el desarrollo del corazón.
- Las nanopartículas generadoras de segundo armónico ofrecen ventajas en la imagen.
- La microscopía multi-fotón proporciona alta resolución espacial para el análisis en tiempo real.
Propósito del estudio
- Monitorear en tiempo real los grupos de cuentas cardíacas derivados de hESCs.
- Analizar la elongación espacial y la frecuencia de las contracciones cardíacas.
- Utilizar nanopartículas para una imagen de tejido más profunda.
Métodos utilizados
- Cultivo y expansión de hESCs para formar cuerpos embrioides.
- Disección y colocación de grupos de contracciones en filtros porosos de PTFE.
- Etiquetado de grupos de contracciones con nanopartículas armónicas.
- Realización de microscopía multi-fotón en tiempo real para el análisis.
Resultados principales
- Monitoreo exitoso de las contracciones cardíacas a escala microscópica.
- Demostración de la estabilidad de las nanopartículas a lo largo del tiempo.
- Capacidad para usar varias longitudes de onda para una penetración más profunda en los tejidos.
- Conocer la dinámica del comportamiento de los grupos cardíacos.
Conclusiones
- La metodología permite un monitoreo efectivo in vitro de los grupos cardíacos.
- Las nanopartículas generadoras de segundo armónico mejoran las capacidades de imagen.
- Este enfoque puede avanzar en la comprensión del desarrollo cardíaco a partir de células madre.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
