Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

El objetivo general del siguiente experimento consiste en el monitoreo in vitro de grupos de latidos cardíacos derivados de células madre embrionarias humanas en tiempo real tridimensional y con alta resolución espacial. Esto se logra primero cultivando y expandiendo las células madre embrionarias hasta que formen cuerpos embrionarios. A continuación, los grupos latientes se disecan y siembran sobre filtros porosos de politetrafluoroetileno o PTFE, lo que permite mantenerlos a largo plazo en aire.

Los cultivos líquidos que presentan latidos en racimos se etiquetan con nanopartículas armónicas para realizar microscopía multiphotónica en tiempo real. Los resultados obtenidos permiten analizar la elongación espacial y la frecuencia de las contracciones cardíacas a escala microscópica. Así, la principal ventaja de estas nanopartículas es que se puede utilizar cualquier longitud de onda, especialmente la infrarroja, lo que permite penetrar más profundamente en el tejido, y además son muy estables en el tiempo.

De modo que podemos supervisar nuestros procesos prolongados a lo largo de períodos de tiempo extensos. Este método de cultivo de células madre puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la contracción funcional de cardiomiocitos en tres dimensiones. En particular, la maduración cardíaca y la ingeniería de tejidos.

Las personas que utilicen por primera vez este método deben tener en cuenta que el procedimiento de marcado con nanopartículas armónicas solo puede emplearse en microscopía de multiphotones y no puede transferirse a otro tipo de sistemas de imagen. Tuvimos por primera vez la idea de utilizar nanopartículas armónicas en 2005. Estas nanopartículas presentan ventajas con respecto a los colorantes fluorescentes y los puntos cuánticos.

De hecho, su señal no se atenúa con el tiempo y pueden utilizarse para monitorear muestras en desarrollo durante largos períodos. La demostración visual de la preparación de la muestra es fundamental para la eficiencia y la reproducibilidad de los diferentes pasos, en particular al realizar pruebas de fármacos, y también podría aplicarse a diferentes tejidos o enfermedades. Modelado de tejidos.

Después de cultivar y expandir células madre embrionarias humanas o CME según el protocolo descrito y incubarlas con colagenasa tibia durante cuatro veces 10 minutos, recoger los fragmentos de colonia en dos mililitros de medio fresco de diferenciación o DM y centrifugar a 115 veces la gravedad durante tres minutos. Cultivar los fragmentos de colonia en suspensión en placas de seis pocillos con adherencia ultra baja durante cuatro días para permitir que formen cuerpos embrionarios o EBE.

Luego, siembre los EBS recién formados en placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1 % durante 15 a 30 días, hasta la aparición de agregados con latidos. Retire el PBS y, utilizando acutasa, disocie las colonias en células individuales tras centrifugar y resuspender, suspendiendo las células en medio DM y sembrando dos mililitros por pocillo. Incube en cámara a 37 grados Celsius durante un día.

Recoger los EBS recién formados y sembrar tres por pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1 % después de dos a cuatro semanas en cultivo. Identificar los grupos de cardiomiocitos latientes y, utilizando una pipeta Pasteur cortada en forma alargada y afilada, diseccionarlos manualmente. Depositar cuatro filtros de PTFE por inserto y colocar cada uno en un pocillo de una placa de seis pocillos.

Después de agregar un mililitro de DM en cada uno, coloque un cúmulo latiente diseccionado sobre cada filtro de PTFE. Para etiquetar los cúmulos, transfiera los filtros de PTFE con los cúmulos latientes a una placa de vidrio de fondo plano de 3,5 centímetros. Agregue un mililitro de nanopartículas de generación de segundo armónico al 50 microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius para realizar imágenes ópticas no lineales.

Después de transferir HEB etiquetados o cúmulos cardíacos con latidos a una cámara de imagen, utilice microscopía de campo amplio con iluminación de luz blanca para identificar estructuras de interés dentro de los EBS diferenciados o los cúmulos con latidos activos. Realice una exploración tridimensional rápida de baja resolución para reconstruir la morfología general del cúmulo cardíaco y seleccione un plano de imagen dentro del volumen del cúmulo que contenga varias nanopartículas visibles de generación de segundo armónico para su monitoreo en tiempo real. Las contracciones del cúmulo cardíaco configuran el escáner óptico del microscopio en el modo más rápido, lo que permite la adquisición de imágenes bidimensionales a múltiples hercios.

Analice las imágenes utilizando el software MATLAB según el protocolo descrito en el texto, como se demuestra aquí, antes de evaluar la actividad de latido. Se realiza la caracterización de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE para asegurar que la fluorescencia del sustrato desnudo frente a los fotones sea muy débil y no pueda impedir la medición de las muestras biológicas relevantes y la emisión desde lo aislado. La generación de segundo armónico de nanopartículas puede obtenerse fácilmente mediante imágenes a través del sustrato en modo de detección epi.

En esta figura, se muestran nanopartículas de generación de segundo armónico que etiquetan estructuras cardíacas y EBS en una hoja. Los colores rojo, amarillo y verde corresponden a la autofluorescencia de NADH, mientras que los intensos puntos azules de segundo armónico provienen de nanopartículas aisladas de generación de segundo armónico. Observe el buen contraste óptico y la marcación relativamente escasa en comparación con puntos cuánticos o nanopartículas de conversión ascendente.

Esta figura ilustra una vista en corte de un cúmulo cardíaco latiente marcado con nanopartículas de generación de segundo armónico. Como se muestra en esta película, las estructuras 3D se registran a alta velocidad para monitorear el patrón de contracción en la segunda célula. Las nanopartículas de generación armónica se agrupan para mantener una alta tasa de adquisición de imágenes, permitiendo resolver el movimiento de las NP.

La sensibilidad general de adquisición no fue suficiente para registrar la autofluorescencia celular con emisión de segundo armónico proveniente de la generación de segundo armónico. El análisis de imagen de nanopartículas realizado en cuadros de video indica que dentro del mismo grupo cardiaco, los desplazamientos son del orden de unas pocas micras, y la frecuencia es constante para el movimiento de nanopartículas de generación de segundo armónico dentro y fuera del plano. Una vez dominada la técnica de preparación celular, la disección del mejor grupo, el cultivo en interfase aire-líquido y el parto pueden realizarse en 24 a 36 horas si se realizan adecuadamente.

Especialmente con esta técnica, deben evitarse los contactos con el aire libre para prevenir contaminaciones. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos como grabaciones electrofisiológicas mediante matrices de electrodos múltiples para responder preguntas adicionales, como correlacionar los perfiles de potencial de acción con la frecuencia de latido en tres dimensiones. Nuestra técnica novedosa, basada en la detección de la señal no lineal mediante nanopartículas armónicas, puede desarrollarse aún más para estudios in vivo, ya que las longitudes de onda utilizadas para la imagen permiten una mayor penetración en los tejidos.

Un posible desarrollo podría ser seguir la integración de la estructura derivada de células madre para aplicaciones en medicina regenerativa.