La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar la capacidad invasiva de células cancerosas mediante un ensayo de invasión tridimensional. Esto se logra primero cultivando células cancerosas en una matriz de membrana basal. Luego, se observa la invasión celular de la matriz durante cinco días o más mediante microscopía óptica.

En el paso final, las células se etiquetan con anticuerpos fluorescentes para la localización de las proteínas de interés. En última instancia, la tasa de invasión de las células cancerosas y los cambios resultantes en la expresión proteica pueden analizarse mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes, como el ensayo de invasión en cámara Transwell, es que el ensayo de invasión en gel tridimensional simula mejor el entorno in vivo en el que crece el cáncer.

La implicación de esta técnica radica en la terapia contra el cáncer, donde pueden identificarse nuevas proteínas en estudio que participan en la invasión y metástasis del cáncer. Antes de comenzar el procedimiento de cultivo, coloque la matriz de membrana basal, una pipeta P200 y puntas de pipeta sobre hielo durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, utilice la punta de la pipeta de 200 microlitros fría con hielo para distribuir 50 microlitros de la matriz en un patrón espiral sobre el fondo de un platillo con fondo de vidrio para microscopía confocal número uno.

Luego, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante al menos 30 minutos mientras la matriz se solidifica. Añada tripsina a una placa de 100 milímetros con células en un estado de confluencia del 70 al 80% una vez que las células hayan comenzado a desdoblarse. Inactive la tripsina con 10 mililitros de medio y, a continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células durante tres minutos a 100 Gs y 4 grados Celsius mientras las células sedimentan.

Aliquotar 50 microlitros de matriz en un tubo microcentrífugo de un mililitro por placa de matriz de membrana basal, y colocar los tubos en hielo cuando las células hayan terminado de centrifugarse. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y luego resuspender. Suspender las células en un mililitro de medio y contarlas a continuación.

Transfiera 2,5 veces 10 a la cuarta células a un nuevo tubo de microcentrífuga, completando la suspensión celular con medio hasta un volumen final de 50 microlitros. Luego, agregue 50 microlitros de matriz de membrana basal fría a hielo a las células en una proporción uno a uno, para obtener un volumen final de 100 microlitros. Plaque suavemente la mezcla de matriz y células sobre la matriz de membrana basal solidificada, y permita que las células queden embebidas en la matriz dentro del incubador de cultivo celular.

Después de 30 minutos, cubra la matriz con dos mililitros de medio y devuelva el recipiente al incubador, cambiando el medio cada día durante toda la duración del experimento. Utilice una vez al día, durante todo el experimento, el objetivo 10 x de un microscopio de luz para obtener 20 imágenes de interferencia diferencial. Contraste las imágenes de las colonias suspendidas en la matriz de membrana basal. Analice las imágenes de forma ciega para determinar la formación estrellada de las colonias celulares.

Se considera que una colonia es estelada si se observan una o más proyecciones provenientes del esteroides de células. Para examinar las características morfogénicas de las colonias en 3D, retire las células del incubador y colóquelas sobre una bandeja con hielo. Aspire el medio y luego lave la colonia tres veces con dos mililitros de PBS frío.

Después del último lavado, fije las células en dos mililitros de solución al 20% de acetona y 80% de metanol durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, y luego regrese las placas a temperatura ambiente. Una vez que la matriz de la membrana basal alcance la temperatura ambiente, aspire el fijador y lave la placa tres veces con PBS como se acaba de demostrar. Después del lavado final, bloquee cualquier unión no específica en las células con dos mililitros de BSA al 3% durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, incubar las células con los anticuerpos primarios de interés diluidos en BSA al 3 % a temperatura ambiente. Después de una hora, eliminar la solución de anticuerpo primario tras lavar tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido, añadir el anticuerpo secundario disuelto en BSA al 3 % en la dilución adecuada e incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras lavar con PBS para eliminar el anticuerpo secundario no unido, teñir los núcleos de las células en dos mililitros de hext 3,3,2,5,8 en PBS durante cinco minutos en la oscuridad.

Luego, lave el hext no unido de las células cinco veces con PBS. Después del quinto lavado, agregue medio de montaje directamente sobre la mezcla de matriz y células y cubra cuidadosamente el medio de montaje con un cubreobjetos de vidrio para evitar cualquier alteración en la integridad de la mezcla de matriz de membrana basal y células. Deje secar la placa durante la noche a temperatura ambiente y luego obtenga imágenes con un microscopio fluorescente a las longitudes de onda láser adecuadas para los anticuerpos utilizados en estas imágenes.

Se ilustran células MDA MB 2 3 1 invadiendo una matriz 3D. Las células se incorporaron a la matriz el día uno y comenzaron a formar estructuras estrelladas invasivas a partir del día tres. Para el día cinco, se pudo observar una invasión completa de la matriz.

Luego se contó el número de colonias estrelladas formadas y se expresó como un porcentaje del número total de colonias invasivas y no invasivas por placa. Además, dado que las mediciones se completaron diariamente durante cinco días, también se pudo evaluar la tasa de invasión en estas imágenes de inmunofluorescencia. Se muestran colonias estrelladas invasivas representativas de células MDA MB 2 3 1 que presentan pérdida de integridad de la membrana y localización difusa de la proteína de membrana basal laminina cinco, en marcado contraste con lo observado en las células de cáncer de mama MDA MB 2 31.

La laminina cinco se localizó en una capa intacta de membrana basal que rodea la capa basal de células no malignas MCF 10 A no tratadas. Tras este procedimiento, se puede realizar un cultivo conjunto con células estromales para responder preguntas adicionales, como si las células cancerosas establecen comunicación cruzada con las células estromales en el microentorno tras su desarrollo. Esta técnica abrió camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la invasión y migración del cáncer, procesos ambos necesarios para la diseminación metastásica de las células cancerosas.