Name: La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a cuantificar la invasión de células de cáncer de mama mediante ensayos tridimensionales con matriz de membrana basal. Este método permite analizar cambios en la expresión proteica durante la metástasis.

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Este trabajo se llevó a cabo con fondos para M.B. de la subvención MOP 107972 de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). M.B. ha recibido un Premio Salarial para Nuevos Investigadores del CIHR. D.C. ha recibido becas de la Unidad de Investigación Traslacional del Cáncer de Mama y del Programa de Capacitación Estratégica del CIHR en Investigación del Cáncer y Transferencia de Tecnología, del Programa Regional del Cáncer de Londres. C.G. es beneficiaria de becas de la Unidad de Investigación Traslacional del Cáncer de Mama, London Regional Cancer Program y del CIHR- Programa Estratégico de Formación en Investigación en Cáncer y Transferencia de Tecnología. Sgd.

1. Cultivo tridimensional de células de cáncer de mama en Sótano matriz de la membrana (La Técnica de empotramiento) <ol><li> Manejo de la matriz de la membrana basal Matrigel: Descongelar en hielo durante la noche a 4 ° C. Matriz de la membrana basal es líquido a baja temperatura pero solidifica a temperatura ambiente. Mantener la matriz de la membrana basal en hielo (figuras 1A-B). </li><li> Cubra el plato No.1 Confocal con fondo de vidrio con 50 l de la matriz de la membrana basal por medio de la difusión de la matriz usando la punta de un P-200 Pipetman en forma de espiral (Figura 1C). Tenga cuidado cuando la difusión de la matriz de la membrana basal para evitar la formación de burbujas de aire. Del mismo modo, evitar la propagación de la matriz a cerca de los bordes de la placa con fondo de cristal para evitar la formación de menisco. Si matriz de la membrana de manipulación inexperta sótano, a continuación, preenfriado el plato, P-200 Pipetman y pipetas puede ser en hielo (alternativamente dejó durante la noche en una nevera a 4 ° C). Este paso ofertastiempo adicional para ampliar la matriz de la membrana basal antes de la solidificación. Coloque el plato (s) en una incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) durante al menos 30 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal para solidificar (Figura 1D). </li><li> Mientras que la matriz está experimentando la solidificación, trypsinize un confluente de 100 mm de placa de las células del 70-80%. Una vez que las células han comenzado de elevación fuera de la placa, volver a suspender en 10 ml de medio RPMI 1640 que contiene 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS), para inactivar la tripsina (Figura 1E). A continuación, transferir las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 ml (Figura 1F). </li><li> Haga girar las células (presentes en tubo cónico) a 100 xg durante 3 minutos en una centrífuga de cultivo celular específico (Figuras 1G-H). </li><li> Mientras que las células se centrifugan, alícuota de 50 l de la matriz en un tubo de microcentrífuga de 1 ml (nota: cada plato con fondo de cristal se asigna un tubo de microcentrífuga, por lo que, siel experimento requiere de 3 platos, entonces se deduce que 3 tubos de microcentrífuga son necesarias también), y luego colocar el tubo en hielo (Figura 1B). </li><li> Aspirar el medio desde el tubo cónico de la etapa 1.4, dejando el sedimento inalteradas (Figura 1I). Resuspender las células (que se han hecho girar hacia abajo) en 1 ml de FBS suplementado con medio RPMI (Figura 1J). </li><li> Una vez que las células se contaron usando un hemocitómetro (Figura 1K), o un contador de partículas alícuota de células 2,5 x 10 4 células en el tubo de microcentrífuga y por si fuera poco el uso de los medios adecuados para obtener el volumen total de 50 l (Figura 1D). </li><li> Mezclar las células de la etapa 1.7 (25.000 células en 50 l) con el tubo de microcentrífuga que contiene matriz de la etapa 1.5 en una proporción de 1:1; volumen final será de 100 l (Figura 1M). </li><li> Suavemente la placa 100 l de la matriz: mezcla de células de la etapa 1.8 en el solidified matriz recubiertos con membrana basal plato de la etapa 1.2 (Figura 1 N). Esto permite que las células se pueden incrustar en la matriz de la membrana basal. </li><li> Transferir el plato (s) en la incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) y permitir que la matriz: mezcla de células se solidifique durante al menos 30 min. </li><li> Una vez que la matriz: mezcla de células se solidifica, añadir 2 ml de medio RPMI suplementados con FBS al plato (Figura 1O) y tomar el plato de nuevo la incubadora donde se almacenará durante el resto del experimento (Figura 1P). </li><li> Cambio de medio cada día durante un período de 5 días (o según requerido para un ensayo; la duración del ensayo para MDA-MB-231 células es de 5 días de duración). </li><li> El uso de un microscopio de luz, toma de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes de los MDA-MB-231 colonias suspendidas en la matriz de la membrana basal (Figura 3A). Imagen 20 áreas representativas a 10X objetivo una vez al díadurante cinco días para determinar colonia morfogénesis (Figura 3C). </li><li> Analizar las imágenes a ciegas para determinar la formación de colonias de células estrelladas (Figura 3B). Una colonia se considera que es estrelladas si se perciben una o más proyecciones de la esferoide de células. Para determinar el porcentaje de colonias estrelladas invasivos, dividir el número de colonias estrelladas por el número total de colonias de células por imagen adquirida, y que la media de las colonias estrelladas porcentajes de las 20 imágenes para cada día. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Cultivo tridimensional de células MDA-MB-231 células de cáncer de mama en matriz de membrana basal (la técnica de empotramiento). AB) un esquema del montaje experimental (realizado en la campana de humos). C) El pozo de la placa de fondo de vidrio recubiertocon 50 l de matriz de membrana basal. D) Plato (ES) colocado en una incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) para permitir la matriz para solidificar durante al menos 30 min se trataron con tripsina. E) Células. F ) Se resuspendieron las células en un tubo cónico de 15 ml. GH) Las células (presentes en tubo cónico) se centrifugaron a 100 xg durante 3 min en una centrífuga de cultivo de tejidos. I) sedimento celular. J) Las células (que han sido hechos girar hacia abajo) se resuspendieron en 1 ml de medio RPMI suplementado-FBS. K) Las células se contaron usando un hemocitómetro. L) 2,5 x 10 4 células en alícuotas en tubo de microcentrífuga y rematado apagado utilizando medios apropiados con el fin de obtener el volumen total de 50 l. M ) Mezclar las células de la etapa 1.7 (25.000 células en 50 l) con el tubo de microcentrífuga que contiene matriz de la etapa 1.5 en una proporción de 1:1; volumen final será de 100 μ.; L N) placa suavemente 100 l de la matriz: mezcla de células desde el paso 8 en el plato de la matriz con recubrimiento solidificado desde el paso 1.2 O) Una vez que la matriz: mezcla de células se solidifica, añadir 2 ml de medio RPMI suplementados con FBS al. el plato. P) colocar la cápsula en la incubadora, donde se almacenará para el resto del experimento. 2. Examen de las Características Morfogénicas de Culturas 3D con inmunofluorescencia <ol><li> Configurar una bandeja de hielo, fosfato fría solución tamponada (PBS), 20% de acetona: 80% de metanol (solución de fijación), y 3% de albúmina de suero bovino (BSA; solución de bloqueo) (Figura 2A) antes de sacar el plato (ES) de la incubadora. </li><li> Coloque el recipiente (es) en el soporte de la bandeja de hielo y aspirar, lavar 3 veces con 2 ml de PBS frío (Figura 2B). </li><li> Una vez que el último lavado PBS se aspira, añadir 2 ml de 20% de acetona: solución de metanol al 80% en el plato (es) (Figura 2C </strong&gt;) para fijar las células durante 20 min a 4 ° C (ya sea en hielo o en un frigorífico) (Figura 2D). </li><li> Una vez que el 20 min de fijación se termina, llevar los platos de nuevo a temperatura ambiente, aspirar el fijador, y posteriormente lavar 3x con PBS. Una vez que el lavado final de PBS se aspiró, añadir 2 ml de 3% de BSA a la placa (s) para bloquear por lo menos durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 2E). </li><li> Durante el período de bloqueo preparar diluciones de primaria (laminina V 1:100) y anticuerpos secundarios (con una dilución adecuada) disueltos en 3% de albúmina de suero bovino (BSA) tampón de bloqueo. Por favor, tenga en cuenta que la solución de 400-500 l &#39;BSA + anticuerpo primario &quot;debe añadirse directamente en la matriz: mezcla de células. </li><li> Una vez que el bloqueo de 30 minutos de haber caducado, añada los anticuerpos primarios y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (Figura 2F). Por favor, tenga en cuenta que no hay lavados de PBS se deben realizar después de la 30 min blockinperiodo g. </li><li> Sobre la terminación de la etapa 2.6, eliminar la solución &#39;de BSA + anticuerpo primario&#39;, y lavar 3x con PBS. </li><li> Añadir el anticuerpo secundario disuelto en 3% de BSA (a una dilución apropiada) directamente sobre la matriz: mezcla de células, cubrir los platos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente (Figura 2G). </li><li> Retire la solución &quot;BSA + anticuerpo secundario &#39;, y lavar 3 veces con PBS. </li><li> Añadir 2 ml de Hoechst 33258 (1:10.000) disueltos en PBS para la tinción de los núcleos, y se incuba durante 5 minutos bajo una lámina de aluminio (o cubra con un envase opaco para limitar fotoblanqueo) (Figura 2H). </li><li> Una vez que el 5 min de incubación con Hoechst 33258t han expirado, lavar el plato (es) de 5x con PBS. </li><li> Añadir medio de montaje directamente sobre la matriz: mezcla de células en el plato confocal y cubrir con cubreobjetos de vidrio con cuidado para evitar la inducción de cualquier interrupción de la integridad de las colonias en el Matri membrana basalx: mezcla de células (Figura 2I). </li><li> Dejar que la cápsula (es) que se seque durante la noche (o 24 horas) a temperatura ambiente (Figura 2I). Una vez seco, el plato (s) se puede almacenar a -20 ° C, pero se recomienda que deben ser reflejados lo más rápidamente posible. </li><li> Adquirir imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con longitudes de onda láser adecuados de anticuerpos utilizados (Figuras 3D-E). </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Examen de las culturas 3D mediante inmunofluorescencia. . A) Un esquema del montaje experimental B) del plato (es) colocado en la bandeja de hielo y de los medios de aspiración; posteriormente las células se lavaron tres veces con 2 ml de PBS frío C) 2 ml de 20% de acetona:. solución de metanol 80% añadido en la cápsula (s) D) Fijar las células para.20 min a 4 ° C (ya sea en hielo, o en un refrigerador). E) 2 ml de 3% de BSA añadido a la placa (s) para bloquear por lo menos durante 30 min a temperatura ambiente. F) Una vez que el 30 min de bloqueo han expirado, añadir los anticuerpos primarios y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente G) Los anticuerpos secundarios disueltos en 3% de BSA (a una dilución apropiada) se añadieron directamente sobre la matriz de membrana basal:. mezcla de células; . posteriormente platos cubrieron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente H) 2 ml de Hoechst (1:10.000; disuelto en PBS) añadido a la platos y cubiertos (es) y las células se incubaron durante 5 min bajo papel de aluminio i) Medio de montaje añade directamente. sobre la matriz: mezcla de células en el plato confocal y el plato se cubre con cubreobjetos de vidrio. Plato (ES) dejó secar durante la noche (o 24 horas) a temperatura ambiente.

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No tenemos nada que revelar.

El desarrollo de técnicas de cultivo de células en 3D ha permitido a los investigadores estudiar la transformación de células epiteliales de mama, lo que nos permite visualizar los dramáticos cambios morfológicos. Además de analizar la invasión de células, los esferoides epiteliales mamarias individuales o multicelulares pueden usarse para evaluar los cambios en la adhesión celular, la proliferación, el tamaño, y la polaridad basal-apical. En contraste con las metodologías reportadas previamente donde las células se sup...

La migración y la invasión de células individuales o colectivos son dos características del cáncer, y necesarios para la diseminación metastásica de células de cáncer de 1-4. La capacidad de las células de los cánceres de iniciar la metástasis depende de su capacidad para migrar e invadir en el tejido vecino usando invadopodia para degradar la membrana basal de las células. Invadopodia son protuberancias degradación de la matriz de actina-rica dinámicos que permiten la degradación de la matriz extracelular a través de la liberación de proteasas que degradan la matriz 5. La invasión de células del cáncer implica la degradación de la matriz, seguido de la migración de las células cancerosas y esto va acompañado por una reorganización del medio ambiente matriz tridimensional (3D) 2. Por lo tanto, para penetrar a través de la matriz, una célula debe transformar su forma y interactuar con la matriz extracelular (ECM) 2. El mantenimiento de la integridad del tejido mamario depende fuertemente controlled arquitectura del tejido desde las uniones célula-ECM y célula-célula de adhesión influyen en la expresión génica y la interrupción de la polaridad epitelial puede conducir a la aparición de cáncer de 6-10. Sin embargo, la mayoría vitro de migración y la invasión ensayos in como transwell ensayos de cámara de ensayos o herida-scratch son de dos dimensiones (2D) y por lo tanto éstos descuidan las intrincadas interacciones entre las células y su entorno adyacente 3,6,8,11-14. Diversidades morfológicas y funcionales considerables tales como las variaciones en la morfología celular, la diferenciación celular, las adherencias célula-matriz y patrones de expresión génica han sido detectadas por el cultivo de células en los cultivos 3D que faltan comúnmente en 2D ensayos 2,6,8,11. Por lo tanto, los usos de los ensayos en 3D están significativamente beneficioso en la recapitulación de una forma más fisiológica en condiciones in vivo, lo que lleva a una mejor transposición de los resultados innovadores en la investigación básica a la clínica 6-10. Sin embargo, hay que señalar, A pesar de las muchas ventajas que se obtienen con el uso de cultivos 3D, este modelo no puede capturar todas las complejidades de la microambiente del tumor in vivo en que incluye diversos tipos de células. Sin embargo, es posible incorporar las células del estroma en los modelos 3D (por ejemplo, fibroblastos, leucocitos, y macrófagos) para estudiar el efecto de las interacciones tumor-estroma sobre la adhesión de células de cáncer y la invasión 15-17. Células epiteliales de mama en cultivo crecen con mayor eficacia cuando las proteínas ECM, como la laminina y el colágeno están presentes. Con esta conocida, una mezcla de la matriz disponible comercialmente se ha derivado de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) del tumor murino y se conoce como matriz de la membrana de Matrigel sótano 2,8. Un número de técnicas se han establecido para hacer crecer células epiteliales como colonias 3D en la matriz de la membrana basal 2,8. El modelo de matriz de membrana basal 3D es eficaz para el establecimiento de células de mama tanto maligno y no malignocrecimiento, parecido a lo que está ocurriendo en el entorno in vivo 18,19. Células MCF10A son células epiteliales mamarias no malignas. Cuando se cultiva en la matriz de la membrana basal, estas células exhiben en los rasgos in vivo de las células normales del seno y se someten a control de la proliferación celular, la polarización celular y la apoptosis de establecer el espacio lumen 8,12,20. Además, la aparición de núcleos celulares de las células MCF10A que forman acinos en cultivos 3D se asemejan más a las de las células epiteliales mamarias en el tejido que las cultivadas en monocapa 21. Los estudios realizados por Bissell y sus colegas fueron los primeros en revelar que las células malignas de mama pueden diferenciarse de células de mama no malignas cuando se cultiva en un entorno de laminina-rica, ya que las células malignas muestran un fenotipo altamente desorganizado, aumento de la proliferación, la disminución de la célula-a- la adhesión celular, aumento de la expresión de marcadores mesenquimales y un aumento en el número de estructura invasiva formaron 3,6,22. Anomalías del entorno celular pueden influir en la formación de tumores 20. El método de cultivo 3D se puede utilizar para estudiar con eficacia la comunicación que se produce entre las células tumorales y su ambiente circundante y determinar cómo influye en la expresión de proteínas tales 14,20,21,23 comunicación. En este artículo se presenta una metodología detallada para crecer MDA-MB-231 células de cáncer de mama en las culturas 3D para analizar la invasividad, y para estudiar la pérdida de la morfología epitelial utilizando un laminina marcadores epiteliales, un componente de la membrana basal de células 18,19,24, 25. Los procedimientos detallados proporcionan la capacidad de cuantificar con precisión y de manera reproducible estrelladas (invasiva) formación de la estructura por cualquier célula de cáncer invasivo y no es limitante para las líneas celulares de cáncer de mama común (tales como MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Por lo tanto, este ensayo puede servir como una plataforma para la evaluación de cómo la expresión de proteínas en las células o el tratamiento con pro-o anti-compuestos invasivos regular degradación de la matriz extracelular, por las células individuales o múltiples.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>CA10011-700</td><td>Estéril, desechable</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 100 mm BD353003</td><td>VWR</td><td>CABD353003</td><td>Estéril, desechable</td></tr><tr><td>15 ml Tubo Falcon</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>Estéril, desechable</td></tr><tr><td>1 ml puntas filtradas</td><td>VWR</td><td>10011-350</td><td>Estéril, desechable</td></tr><tr><td>200 &#956; l puntas filtradas</td><td>VWR</td><td>22234-016</td><td>Estéril, desechable</td></tr><tr><td>20 &#956; l puntas filtradas</td><td>VWR</td><td>22234-008</td> Placas de cultivo Confocal No.1 <td>estériles, desechables</td></tr><tr><td>de 35 mm con fondo de vidrio&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Preenfriado antes de usar</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB003.100</td><td>Utilizado al 3% para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) Anticuerpo IgG (H+L), altamente adsorbido</td><td>cruzado Life Technologies</td><td>&nbsp; A11029</td><td>1:250 para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Cabra Anti-Conejo Anticuerpo IgG (H + L)</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A11011</td><td>1:1,200 para IF</td></tr><tr><td>Anti-Beta-Catenina&nbsp;</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610153</td><td>Mouse-monoclonal; Utilizado a 1:100 para suero</td></tr><tr><td>fetal bovino IF (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>Utilizado al 10% (v/v)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahidrato (bis-Benzimida) - 10 mg&frasl; ml de solución en agua</td><td>Life Technologies</td><td>H3569</td><td>utilizada al 0,1 % (dilución 1:10.000)</td></tr><tr><td>InVivo Analyzer Suite&nbsp;</td><td>Cibernética</td><td></td> de medios <td>Utilizado para imágenes de cultivos en 3D (imágenes DIC a 10X y 40X)</td></tr><tr><td>Kisspeptina-10 (KP-10)</td><td>EZ Biolabs</td><td></td><td>PT0512100601 utilizado a 100 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Laminina&nbsp;</td><td>Cedarlán</td><td>AB19012(CH)</td><td>Conejo-policlonal humano de cuerpo entero; Se utiliza a 1:100 para</td></tr><tr><td>el microscopio de escaneo láser IF LSM-510 META&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Se utiliza en el objetivo de 63X; lente de inmersión en aceite</td></tr><tr><td>Matrigel sin rojo de fenol (BD356237)</td><td>VWR</td><td>CACB356237</td><td>&nbsp; Lote No.2180819; </td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX-81</td> de 10,4 mg/ml&nbsp;<td>Olympus</td><td></td><td>Se utiliza para la obtención de imágenes de cultivo en 3D (imágenes DIC a 10X y 40X)</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Antibiótico (añadido al medio; utilizado al 0,01%)</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 ml</td><td>VWR</td><td>CA53300-523</td><td>Medio estéril y desechable</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Se utiliza para el cultivo de células</td></tr> <tr><td>MDA-MB-2310,25% Tripsina-EDTA (1x), Rojo de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td>Se utiliza para tripsinizar células MDA-MB-231</td></tr><tr><td>MEGM (kit de bala): MEBM (CC3151)+Citas simples (CC4136)</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MCF10A</td></tr></tbody></table>

la cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama el uso de un modelo (3d) tres dimensiones

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Ahora es bien conocido que el microambiente celular y tisular son reguladores críticos que influyen en la iniciación del tumor y la progresión. Por otra parte, la matriz extracelular (ECM) se ha demostrado que es un regulador crítico de comportamiento de las células en cultivo y la homeostasis in vivo. El enfoque actual de cultivo de células en dos dimensiones (2D), las superficies de plástico resulta en la alteración y la pérdida de interacciones complejas entre las células y su microambiente. Mediante el uso de tres dimensiones (3D) de ensayos de cultivo, se establecieron las condiciones para la interacción de células-microambiente se asemeja a la microentorno in vivo. Este artículo proporciona una metodología detallada para hacer crecer células de cáncer de mama en una matriz de proteína de membrana basal 3D, que ejemplifica el potencial de la cultura 3D en la evaluación de la invasión de células en el medio ambiente circundante. Además, se discutirá cómo estos ensayos 3D tienen el potencial para examinar la pérdida de señalización molecdulos que regulan la morfología del epitelio mediante inmunotinción procedimientos. Estos estudios ayudan a identificar importantes detalles mecanicistas de los procesos que regulan la invasión, necesarios para la propagación del cáncer de mama.

Un ejemplo de las células MDA-MB-231 invasores en la matriz 3D se ilustra en la Figura 3C. Las células están incrustadas en la matriz (Día 1), y se empiezan a formar (estrelladas) estructuras invasoras por Día 3, y completamente invaden la matriz por el día 5 (Figura 3C). El número de colonias formadas estrelladas se cuentan, y se expresó como un porcentaje del número total de colonias por placa (invasivos y no invasivos). Además, ya que las mediciones se realizan al día durante los cin...

Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar la capacidad invasiva de células cancerosas mediante un ensayo de invasión tridimensional. Esto se logra primero cultivando células cancerosas en una matriz de membrana basal. Luego, se observa la invasión celular de la matriz durante cinco días o más mediante microscopía óptica.En el paso final, las células se etiquetan con anticuerpos fluorescentes para la localización de las proteínas de interés. En última instancia, la tasa de invasión de las células cancerosas y los cambios resultantes en la expresión proteica pueden analizarse mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes, como el ensayo de invasión en cámara Transwell, es que el ensayo de invasión en gel tridimensional simula mejor el entorno in vivo en el que crece el cáncer.La implicación de esta técnica radica en la terapia contra el cáncer, donde pueden identificarse nuevas proteínas en estudio que participan en la invasión y metástasis del cáncer. Antes de comenzar el procedimiento de cultivo, coloque la matriz de membrana basal, una pipeta P200 y puntas de pipeta sobre hielo durante la noche a cuatro

quantification-breast-cancer-cell-invasiveness-using-three

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Los modelos de la invasión de células tumorales en tres dimensiones de la matriz extracelular para reflejar mejor...

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

Este video proporciona una metodología detallada para cultivar células de cáncer de mama en una matriz de proteínas de membrana basal en 3D, ejemplificando el potencial del cultivo 3D en la evaluación de la invasión celular en el entorno circundante.

Ensayo de membrana basal de cultivo en 3D: cultivo de células cancerosas en matriz de proteínas de membrana basal en 3D para estudiar la invasión celular

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Demostramos un método para generar sustitutos de cáncer de mama en 3D, que se pueden cultivar utilizando un sistema de biorreactor de perfusión para suministrar oxígeno y nutrientes. Después del crecimiento, los sustitutos se fijan y se procesan en parafina para la evaluación de los parámetros de interés. Se explica la evaluación de uno de estos parámetros, la densidad de celdas.

Preparación y análisis de<em&gt; In Vitro</em&gt; Tres de mama Carcinoma de dimensiones Surrogates

Las células cancerosas se incrustan en un gel de colágeno y luego se intercalan en un gel de fibrina acelular para generar un sistema de cultivo 3D en el que se puede monitorear la invasividad y la formación de tumores satélite.

Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Aprende a cuantificar la invasión de células de cáncer de mama mediante ensayos tridimensionales con matriz de membrana basal. Este método permite analizar cambios en la expresión proteica durante la metástasis.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

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