La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar la capacidad invasiva de las células cancerosas mediante un ensayo de invasión tridimensional. Esto se logra cultivando primero células cancerosas en una matriz de membrana basal. A continuación, se observa la invasión celular de la matriz durante cinco o más días mediante microscopía óptica.

En el paso final, las células se marcan con anticuerpos fluorescentes para la localización de las proteínas de interés. En última instancia, la tasa de invasión de células cancerosas y los cambios resultantes en la expresión de proteínas se pueden analizar mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como el ensayo de invasión en cámara de Transwell, es que el ensayo de invasión de gel mayor en 3D imita mejor el entorno in vivo que resuelve el cáncer al crecer.

La implicación de esta técnica es hacia la terapia del cáncer, donde se pueden identificar nuevas proteínas en estudio, que están involucradas en la invasión del cáncer y la metástasis. Antes de comenzar el procedimiento de cultivo, coloque la matriz de la membrana basal una pipeta P 200 y las puntas de pipeta en hielo durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, use la punta de la pipeta helada de 200 microlitros para esparcir 50 microlitros de la matriz en un patrón en espiral sobre el fondo de un plato confocal con fondo de vidrio número uno.

A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos 30 minutos mientras la matriz se somete a la solidificación con ojos de tripsina, una placa de células de 100 milímetros confluente del 70 al 80% una vez que las células han comenzado a desprenderse. Inactive la tripsina con 10 mililitros de medio y luego transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células durante tres minutos a 100 G y cuatro grados Celsius mientras las células giran hacia abajo.

Alícuota 50 microlitros de matriz en un tubo de microcentrífuga de un mililitro por plato de matriz de membrana basal, y coloque los tubos en hielo cuando las células hayan terminado de girar. Aspire el sobrenadante sin alterar el pellet y luego resus. Suspenda las células en un mililitro de medio y cuéntelas a continuación.

Transfiera 2,5 veces 10 a la cuarta celda en un nuevo tubo de microcentrífuga que rellena la suspensión de la celda con medios hasta un volumen final de 50 microlitros. Luego agregue los 50 microlitros de matriz de membrana basal helada a las celdas en una proporción de uno a uno para un volumen final de 100 microlitros. Coloque suavemente la mezcla de matriz a célula en la matriz de membrana basal solidificada y permita que las células se incrusten en la matriz en la incubadora de cultivo celular.

Después de 30 minutos, cubra la matriz con dos mililitros de medio y vuelva a colocar el plato en la incubadora, cambiando el medio todos los días durante la duración del experimento, use el objetivo de 10 x de un microscopio óptico una vez al día durante la duración del experimento para tomar 20 interferencias diferenciales. Imágenes contrastadas de las colonias suspendidas en la matriz de la membrana basal. Analice las imágenes a ciegas para determinar la formación de colonias celulares estrelladas.

Se considera que una colonia es estrellada si se observan una o más proyecciones del esteroide de las células. Para examinar las características morfogénicas de las colonias 3D, retire las células de la incubadora y colóquelas en una bandeja de hielo. Aspire el medio y luego lave la colonia tres veces con dos mililitros de PBS frío.

Después del último lavado, fije las celdas en dos mililitros de solución de 20% de acetona y 80% de metanol durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y luego vuelva a colocar los platos a temperatura ambiente. Una vez que la matriz de la membrana basal esté a temperatura ambiente, aspire el fijador y lave la placa tres veces con PBS como se acaba de demostrar. Después del lavado final, bloquee cualquier unión inespecífica en las células con dos mililitros de 3%BSA durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, incubar las células en los anticuerpos primarios de interés diluidos en BSA al 3% a temperatura ambiente. Después de una hora, retire la solución de anticuerpo primario después de lavar el anticuerpo primario no unido tres veces con PBS, agregue el anticuerpo secundario disuelto en BSA al 3% en la dilución adecuada e incube las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar el anticuerpo secundario no unido con PBS, tiñe los núcleos de las células en dos mililitros de hext 3, 3, 2, 5 8 en PBS durante cinco minutos en la oscuridad.

A continuación, lave el hext libre de las celdas cinco veces con PBS. Después del quinto lavado, agregue el medio de montaje directamente sobre la mezcla de matriz a celda y cubra cuidadosamente el medio de montaje con un cubreobjetos de vidrio para evitar interrupciones en la integridad de la mezcla de matriz de membrana basal a celda. Seque el plato durante la noche a temperatura ambiente, luego adquiera imágenes con un microscopio fluorescente en las longitudes de onda láser apropiadas para los anticuerpos utilizados en estas imágenes.

Se ilustran las células MDA MB 2 3 1 que invaden una matriz 3D. Las células se incrustaron en la matriz el primer día y comenzaron a formar estructuras estrelladas invasivas al tercer día. Al quinto día, se pudo observar una invasión completa de la matriz.

A continuación, se contó el número de colonias estrelladas formadas y se expresó como porcentaje del número total de colonias invasoras y no invasivas por plato. Además, dado que las mediciones se completaron diariamente durante cinco días, también se pudo evaluar la tasa de invasión en estas imágenes inmunofluorescentes. Las colonias estrelladas invasivas representativas de las células MDA MB 2 3 1 que muestran una pérdida de integridad de la membrana y una localización difusa de la proteína laminina cinco de la membrana basal se muestran en marcado contraste con lo que se observa en las células de cáncer de mama MDA MB 2 31.

La laminina cinco se localizó en una capa intacta de la membrana basal que encerraba la memoria de las células MCF 10 A no malignas no tratadas. Después de este procedimiento, se puede realizar un cocultivo con células estromales para responder a preguntas adicionales, como si las células cancerosas se cruzan con las células estromales en el microambiente después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la invasión y la migración del cáncer, las cuales son necesarias para la propagación metastásica de las células cancerosas.