Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

El objetivo general de este procedimiento es realizar la inyección de células muertas o ADN en corazones de ratones embrionarios. Con el fin de investigar la grasa celular o manipular localmente la expresión génica, esto se logra diseccionando primero los embriones de un ratón preñado y exponiendo el corazón embrionario. A continuación, se inyectan células o tintes de ADN en la región objetivo de interés en el corazón.

Luego, después de incubar el embrión, se extrae el corazón y se coloca en cultivo. Finalmente, el destino de las células inyectadas o marcadas se determina mediante microscopía. En última instancia, el destino de las células inyectadas, marcadas o modificadas genéticamente se monitorea mediante microscopía confocal o microscopía de luz y epifluorescencia, lo que revela la importancia funcional de genes y células específicos durante el desarrollo cardíaco.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la transgénesis en ratón, es que podemos inyectar localmente y con precisión células de laboratorio o modificadas genéticamente in vivo. Esto permite la investigación de estas células en el entorno adecuado. Para demostrar este procedimiento estaremos Emily aar y yo, una estudiante de doctorado de un laboratorio.

Después de preparar el equipo, los reactivos y las soluciones, de acuerdo con el protocolo de texto, recoja los embriones E 9.5 y E 10.5 de una ratona embarazada sacrificada utilizando primero etanol al 70% para esterilizar el tórax, haga una incisión ventral en la línea media para abrir el abdomen y recupere el cuerno uterino antes de transferirlo a PBS a temperatura ambiente. Después de dos lavados adicionales en PBS, transfiéralo a una placa de Petri rellena de silicona. Con el medio M 16, use alfileres de insectos para sujetar el cuerno uterino a la capa de silicona de modo que el lado vascularizado del útero quede debajo.

A continuación, utilice unas pinzas finas para cortar la superficie del útero y tapar el caducifolio a un milímetro por debajo de la superficie. Extienda las paredes de la decidua y recupere suavemente el embrión en el saco vitelino. Guárdelo en M 16, medio a 37 grados centígrados antes de la inyección celular para llevar a cabo las inyecciones.

Primero, use una jeringa Hamilton para llenar una pipeta de vidrio desde la parte posterior con ADN o células, y agite la pipeta para eliminar las burbujas. En la punta, coloque la pipeta en el soporte de microinyección y ajuste el inyector de acuerdo con los siguientes ajustes. A continuación, sujete el embrión al fondo de silicona a través del saco vitelino sin tocar el embrión propiamente dicho.

Luego identifica la región del corazón y abre el saco justo encima de esta región. Agregue cuatro alfileres alrededor del embrión para evitar cualquier movimiento durante la inyección de células. Usando el micromanipulador configurado en manual, coloque lentamente la punta de la pipeta en un ángulo de 45 grados por encima del pericardio, justo por encima de la región del corazón que se va a inyectar.

Mueva la pipeta a la región de interés, active la inyección y extraiga la pipeta lo más rápido posible. Asegúrese de que el corazón esté latiendo correctamente después de la inyección de ADN o células. Utilizando el protocolo de inyección descrito en este video para estudiar la transición epitelial a mesénquima y E 9.5 A VC explan se inyectó un S-H-R-N-A que regula a la baja una proteína necesaria para la transición mesenquimal endotelial de las células endocárdicas. El embrión control se inyectó con un vector de columna vertebral vacío, asimismo, se inyectaron células endoteliales prevalvulares derivadas de células HUES que expresaban GFP bajo el control del promotor SOX nine en el A VC a E 10.5, seguido de 48 horas de cultivo cardíaco explantado.

Estas células adquieren marcadores de EMT, como la periostina, similar a las células endocárdicas endógenas. Los enfoques ex vivo mostrados aquí son relativamente fáciles, pero limitados a un seguimiento máximo a corto plazo de 48 a 72 horas. Sin embargo, el procedimiento de inyección guiada por ecografía descrito en el protocolo de texto proporciona un enfoque técnicamente más desafiante, pero con la opción de un seguimiento intrauterino prolongado, incluso postnatal.

Aquí se muestra la inyección intrauterina de colorante o vectores virales para marcar células en regiones cardíacas específicas. Con este método, se puede lograr un marcaje específico de las células epicárdicas con tintes fluorescentes o virus, y el método se puede ampliar con células o inyectables alternativos. Seguir este procedimiento tiene un método como el cultivo de brio que se puede realizar para responder preguntas adicionales como el efecto a largo plazo de un gen, una molécula o la lectura de la lista larga, como la morfogénesis del tejido después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la biología del desarrollo cardíaco y la genética. Nos permite explorar el mundo de los nuevos genes, así como investigar el destino de las células humanas en el contexto embrionario adecuado. Esto es muy útil cuando no se dispone de una línea de ratones transgénicos.