A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes de inmunofluorescencia intravital del oído de ratones portadores de melanoma para estudiar la dinámica de los componentes de la matriz del tejido tumoral. Esto se logra inoculando primero una oreja de ratón con GFP que expresa células de melanoma B 16 F 10. La siguiente cirugía se realiza en la oreja del ratón con el fin de separar la piel de la oreja ventral de la dorsal y exponer el tejido tumoral.

A continuación, se realiza una inmunotinción en el tejido expuesto de la oreja dorsal. Por último, el animal se prepara para la obtención de imágenes intravitales. En última instancia, la microscopía estereoscópica fluorescente o microscopía multifotónica se utiliza para mostrar la localización y el comportamiento dinámico de las células tumorales y sus componentes de la matriz.

La principal ventaja de esta técnica en comparación con los otros métodos de imagen en vivo es que podemos obtener imágenes de las interacciones dinámicas de las células tumorales con las células estromales asociadas, como las células inmunitarias, pero en el contexto de la matriz fibrilar y de malla extracelular. Por lo tanto, este método puede ayudarlo a abordar preguntas clave en el campo de la biología tumoral, como cómo interactúan las células tumorales con su microambiente físico, lo que a su vez puede proporcionar información importante sobre cómo progresan los tumores. Parte del procedimiento será demostrada por Vita Kki, un científico senior de nuestro laboratorio: Para preparar las células tumorales para la inyección, comience cultivando células de melanoma B 16 F 10 GFP.

Después de centrifugar las células, transfiéralas a un tubo de einor de 1,5 mililitros y vuelva a centrifugar, retire todo el sobrenadante excepto una fina capa de medio que queda justo encima del pellet, vuelva a suspender las células en una suspensión celular espesa junto para cargar la suspensión celular en un volumen de 10 microlitros. Jeringa Hamilton. Retire la tapa de la punta de una aguja de calibre 33 adjunta y cargue 20 microlitros de la lechada en la parte superior de la cámara de la punta.

A continuación, tire del émbolo hacia atrás hasta que se carguen cinco microlitros de lodo dentro de la jeringa. Después de anestesiar un ratón C 57 black six con anestesia inyectable, afeitar la cabeza del ratón, detetar los pelos de la cabeza y alrededor de la oreja y enjuagar con agua. Con cinta adhesiva, fije el borde proximal de la oreja en la punta de un dedo índice.

Inserte la aguja de la jeringa Hamilton entre la dermis dorsal y el cartílago de la oreja de un ratón C 57 negro seis penetrando en la oreja proximal a distal durante aproximadamente dos o tres milímetros. Inyecte la suspensión celular y retire lentamente la aguja de la piel. Deje que las células tumorales formen un tumor sólido en el transcurso de siete a nueve días, utilizando un microscopio de fluorescencia para seguir el crecimiento del tumor.

Después de usar una mezcla de oxígeno humidificado e iso flúor para anestesiar el ratón, colóquelo en una almohadilla térmica de 37 grados centígrados y realice un suave pellizco en el dedo del pie. Para confirmar que el animal está suficientemente anestesiado. Aplique ungüento oftálmico en los ojos y mantenga al ratón sobre una almohadilla térmica controlada por termistor rectal durante todo el procedimiento.

A continuación, coloque suavemente la oreja portadora del tumor sobre una pila de portaobjetos de vidrio. Luego use pequeñas tiras de cinta adhesiva para fijar los bordes anterior y posterior de la oreja a la pila con un bisturí, corte la piel ventral de la oreja a lo largo de la antihélice del pabellón auricular del ratón. Retira las cintas de la oreja con la ayuda de unas pinzas curvas.

Despegue suavemente la dermis ventral y el cartílago de la dermis dorsal. Utilice el tampón de timbre para lavar el oído y llevar a cabo la tinción inmunofluorescente. Aplique anticuerpos primarios dirigidos a las moléculas de la matriz extracelular en un tampón de bloqueo en el oído expuesto y coloque un cubreobjetos en la parte superior.

Incubar durante 15 minutos antes de usar aproximadamente cinco mililitros de tampón ringers para lavar la oreja dos veces. Aplique los anticuerpos secundarios apropiados o el estreptococo Adén en el tampón de bloqueo. Aplique un cubreobjetos e incube durante 15 minutos antes de lavar dos veces. Como antes, doble el área dérmica abierta en el conki EM mencia y use toallitas estériles para secar la dermis externa de la oreja sin abrir.

Coloque la oreja sobre una pila de portaobjetos de vidrio y aplique 0,5 microlitros de pegamento quirúrgico en los bordes dorsales anterior y posterior para inmovilizarla y obtener imágenes a corto plazo de dos horas o menos. Agregue tampones estériles recién preparados como amortiguadores de sorbato sobre la oreja inmovilizada y aplique un cubreobjetos. A continuación, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente con dos lentes para obtener imágenes del oído.

Para la obtención de imágenes a largo plazo. Coloque la salida de una aguja conectada a un depósito que contiene un timbre de sorbato debajo de la cubierta a aproximadamente 0,5 centímetros de distancia de la oreja. Utilice una bomba peristáltica a una velocidad de un microlitro por minuto para suministrar constantemente el tampón a la cámara.

Abra el software de adquisición. Ajuste la ganancia, la intensidad de fluorescencia, el aumento y el tiempo de exposición de la imagen, varios campos que contienen células tumorales, así como proteínas de la matriz extracelular teñidas para realizar imágenes intravitales mediante microscopía multifotónica con grasa de silicona. Empezando por la base de la oreja.

Construye una pared circular de unos dos centímetros de diámetro y de dos a tres milímetros de altura alrededor de la oreja. Rellena el círculo con un timbre de sorbato. Coloque el mouse en el escenario sobre una almohadilla térmica, configurada a 37 grados centígrados y configure los ajustes del microscopio de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se muestra en esta figura, se pueden distinguir muchas estructuras en función de su morfología después de la inmunotinción. En el caso de los componentes de la membrana basal, como el colágeno cuatro o el proleano, lo más importante son las proteínas estructurales que normalmente no pueden ser detectadas por SHG. Se puede visualizar el método clásico de detección de matrices.

Por ejemplo, encontramos que las decenas y C se depositan en diferentes lugares del estroma tumoral a partir de las fuerzas de colágeno fibrilar que se desarrollan dentro del microambiente tumoral pueden conducir a la expansión o contracción de la matriz tumoral y, como consecuencia, a una remodelación de la vasculatura tumoral similar a la cicatrización de heridas. Aquí demostramos que podemos realizar microscopía de lapso de tiempo de dos fotones, mientras simultáneamente obtenemos imágenes de tenas inmunomarcadas y matriz C con un fotoblanqueo mínimo de cuatro fluorados, incluso en microscopía de alta densidad de fotones a fotones. En este video, las células tumorales que se superpusieron en la dermis expuesta preteñidas para el colágeno cuatro se adhirieron al tejido y en grupos comenzaron a migrar colectivamente a lo largo de la membrana basal de los vasos sanguíneos y los sitios adiposos.

Una vez dominado, todo el procedimiento de apertura del oído y la inmunotinción dura dos horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la tinción inmunovital para estudiar las interacciones de la matriz celular en tumores mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.