Terapia basada en células de la insuficiencia cardiaca en rata: Doble toracotomía para infarto de miocardio y epicardio implantación de células y Biomatrix

El objetivo de este procedimiento es realizar una doble toracotomía en ratas con el fin de realizar la ligadura coronaria y la aplicación epicárdica. Esto se logra realizando primero una toracotomía en el cuarto espacio intercostal. A continuación, se liga la arteria coronaria descendente anterior izquierda o LAD.

Luego, se realiza una segunda toracotomía dos semanas después en el quinto espacio intercostal. Finalmente, las células y la matriz se aplican a la superficie del corazón latiendo infartado. En última instancia, la ecocardiografía se realiza para evaluar la función cardíaca y la histología se lleva a cabo mediante mediciones del tamaño del infarto.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la esternotomía es que se trata de un abordaje mínimamente invasivo, lo que demuestra que el procedimiento será un tratamiento mínimamente invasivo. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones de la F-E-L-A-S-A y la Ley suiza de protección animal. Después de desangrar a una rata y aislar y limpiar los huesos del fémur de acuerdo con el protocolo de texto, use tijeras para cortar ambas puntas de los huesos.

Luego, para lavar la médula ósea, inyecte PBS estéril en el núcleo del hueso y recoja la médula en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la médula ósea recolectada durante siete minutos a 300 veces G. Retire el supinato con tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Suspender el pellet, incubar la suspensión durante un minuto a temperatura ambiente antes de volver a girar durante siete minutos a 300 veces G después del resus.

Suspensión del pellet en medio de cultivo estéril. Agregue medio de cultivo celular adicional en un matraz de cultivo de 150 mililitros y siembre las células en el segundo día de incubación. Cambie el medio para eliminar las células que no se adhieren y continúe reemplazando el medio cada dos días durante dos o tres semanas hasta que se logre la densidad celular deseada.

Para llevar a cabo la primera toracotomía T, comience pesando la rata y configure los parámetros del ventilador en consecuencia. El caudal de ventilación se define automáticamente. A continuación, afeita la parte izquierda del tórax, enciende una almohadilla térmica y ajústala a 37 grados centígrados.

Después de anestesiar a la rata de acuerdo con el protocolo de texto, realice un pellizco en el dedo del pie o de la cola antes de colocar a la rata en la almohadilla térmica en posición supina con un catéter intravenoso de calibre 14, intuble al animal y luego conecte el catéter de intubación a un ventilador para roedores. Programado para 2,5 litros por minuto de oxígeno, 2,5% de flúor, un volumen corriente de dos mililitros y una frecuencia respiratoria de 90 respiraciones por minuto. Después de preparar una jeringa con buprenorfina 0,1 miligramos por kilogramo por vía subcutánea, inyecte un tercio de la solución, luego use una solución de Betadine al 1% para desinfectar el área.

A continuación, incidir la piel perpendicular al esternón del cuarto espacio intercostal y separar las tres capas de músculo torácico. Luego abra el cuarto espacio intercostal entre las costillas cuatro y cinco. Use un retractor pequeño para separar las costillas y exponer el corazón.

A continuación, abra con cuidado el pericardio y localice la arteria coronaria descendente anterior izquierda o LAD, y utilice una sutura 7.0 para ligarla cuatro milímetros por debajo de la aurícula. A continuación, controle el cambio de color de la zona isquémica con tres suturas cero colocadas aproximada y distalmente desde el esternón. Hacer dos puntos que se utilizarán para cerrar el espacio intercostal.

Apriete la sutura distal. Sujete el tubo de escape del ventilador durante dos segundos para inflar el tórax y evitar el neumotórax. A continuación, apriete la segunda sutura.

Vuelva a colocar las capas musculares en su lugar. A continuación, utilice cinco suturas cero para cerrar la piel con una solución de Betadine al 1%. Desinfecte la sutura e inyecte el resto de la solución de buprenorfina.

Apague el sistema de anestesia y retire el catéter de intubación. Mantenga a la rata en una jaula bajo una lámpara caliente durante una o dos horas antes de devolverla a una unidad de VCI. Dos semanas después de la primera toracotomía, la cicatrización es completa y la cicatriz es apenas visible.

Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en este video para preparar a la rata para la cirugía, haga una incisión en la piel perpendicular al esternón en el quinto espacio intercostal. Separa las tres capas de músculo y abre el quinto espacio intercostal entre las costillas cinco y seis. Use un retractor pequeño para separar las costillas y exponer el corazón.

Si hay alguna adherencia, use pinzas finas para aliviarla cuidadosamente. A continuación, ubique el área del infarto que aparece como un área pálida debajo de la ligadura. Si es necesario, inserte una pieza de 10 centímetros de siete sutura cero en el ápice y tire de ella suavemente para visualizar mejor el ventrículo izquierdo.

A continuación, aplicar las células y la matriz en la superficie de la zona isquémica del corazón. Después de la granulación, cuatro veces 10 a las seis celdas como se describe en el protocolo de texto, deposite la paleta en el corazón antes de usar un sellador de fibrina para cubrirlo. La capa de pegamento fija las células a la superficie del corazón.

Después de retirar la pieza de sutura de la posición del ápice, el músculo vuelve a colocar la sutura en su lugar y desinfecta al animal. Como se demostró anteriormente en el video, como se muestra aquí. Después de la intervención quirúrgica, los animales perdieron peso y se recuperaron rápidamente antes de aumentar de peso independientemente del tratamiento aplicado. Como se muestra en este gráfico de Kaplan, la tasa de supervivencia es alta después de la primera toracotomía T, los animales tratados con fibrina y/o células demostraron tasas de supervivencia más bajas que otros grupos como se observa en este gráfico.

Sin embargo, las tasas de supervivencia general se mantuvieron altas después de un segundo. La toracotomía y el tratamiento de la función cardíaca se evaluaron mediante ecocardiografía. Estas imágenes representativas del modo M para animales sanos e infartados ilustran que la contractilidad de la pared del VI se elimina dos semanas después de la ligadura de la LAD, se registró un acortamiento fraccionado dos semanas después de la LAT en un total de 104 animales.

La distribución de frecuencias muestra métodos razonablemente reproducibles con un coeficiente de variación del 17%Esta figura representa gráficamente la función cardíaca mediante la fracción de eyección medida dos y seis semanas después de la LAD lación La función cardíaca continúa disminuyendo durante este período de tiempo. La remodelación del corazón también ocurre durante este período y está representada aquí por un aumento en los volúmenes del VI registrado tanto en la hermana como en la diástole. Finalmente, la tinción dorada en secciones del corazón reveló que el tejido fibrótico y, finalmente, una cicatriz transmural se desarrollaron seis semanas después de la ligadura de la DA. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 a 40 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una toracotomía doble mínimamente invasiva.