Terapia basada en células de la insuficiencia cardiaca en rata: Doble toracotomía para infarto de miocardio y epicardio implantación de células y Biomatrix

El objetivo de este procedimiento es realizar una doble toracotomía en ratas para llevar a cabo la ligadura coronaria y la aplicación epicárdica. Esto se logra primero realizando una toracotomía en el cuarto espacio intercostal. A continuación, se realiza la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda o LAD.

Luego, se realiza una segunda toracotomía dos semanas después en el espacio intercostal quinto. Finalmente, las células y la matriz se aplican sobre la superficie del corazón infartado en funcionamiento. En última instancia, se realiza ecocardiografía para evaluar la función cardíaca y se lleva a cabo histología mediante la medición del tamaño del infarto.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la esternotomía es que se trata de un enfoque mínimamente invasivo; demostrar el procedimiento será y enviará colaboradores desde nuestro laboratorio. Todos los animales fueron tratados en cumplimiento con las recomendaciones de la F-E-L-A-S-A y la Ley Suiza sobre protección animal. Después de exsanguinar una rata y aislar y limpiar los huesos del fémur según el protocolo descrito, utilice tijeras para cortar ambos extremos de los huesos.

Luego, para lavar la médula ósea, inyecte PBS estéril en el interior del hueso y recoja la médula en un tubo de 15 mililitros. Centrifugue la médula ósea recolectada durante siete minutos a 300 ×g. Retire el sobrenadante y añada tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Suspenda el sedimento, incube la suspensión durante un minuto a temperatura ambiente y luego centrifugue nuevamente durante siete minutos a 300 ×g tras la resuspensión.

Suspender el sedimento en medio de cultivo estéril. Añadir medio adicional de cultivo celular en un matraz de cultivo de 150 mililitros y sembrar las células al segundo día de incubación. Cambiar el medio para eliminar las células no adherentes y continuar reemplazando el medio cada dos días durante dos o tres semanas hasta alcanzar la densidad celular deseada.

Para realizar la primera toracotomía T, comience por pesar la rata y configure los parámetros del ventilador en consecuencia. El flujo de salida de la ventilación se define automáticamente. Luego, afeite la parte izquierda del tórax, encienda una almohadilla calefactora y ajústela a 37 grados Celsius.

Después de anestesiar la rata según el protocolo descrito en el texto, realice una compresión en el dedo del pie o en la cola antes de colocar a la rata en posición supina sobre una almohadilla calefactora utilizando un catéter intravenoso de calibre 14, entube al animal y luego conecte el catéter de intubación a un ventilador para roedores. Programado para 2,5 litros por minuto de oxígeno, 2,5 % de isoflurano, un volumen tidal de dos mililitros y una frecuencia respiratoria de 90 respiraciones por minuto. Después de preparar una jeringa con buprenorfina a 0,1 miligramos por kilogramo por vía subcutánea, inyecte un tercio de la solución y luego use una solución de Betadine al 1 % para desinfectar el área.

A continuación, haga una incisión en la piel perpendicular al esternón en el cuarto espacio intercostal y separe las tres capas del músculo torácico. Luego, abra el cuarto espacio intercostal entre las costillas cuatro y cinco. Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y exponer el corazón.

Luego, abra cuidadosamente el pericardio y localice la arteria coronaria descendente anterior izquierda o LAD, y utilice una sutura 7.0 para ligarla cuatro milímetros por debajo del atrio. A continuación, controle el cambio de color del área isquémica con suturas tres cero colocadas aproximadamente y distalmente desde el esternón. Haga dos puntos que se utilizarán para cerrar el espacio intercostal.

Apretar la sutura distal. Pinzar el tubo de escape del ventilador durante dos segundos para inflar el tórax y evitar un neumotórax. A continuación, apretar la segunda sutura.

Coloque las capas musculares de nuevo en su lugar. Luego use sutura de número cero para cerrar la piel con solución de Betadine al 1 %. Desinfecte la sutura e inyecte la solución restante de buprenorfina.

Apague el sistema de anestesia y retire el catéter de intubación. Mantenga la rata en una jaula bajo una lámpara caliente durante una a dos horas antes de devolverla a una unidad IVC. Dos semanas después de la primera toracotomía, la cicatrización está completa y la cicatriz es apenas visible.

Después de seguir el procedimiento descrito anteriormente en este video para preparar la rata para la cirugía, haga una incisión en la piel perpendicular al esternón en el espacio intercostal quinto. Separe las tres capas musculares y abra el espacio intercostal quinto entre las costillas cinco y seis. Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y exponer el corazón.

Si hay alguna adherencia, utilice pinzas finas para aliviarla cuidadosamente. A continuación, localice el área de infarto que aparece como una zona pálida por debajo de la ligadura. Si es necesario, inserte un trozo de 10 centímetros de sutura siete ceros en el ápice y tire suavemente de ella para visualizar mejor el ventrículo izquierdo.

Luego, aplicar las células y la matriz sobre la superficie de la zona isquémica del corazón. Después de la centrifugación, depositar cuatro veces 10 a la seis células, como se describe en el protocolo del texto, sobre el corazón antes de cubrirlo con un sellador de fibrina. La capa de pegamento fija las células a la superficie del corazón.

Después de retirar el trozo de sutura de la posición apical, suturar nuevamente las capas musculares, colocarlas en su lugar y desinfectar al animal. Como se demostró anteriormente en el video, que se muestra aquí. Después de la intervención quirúrgica, los animales perdieron peso y se recuperaron rápidamente antes de ganar peso, independientemente del tratamiento aplicado. Como se muestra en esta gráfica de Kaplan, la tasa de supervivencia es alta después de la primera toracotomía; los animales tratados con fibrina y/o células mostraron tasas de supervivencia más bajas que los otros grupos, tal como se observa en esta gráfica.

Sin embargo, las tasas de supervivencia general se mantuvieron altas tras una segunda intervención. La función cardíaca tras la toracotomía y el tratamiento se evaluó mediante ecocardiografía. Estas imágenes representativas en modo M de animales sanos y con infarto ilustran que la contractilidad de la pared del VI queda abolida dos semanas después de la ligadura de la AD. La fracción de acortamiento se registró dos semanas tras la ligadura de la AD en un total de 104 animales.

La distribución de frecuencia muestra métodos razonablemente reproducibles con un coeficiente de variación del 17 %. Esta figura muestra la representación gráfica de la función cardíaca mediante la fracción de eyección medida a las dos y seis semanas posteriores a la ligadura de la LAD. La función cardíaca continúa disminuyendo durante este período. La remodelación cardíaca también ocurre durante este tiempo y se representa aquí mediante un aumento en los volúmenes del VI registrados tanto en sístole como en diástole. Finalmente, la tinción con tricrómico de Masson en secciones cardíacas reveló que se desarrolló tejido fibroso y, eventualmente, una cicatriz transmural a las seis semanas posteriores a la ligadura de la LAD. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 a 40 minutos si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una doble toracotomía mínimamente invasiva.