Name: MEJOR: Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprende el método BEST para aislar y analizar tétradas de levadura mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Esta técnica automatizada mejora la eficiencia en la generación de progenie recombinante.

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Este trabajo fue apoyado por una concesión de NIH / NHGRI Genoma Académico / Facultad de Transición (K22 HG002908) de AMD y una asociación estratégica entre el Instituto de Biología de Sistemas y la Universidad de Luxemburgo. Las solicitudes de las cepas o plásmidos se deben dirigir a Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Strain Construcción y caracterización <ol><li> Construir la cepa diploide heterocigótico para ser utilizado en la cruz en el apareamiento de cepas haploides y diploides seleccionar 2 o el uso de una cepa heterocigótica de origen natural. Las cepas no deben albergar GFP. </li><li> Confirme que la cepa es incapaz de crecer en YPD 2 + 200 mg / ml de G418. </li><li> Confirme que la cepa es capaz de esporulación. BEST es compatible con cruces de baja eficiencia esporulación, pero requiere aumentar la frecuencia baja esporulación FACS tiempo de clasificación. <ol><li> Establecer un cultivo O / N de la cepa en 5 ml de YPD y crecer con agitación a 30 ° C. </li><li> Lavar 0,5 ml del cultivo O / N tres veces con PBS (pH 7,4). </li><li> Sedimenten las células lavadas, separar el sobrenadante y volver a suspender en 2 ml de medio de esporulación 7. </li><li> Agite las células a temperatura ambiente y compruebe diariamente para la formación de cuarteto con un microscopio óptico de contraste de fase con un objetivo de 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimar la viabilidad de las esporas de la cruz por la disección convencional 2,3 de un número pequeño (~ 20) de tétradas. Viabilidad de las esporas en los cruces entre diferentes fondos de deformación es muy variable e impredecible. Sin embargo, las expectativas a priori de viabilidad de las esporas se pueden utilizar para evaluar la eficiencia de un MEJOR experimento antes de los de mano de obra y de alto coste pasos de ahorro y genotipificación de las cepas. Por lo tanto, es muy recomendable este paso. </li></ol> 2. Transformación de diploides con la Biblioteca de Códigos de Barras plásmidos <ol><li> Insertar el plásmido con código de barras pCL2_BC en la cepa diploide heterocigótico usando el protocolo de transformación descrito en Gietz y Woods 8 con las siguientes modificaciones. <ol><li> Después las células han sido incubadas con la mezcla de transformación a 30 º C durante 20 min, se añade DMSO hasta 8% del volumen de la mezcla de transformación. La adición de DMSO se ha encontrado para mejorar la eficiencia de transformación in algunos fondos de deformación 9. </li><li> Después de la etapa de choque térmico, sedimentar las células con una breve centrifugación, se decanta la mezcla de transformación, y lavar las células suavemente en YPD. A continuación, volver a suspender las células en 1 ml de YPD y permitir que se recuperen a temperatura ambiente durante 3 h sin agitación. </li></ol></li><li> Seleccionar los transformantes en placas de YPD en + G418 (200 mg / ml) en placas de agar. Para garantizar una piscina complejo de códigos de barras de plásmido, cosechar un gran número de colonias, por ejemplo, 5 placas con ~ 2500 colonias por placa. </li><li> Una vez que las colonias son visibles (2-3 días de crecimiento a 30 ° C), en común los transformantes raspando cuidadosamente de la placa en líquido YPD + G418 (200 mg / ml) + 15% de glicerol. Vortex esta suspensión celular, transferir a un vial de crioconservación, y congelar a -80 ° C. Hacer una reserva congelada por separado para cada plato. Estas existencias congeladas sirven como las cepas de partida para la etapa 3.1 y también se pueden utilizar para generar más tétradas en una fecha posterior, si se desea. </li&gt; </ol> 3. Esporulantes la Biblioteca de células transformadas obtener Barcoded Tétradas <ol><li> Revive las células de los stocks congelados creados en 2.3 por el crecimiento de O / N en 5 ml de YPD + G418 (200 mg / ml) a 30 ° C con agitación. </li><li> Lavar las células de la O / N culturas 3x en PBS (pH 7,4) y luego volver a suspender las células en medio de esporulación 7 más 200 mg / ml de G418. </li><li> Agite culturas esporulación a TA y monitorear el progreso de esporulación diariamente hasta nuevos tétradas han dejado de formar. </li><li> Una vez que el cultivo contiene tétradas bien formados y relativamente pocos diadas, retire las culturas de la agitación y dejar a temperatura ambiente durante al menos 7 días. Mientras que algunos cruces pueden ser susceptibles a la digestión en placa y la interrupción tan pronto como tétradas se han formado (evaluado como se describe en 7.3), la incubación adicional (7-10 días en nuestros experimentos) es esencial para otros cruces. Por lo tanto, es muy recomendable este paso. </li></ol> 4. Establecerlas Puertas FACS para Tetrad clasificación El meióticamente expresó fusión SPS2-GFP en el plásmido pCL2_BC permite tétradas en la cultura esporulación a ser detectados y aislados del cultivo por fluorescencia. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para una FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS puertas. Una serie de cuatro puertas secuenciales se utiliza para aislar tétradas. Las puertas que se muestran en (A) y (B) ayudan a reducir el número de grupos. Eventos fluorescentes se seleccionan con la puerta en (C). El histograma en (D) tiene dos picos. Eventos en el pico izquierdo son principalmente tétradas (imagen del recuadro de la izquierda), y los acontecimientos en el pico de la derecha son generalmente tétradas con una yema adjunto (imagen de la inserción a la derecha). Una puerta final esaplicado a este histograma para seleccionar los eventos que son en su mayoría tétradas (barras rojas). Esta cifra ha sido modificado desde Ludlow, et al 1. <ol><li> Cargue el cultivo esporulado en un clasificador FACS y la creación de dos de dispersión y la dispersión lateral puertas delanteras para excluir los desechos, las células agrupadas, y varias células por gota (Figuras 2A y 2B). </li><li> No debe haber una población de células fluorescentes, que cuando se utiliza el constructo indicador SPS2-GFP incluyen díadas y tétradas 10. Puerta de la GFP frente a FSC para incluir estos eventos fluorescentes (Figura 2 C). </li><li> Dependiendo de la cepa de fondo puede ser necesario para incluir una puerta adicional para eliminar grumos que incluyen tétradas y otras células. Si esto es necesario, inspeccionar un histograma FSC de los eventos fluorescentes y especifique una puerta que incluye eventos con menor FSC (Figura 2D, eventos cerrados están en rojo). </li><li> Controlar la eficacia de t<html> que gating régimen de clasificación por ~ 1500 tétradas en un portaobjetos de microscopio y contando la proporción de tétradas a los no tétradas usando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400X. El por ciento de tétradas se puede estimar con precisión contando sólo ~ 200 eventos según, pero la clasificación ~ 1500 reduce la cantidad de tiempo de búsqueda de células sobre el portaobjetos de microscopio. Alternativamente, la relación de tétradas a los no tétradas se puede evaluar durante el Paso 4.5. </li><li> Comprobar periódicamente que el clasificador está informando con precisión el número de eventos por clasificación 25 tétradas en un portaobjetos de microscopio y el examen de las células contenidas en la gotita usando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400X. No debe haber 25 tétradas en la gotita. Repetir 3-4x para evaluar la varianza del instrumento de FACS. </li></ol> 5. Sorting Tétradas sobre una placa de agar p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Colocación de la placa de agar en el clasificador FACS. Para ordenar tétradas en una pequeña gota de la solución zimoliasa colocado en el centro de un estándar (circular) placa de agar, un estándar (100 mm rectangular) placa de 96 pocillos es primero colocado en el escenario de la clasificador de células y el clasificador está programado para depositar tétradas en un pozo específico (en este caso D5). Entonces, la placa de agar circular se coloca en la parte superior de la placa de 96 pocillos y se alinea de manera que la gota de zimoliasa está centrado sobre el bien especificado. <ol><li> Calentar el número deseado de placas de YPD + G418 (200 mg / ml) durante al menos 1,5 horas en una incubadora a 37 ° C posicionado cerca de la clasificador FACS. </li><li> Una característica clave del protocolo de clasificación es la capacidad de localizar con precisión FACS tétradas a una ubicación específica en una placa de agar que contiene una piscina de solución zimoliasa. Para ello, coloque un &quot;hito&quot; placa de 96 pocillos en tél automatizado unidad de deposición de células (ACDU) del clasificador. Preparar un diseño de tipo que va a clasificar 25 tétradas en un pocillo de un formato de 96 pocillos. Elija un pozo cerca de la mitad de la placa, por ejemplo, así D5. Figura 3 muestra una placa de Petri y placa de 96 pocillos se cargó en un clasificador de células. Clasificación 25 tétradas por placa produce colonias bien separadas. </li><li> Traiga una pila de 10 placas de agar de la incubadora a 37 º C para el clasificador. </li><li> Tomar una placa de agar de pipeta y 25 l de solución de zimoliasa (1 mg / ml en 0,7 M de sorbitol) sobre el agar cerca del centro de la placa. Luego, coloque la placa en la placa de 96 pocillos de interés, la alineación de la gota zimoliasa sobre el objetivo y desde el paso 5.2, por ejemplo, así D5. </li><li> Iniciar el tipo y depositar 25 tétradas en el medio de la gotita de zimoliasa sobre la placa de agar. Entonces, quite y cubrir el plato. </li><li> Repetir los pasos 5.4 y 5.5 hasta 25 tétradas han sido ordenados en gotitas zimoliasa sobre cada placa de la pila. </li&gt; <li> Devuelva la pila de platos que contienen tétrada-a la incubadora a 37 ° C. </li><li> Repetir los pasos 5.3 a través de 5.7 hasta que todas las placas tienen tétradas. </li></ol> 6. Separación Esporas <ol><li> Incubar cada pila de placas de agar que contiene tétrada-a 37 ° C durante 1,5 h. </li><li> Retire las placas de la incubadora, agregue 15-25 perlas de vidrio estériles de 3 mm por placa, y agitar las placas como una pila (o como dos lotes de 5 unidades) durante 3-5 minutos. La mejor separación de esporas se logra moviendo las placas de forma rígida de lado a lado o de adelante hacia atrás. No mueva las placas de tal manera que la cuentas &quot;swirl&quot; alrededor del borde exterior de la placa. Deje las cuentas en las placas cuando haya terminado. </li><li> Coloque la pila de platos con cuentas boca arriba en una incubadora a 30 ° C. Recuperar los próximos placas de pila de la incubadora a 37 ° C, y repita el paso 6.2. </li><li> Incubar las placas O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Cosecha Colonias <ol><li> Despuésuna incubación O / N a 30 ° C, las colonias pequeñas deben haberse formado en las placas. Retire con cuidado las placas de la incubadora sin molestar a las perlas de vidrio. </li><li> Retire las perlas de vidrio con cuidado e invirtiendo rápidamente las placas sobre un recipiente hondo. El recipiente debe ser lo suficientemente profunda para coger las bolas sin permitir que rebotan hacia arriba y golpear la placa de agar. Al tocar la parte inferior de la placa, mientras que se invierte puede ayudar a desalojar los granos que se pegan a la placa. Estas perlas pueden ser reutilizados por lavado a fondo con jabón, enjuagar bien con agua desionizada y esterilización en autoclave. </li><li> Contar el número de colonias en cada placa y utilizar el número de colonias para estimar la eficiencia de la separación y la recuperación de esporas. Por ejemplo, 25 tétradas por placa de una cruz con cerca de 100% de viabilidad podrían producir un total de 100 colonias por placa. </li><li> Desde placas con un número suficiente de colonias (&gt; 65 por unos cruces de alta viabilidad), células de transferencia de cada coloNY en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos que contiene líquido YPD + G418. Además, tome nota de que los pozos contienen colonias de la misma placa de agar; esta información se utiliza para ayudar al software de asignación de tétrada. </li><li> Utilice las placas de 96 pocillos líquidos para sembrar cultivos para la genotipificación y para el ahorro de cepas como acciones de glicerol congelado. Los detalles de la secuenciación RAD-tag y análisis de la secuencia se pueden encontrar en Ludlow et al 1. </li></ol>

<ol><li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+tetrad+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li>
<li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRose%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+A+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).</li>
<li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+two+types+of+spore+germination%2C+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Trav.+Lab.+Carlsberg+Ser.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li>
<li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspore+bridges%3A+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li>
<li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li>
<li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li>
<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchas de las áreas de investigación de la genética, que van de cartografía rasgo complejo 11 para el estudio de los mecanismos subyacentes de recombinación de ADN 12, requieren un número extremadamente grande de la progenie y los altos volúmenes de secuenciación de ADN. Las técnicas que se casan con el poder de los enfoques convencionales con la capacidad de alto rendimiento de secuenciación de ADN tienen el potencial de permitir estudios que antes eran intratables. Aunque varios métodos de genética de la levadura de alto rendimiento se han aplicado de manera efectiva a los problemas específicos, cada uno tiene limitaciones que no llegan a la amplia aplicabilidad de análisis tétrada convencional. MEJORES enfrenta a estos retos mediante el empleo de un enfoque de alto rendimiento que combina la disección tétrada y genotipificación de la progenie de cruces de levadura. Junto con multiplexado secuenciación RAD-tag, MEJOR ofrece una manera económica de recoger información del genotipo para cada cepa progenie preservando relaciones tétrada por medio de códigos de barras tétrada únicas.0; De utilizarse toda la actualidad métodos de alto rendimiento, MEJOR recapitula más de cerca la información proporcionada por una cruz de levadura disecados manualmente. MEJOR tiene dos características fundamentales. El primero es el uso de FACS para aislar rápidamente tétradas de distancia a partir de células no esporulados en la cultura (Protocolo pasos 5-6). La capacidad de aislar miles de eventos fluorescentes (tétradas) da BEST su mayor ganancia en el rendimiento. Esta automatización ofrece una mayor ventaja sobre la disección manual para cruces con baja eficiencia esporulación, debido al aumento del tiempo necesario para identificar visualmente los eventos raros. La segunda característica clave es el uso de un código de barras molecular altamente complejo (Protocolo Paso 2) que se transmite a cada uno de esporas hermana de una tétrada. Debido a que estos códigos de barras pueden utilizarse para computacionalmente reconstruir las relaciones entre tétrada esporas que se han distribuido aleatoriamente a través de una placa de agar, la necesidad de manualmente las células de la matriz en una red ordenada se alivia. Finalmente,debido a que el código de barras molecular y el gen reportero GFP-esporulación específica están vinculados físicamente (en el mismo plásmido), sólo tétradas que han retenido el código de barras molecular se seleccionan por la separación FACS. Hay dos consideraciones que rigen la longitud de tiempo que los cultivos deben ser incubados en el medio de esporulación. En primer lugar, debido a que el reportero en particular la esporulación (SPS2-GFP) se expresa al principio de la meiosis, solo GFP no distingue completas tétradas 4 de esporas a partir de células que no han completado la meiosis (es decir, las diadas). Mientras gating FACS adicional puede disminuir el número de tétradas, incompletos fluorescentes, la forma más fácil de disminuir estos eventos no deseados simplemente monitoreando la cultura esporulación (Paso 3.3) y proceder una vez nuevos tétradas han dejado de formar. En nuestros experimentos, la frecuencia de díadas según es menos de 1%. En segundo lugar, para algunos cruces tiempo adicional en medio de esporulación a temperatura ambiente sin agitación (Paso 3.4) sigsignificativamente mejora la separación de tétradas por las perlas de vidrio durante chapado ((Protocolo Paso 6). De hecho, este paso es absolutamente necesario para la interrupción de algunos cruzamientos. Al igual que todos los métodos de alto rendimiento, mejor es &quot;ruidosa&quot; que el enfoque convencional correspondiente. La modesta reducción en la eficiencia de BEST en comparación con la disección tétrada convencional podría ser el resultado de combinaciones de varios factores. Un factor es el aumento de la pérdida de esporas viables de otra manera, lo que podría resultar de la adhesión a las perlas de vidrio durante la extensión o aumento de la muerte de esporas debido a los esfuerzos mecánicos del proceso. Un segundo factor que podría ser simple pérdida de plásmido durante la meiosis. Un tercer factor podría ser una disminución efectiva en colonias utilizables resultantes de colonias con genotipos mixtos, se estima que ~ 5% de colonias en nuestro piloto cruza 1. Es probable que estas colonias representan fracasos de la hermana de separación de esporas. Debido a la rápida Fluorescence clasificación y separación de esporas permitir la recolección de un número enorme de tétradas, MEJOR está bien equipado para superar una disminución en la eficiencia en esta escala. Mientras que las versiones futuras de BEST podría aumentar la eficiencia próxima a la de la disección manual, que es tal vez más probable que la actual trayectoria exponencial de la capacidad de secuenciación de ADN compensará rápidamente para este nivel de pérdida de tensión utilizable. En cualquier caso, la capacidad de realizar análisis de tétrada en la escala a la que se puede aplicar mejor permitirá a los estudios que se encuentran actualmente inviable por métodos manuales.

Mapeo de genes meiótica, comúnmente conocida como análisis de tétrada, es central a la genética de la levadura. En resumen, dos cepas haploides, cada uno contienen una sola copia de cada cromosoma, se acoplan para formar una cepa diploide heterocigótico con dos copias de cada cromosoma, uno de cada padre. Morirse de hambre células diploides para el nitrógeno induce meiosis (esporulación) en el que los cromosomas se duplican, se someten a la reordenación, y se dividen en cuatro células haploides (esporas o segregantes) con nuevas combinaciones de alelos de cada padre. Las cuatro esporas resultantes de una sola meiosis se pueden aislar mediante un proceso manual llamado disección tétrada. Tétrada Convencional 2,3 disección que ha cambiado relativamente poco desde la publicación original en 1937 4, tiene tres objetivos. En primer lugar, las células que han sido sometidos a la meiosis (tétradas) deben ser aislados de distancia de un fondo de células vegetativas. En el análisis convencional, esto se logra por un investigador que, utilizandoun microscopio, identifica visualmente tétradas en una placa de agar y emplea un aparato de micromanipulador identificar visualmente tétradas en una placa de agar y utilizando un micromanipulador para mover la tétrada a una zona libre de células de la placa. A continuación, las cuatro esporas en la tétrada deben estar físicamente separados para evitar el apareamiento interspore. Las esporas dentro de una tétrada se mantienen unidas por tanto un asco, el remanente de la pared celular de la célula diploide original, y un conjunto de puentes interspore 5. En el análisis convencional de la tétrada ascus se elimina por digestión enzimática, y un investigador utiliza el micromanipulador para romper los puentes interspore y desmenuzar las esporas. Finalmente, las esporas individuales están dispuestos en un patrón cuadriculado que mantiene la relación entre las esporas, es decir, toda la progenie en una fila de cuatro esporas son hermanas de la misma tétrada originales. Un investigador de la levadura experimentado puede completar el proceso de disección 10 tétradas (un número mínimo de aceptación generalpor la cruz) en aproximadamente 15 min. Hemos desarrollado un nuevo método de genotipificación tétrada de alto rendimiento, lo que llamamos B arcode E nabled S equencing de T etrads (BEST) 1. MEJOR expande sobre los métodos actuales de la genética de alto rendimiento al permitir la generación y el genotipado de un gran número de descendientes que son aislados, genotipo, y mantenidos como individuos de una manera que permite a las relaciones de esporas de la hermana de los cuatro productos meióticos que deben recuperarse. Esto se logra mediante tres estrategias principales (Figura 1). En primer lugar es la introducción de un constructo indicador que marca las células que se han sometido a la meiosis con GFP y les permite ser aislados por células activadas por fluorescencia (FACS). En segundo lugar es la incorporación de un código de barras de ADN altamente complejo (una cadena de 15 nucleótidos aleatorios) en una forma que se transmite a todas las cuatro esporas de una tétrada y puede ser leído por la secuenciación del ADN de la Progen recombinantey por lo identifica esporas hermanas de la misma tétrada. En tercer lugar es el paso de genotipado, y lo mejor es compatible con numerosas plataformas de genotipado que capturan tanto un conjunto de marcadores genómicos, así como el código de barras-tétrada específico. Empleamos un sitio de restricción de secuenciación de ADN asociada a la etiqueta (RAD-ss) 6 método que dirige la secuenciación del genoma de sitios de restricción específicos 1, de ese modo la captura de una coherente 2-3% del genoma de las cepas de la progenie, así como el código de barras plásmido transmitidas . La recuperación de las relaciones tétrada junto con los datos de genotipado obtenida de forma empírica desde la cruz permite la inferencia exacta de la información faltante, incluyendo el estado de los marcadores con baja cobertura de secuencia y el genotipo completo de individuos inviables (y por lo tanto no recuperables). Aquí, se describe la aplicación del método en el microorganismo más comúnmente usado para el mapeo de meiótica, la levadura S. cerevisiae. Sin embargo, con las sustituciones menores de rea-organismo específicocaballeros, por ejemplo, diferentes proteínas esporulación específicos fusionados a GFP, el método deben ser fácilmente transferibles a otros microorganismos, incluidos los organismos en los que la cartografía meiótica es significativamente más mano de obra intensiva o actualmente intratable. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Mejor método. (A) El plásmido pCL2_BC es un plásmido de 2 micras con una fusión GFP-esporulación específica, resistencia a G418, y un código de barras aleatorio 15-mer. Construcción de la biblioteca de plásmidos se describe en Ludlow et al 1. (B) Un grupo de plásmidos con código de barras se transforma en la cepa diploide de una cruz. (C) Los transformantes se cultivaron a continuación en la selección y ~ 10.000 colonias transformadas se reúnen y se esporulados. Durante la meiosis cada uno de esporas de una tétrada hereda un copy del plásmido con código de barras. (D) tétradas se separan de las células no esporulados por FACS y se recogieron en placas de agar, donde se digieren y se interrumpieron para permitir que cada uno de esporas para formar una colonia. (E) Las colonias se recogieron a continuación en placas de 96 pocillos, fenotipados, y genotipo. Durante el genotipado del código de barras plásmido se lee y se utiliza para identificar a los cuatro miembros de cada tétrada. Esta cifra ha sido modificado desde Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (Unidad de pedido especial)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Otros clasificadores de células deberían funcionar para este procedimiento. Los factores clave son: (1) un láser/sistema de detección para el reportero fluorescente que se está utilizando (láser de 488 nm para excitar EGFP en nuestro caso), (2) la capacidad de clasificar eventos individuales, (3) la capacidad de clasificar en portaobjetos de microscopio para evaluar la calidad de la clasificación y (4) la capacidad de clasificar en placas de Petri</td></tr><tr><td>Unidad de deposición celular automatizada (para FACSAria II)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155 (si se compra por separado del instrumento FACSAria)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Biobusiness</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html Científico</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mejor: barcode enabled la secuenciación de tétradas

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Análisis Tetrad es una herramienta valiosa para la genética de la levadura, pero la naturaleza laborioso manual del proceso ha impedido su aplicación en gran escala. Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) 1 sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas en virtud de una proteína de fusión GFP-esporulación específica que permita activado por fluorescencia de células de clasificación de tétradas directamente sobre placas de agar, en el que el asco es enzimáticamente digeridos y las esporas se interrumpen y aleatoriamente vistió por grano de cristal de recubrimiento. Las colonias haploides se asignan relaciones esporas hermanas, es decir, la información sobre la que las esporas se originaron de la misma tétrada, utilizando los códigos de barras moleculares leídos durante el genotipado. Al eliminar el cuello de botella de la disección manual, cientos o incluso miles de tétradas se pueden aislar en cuestión de minutos. Aquí presentamos una descripción detallada de los procedimientos experimentales necesarios para llevar a cabo mejor en la levaduraSaccharomyces cerevisiae, a partir de una cepa diploide heterocigótico a través del aislamiento de colonias derivadas de la progenie meiótica haploide.

MEJOR puede mejorar en gran medida la velocidad con que las esporas de tétradas se pueden aislar. Como un ejemplo de este método el rendimiento puede entregar, un investigador realizó las clasificación FACS y la separación de esporas (Pasos 5.1 a 6.3) con 149 placas de agar en 3 horas 1. Un rendimiento equivalente (aproximadamente 3.725 tétradas) requeriría más de 90 horas de la disección manual. Sin embargo, como con muchos métodos de alto rendimiento, la iteración actual del método tiene alguna pérdida de eficiencia en comparación con la disección manual. Esta pérdida se manifiesta como una reducción del número de colonias se recuperó en comparación con la expectativa calculada sobre la base de la viabilidad de las esporas de la cruz, determinado por disección manual (paso 1.4). Suponiendo que las causas de la pérdida de esporas (Discusión) afectan esporas al azar, se pueden realizar estimaciones de la cantidad de colonias recuperadas serán miembros de tétradas en la que 1, 2, 3, o 4 esporas han sido recuperadas (Figura 4). Figura 4. Simulación de la eficiencia método en el nivel de la tétrada. Imposibilidad de recuperar con éxito esporas (como colonias) puede ser debido a la inviabilidad de las esporas, la adhesión de esporas a las perlas de vidrio, el fracaso para separar esporas el uno del otro, etc se usó la distribución binomial para calcular la fracción esperada de tétradas (con al menos una de esporas recuperado con éxito) la producción de 4, 3, 2 o 1 colonias sobre la base de la proporción de todas las esporas recuperados con éxito. En este gráfico se puede servir como una guía aproximada de la cantidad de cepas que finalmente se ensamblan en 3 - o 4 - tétradas de esporas. Como el número de colonias por placa aumenta, también lo hace el número de tétradas completos recuperados. En el experimento descrito anteriormente, 25 tétradas de una cruz con esporas viabilidad cercana al 100% (como Determined por disección manual) 1 se sembraron en 149 placas de agar. En este experimento, el número máximo de colonias observadas por placa fue de 80, lo que indica que 20 esporas no lograron formar colonias discretas. El número medio de colonias por placa fue de 62. Colonias de las 61 placas que contienen 65 o más colonias se recogieron y secuenciados. De las 3.700 cepas que pasan el control de calidad de secuenciación, 72% podría ser computacionalmente asignado en 3 - o 4 - tétradas de esporas.

Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas por fluorescencia de células activadas por la clasificación en placas de agar, separa las esporas por agitación con perlas de vidrio, y determina qué colonias dispuestas al azar se derivaron de la misma tétrada original utilizando códigos de barras moleculares.

MEJOR: Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

El objetivo general de este procedimiento es generar una gran cantidad de descendientes recombinantes a partir de un cruce de levadura de manera que se conserve la información sobre qué descendientes derivaron del mismo tétrada original. Esto se logra primero transformando la cepa diploide heterocigota que se utilizará en el cruce con una biblioteca de plásmidos que contiene un código de barras específico para tétradas y un reportero fluorescente específico para esporulación. El segundo paso consiste en transferir las células marcadas con códigos de barras al medio de esporulación.Esto permite que se formen las tétradas e induce la expresión del reportero fluorescente GFP en las tétradas, pero no en las células que no logran esporular. A continuación, un citómetro de flujo separa las tétradas marcadas fluorescentemente del resto de las células y las deposita directamente en una placa de agar, donde el recubrimiento externo de las tétradas se digiere enzimáticamente. El paso final consiste en usar perlas de vidrio para separar y distribuir las esporas de las tétradas digeridas sobre la superficie de la placa de agar, permitiendo que cada espora forme una colonia individual.Finalmente, las cepas obtenidas mediante este método serán genotipificadas utilizando un protocolo de secuenciación de ADN multiplexado de alto rendimiento que leerá el código de barras tetraespecífico de cada cepa. Luego, los códigos de barras se utilizan para identificar cada una de las cuatro cepas resultantes de un único evento meiótico. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la disección manual de ascos secos mediante un micromanipulador, es que un solo investigador puede aislar varios miles de progenie recombinante en solo unas pocas horas.Las células diploides de levadura utilizadas en este estudio han sido previamente transformadas con una biblioteca de plásmidos con códigos de barras como se describe en el manuscrito adjunto y almacenadas a 80 grados Celsius negativos para revivir las células a partir de los tallos congelados. Incúbelas durante la noche en cinco mililitros de YPD más 200 microgramos por mililitro de G cuatro 18 a 30 grados Celsius con agitación al día siguiente. Lave las células de los cultivos nocturnos tres veces en PBS y luego resuspenda las células hasta un volumen final de dos mililitros en medio de esporulación, más 200 microgramos por mililitro.Agitar los cultivos de esporulación a temperatura ambiente durante cuatro días. Monitorear diariamente el progreso de la esporulación hasta que haya dejado de formarse tétradas nuevas. Típicamente, esto tarda entre dos y cuatro días una vez que los cultivos contienen tétradas bien formadas y relativamente pocas diádicas.Retire los cultivos de la agitación y déjelos a temperatura ambiente durante al menos siete días antes de la clasificación de tétradas. El aspecto más difícil de este procedimiento es obtener una buena separación de esporas. Hemos encontrado empíricamente que permitir que los cultivos esporulados reposen a temperatura ambiente sin agitación durante al menos una semana antes de la clasificación de tétradas mejora considerablemente la separación de esporas.Los tétradas procedentes del cultivo de esporulación pueden detectarse y aislarse mediante citometría de flujo activada por fluorescencia o fax, ya que los plásmidos con códigos de barras en las células diploides también portan una proteína de fusión GFP específica de la esporulación. El protocolo descrito aquí fue desarrollado para un fax aria dos. Para comenzar este procedimiento, cargue el cultivo esporulado en el ordenador de fax y configure dos compuertas de dispersión directa y dispersión lateral para excluir restos, células agrupadas y múltiples células por gota.Debe haber una población de células fluorescentes, que al utilizar el constructo reportero PS dos GFP incluye eventos de diádas y tétradas, el GFP frente a la FSC para incluir estos eventos fluorescentes. Dependiendo del fondo del cepa, puede ser necesario incluir un paso adicional para eliminar agregados que contengan tétradas y otras células. Inspeccione un histograma de FSC de los eventos fluorescentes.En este ejemplo, los eventos en el pico izquierdo son principalmente tétradas, y los eventos en el pico derecho son generalmente tétradas con un brote asociado; aplique una última compuerta que incluya eventos con una FSC más baja que en su mayoría son tétradas, indicadas por las barras rojas. Verifique la eficiencia del régimen de compuertas separando aproximadamente 1.500 tétradas sobre un portaobjetos y contando la proporción de tétradas frente a no tétradas. Utilizando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400 veces, el porcentaje de tétradas puede estimarse con precisión contando solo aproximadamente 200 eventos separados, aunque separar alrededor de 1.500 reduce el tiempo empleado en buscar células en el portaobjetos.Estas imágenes de campo brillante tienen un aumento de 600 veces. Muestre ejemplos de tétradas a la izquierda y no tétradas a la derecha tras la clasificación de hechos. Verifique periódicamente que el clasificador informe con precisión el número de eventos al clasificar 25 tétradas sobre un portaobjetos y examinar las células contenidas en la gota mediante microscopio de contraste de fases con un aumento de 400 veces.Debe haber 25 tétradas en la gota. Repita tres o cuatro veces para evaluar la varianza del instrumento de fax en ese ensayo. Prepare las placas de agar para este procedimiento calentando el número deseado de placas YPD más G cuatro 18 durante al menos 1,5 horas en un incubador a 37 grados Celsius colocado cerca del clasificador de fax.Una característica clave del protocolo de clasificación es la capacidad de dirigir con precisión los tétradas clasificados por fax a una ubicación específica en una placa de agar que contiene un pool de solución X. Para ello, primero coloque una placa de 96 pocillos de referencia en la unidad automatizada de deposición celular del clasificador. A continuación, prepare un diseño de clasificación que permita clasificar 25 tétradas en un solo pocillo de una placa de 96.La clasificación en formato de pocillo con 25 tetras por placa produce colonias bien separadas. Elija un pocillo cercano al centro de la placa. Por ejemplo, el pocillo D cinco.Saque una pila de 10 placas de agar del incubador a 37 grados Celsius y llévelas al clasificador. Tome una placa de agar y pipetee 25 microlitros de solución zy sobre el agar cerca del centro de la placa. Luego coloque la placa sobre la placa de 96 pocillos de referencia, alineando la gota X sobre el objetivo.Bien, ese fue el seleccionado anteriormente. Bien D cinco. Inicie la clasificación y coloque 25 tetras en el centro de la gota de zy en la placa de agar.Retire y cubra la placa. Repita la clasificación para cada placa hasta que se hayan clasificado 25 tétradas en gotas de zamo en cada placa de la pila. Devuelva la pila de placas que contienen tétradas al incubador a 37 grados Celsius.Lleve el siguiente grupo de 10 placas al clasificador y repita el procedimiento de clasificación. Los esporos pueden separarse después de que las placas de agar que contienen tétradas hayan sido incubadas a 37 grados Celsius durante 1,5 horas. Para iniciar este procedimiento, agregue de 15 a 25 perlas de vidrio estériles de tres milímetros a cada placa y agite las placas en dos grupos de cinco placas durante tres a cinco minutos.La mejor separación de esporas se logra moviendo rígidamente las placas de un lado a otro o de adelante hacia atrás. No mueva las placas de forma que las perlas giren alrededor del borde exterior de la placa. Deje las perlas sobre las placas al terminar. Coloque la pila de placas con las perlas hacia arriba en un incubador a 30 grados Celsius. Retire la siguiente pila de placas del incubador a 37 grados Celsius y repita el procedimiento de separación de esporas utilizando las perlas. Incube todas las placas durante la noche a 30 grados Celsius al día siguiente de separar las esporas.Retire cuidadosamente las placas del incubador a 30 grados Celsius sin perturbar las perlas de vidrio. Deberían haberse formado colonias pequeñas en las placas. Retire las perlas de vidrio invirtiendo cuidadosa y rápidamente las placas sobre un recipiente profundo.Al golpear suavemente la parte inferior de la placa mientras está invertida, se pueden desprender las perlas que estén adheridas a la placa. Los recipientes deben ser lo suficientemente profundos como para recoger las perlas sin permitir que salten y golpeen la placa de agar. Cuente el número de colonias en cada placa y utilice esta cifra para estimar la eficiencia de la separación y recuperación de esporas.Por ejemplo, 25 tétradas por placa para un cruzamiento con viabilidad cercana al 100 % podrían producir un total de 100 colonias por placa a partir de placas con un número suficiente de colonias, como más de 65 en el caso de alta viabilidad. Transfiera células cruzadas de cada colonia a un pocillo separado de una placa de 96 pocillos que contenga medio líquido YPD más G cuatro 18. También anote qué pocillos contienen colonias procedentes de la misma placa de agar.Esta información se utilizará posteriormente para facilitar la asignación de tétradas. El software puede mejorar considerablemente la velocidad con la que se aíslan las esporas procedentes de tétradas. Aunque la versión actual del método presenta cierta pérdida de eficiencia en comparación con la disección manual, se utilizó la distribución binomial para calcular la fracción esperada de tétradas con al menos una espora recuperada con éxito que produzca 1, 2, 3 o cuatro colonias, basándose en la proporción de todas las esporas recuperadas con éxito.Este gráfico puede servir como una guía aproximada del número de cepas que finalmente se ensamblarán en tétradas de tres o cuatro esporas, tal como se observó aquí. El número de tétradas completas recuperadas aumenta conforme aumenta el número de colonias por placa en este estudio. Se sembraron 25 rads procedentes de cruces con viabilidad de esporas cercana al 100 %, según se determinó mediante disección manual, en 149 placas de agar.El número máximo de colonias observado por placa fue de 80, lo que indica que 20 esporas no lograron formar colonias discretas. El número medio de colonias por placa fue de 62. Se cosecharon y secuenciaron 4.354 colonias de 61 placas que contenían 65 colonias o más. De las 3.700 cepas que superaron el control de calidad del secuenciado, 2.665, o el 72 %, pudieron asignarse computacionalmente en tres o cuatro tétradas de esporas. Una vez dominado.Esta técnica puede utilizarse para procesar más de mil tétradas por hora. Aunque para precisiones superiores a tres horas, necesitará asistencia.

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