MEJOR: Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas

El objetivo general de este procedimiento es generar una gran cantidad de descendientes recombinantes a partir de un cruce de levadura de manera que se conserve la información sobre qué descendientes derivaron del mismo tétrada original. Esto se logra primero transformando la cepa diploide heterocigota que se utilizará en el cruce con una biblioteca de plásmidos que contiene un código de barras específico para tétradas y un reportero fluorescente específico para esporulación. El segundo paso consiste en transferir las células marcadas con códigos de barras al medio de esporulación.

Esto permite que se formen las tétradas e induce la expresión del reportero fluorescente GFP en las tétradas, pero no en las células que no logran esporular. A continuación, un citómetro de flujo separa las tétradas marcadas fluorescentemente del resto de las células y las deposita directamente en una placa de agar, donde el recubrimiento externo de las tétradas se digiere enzimáticamente. El paso final consiste en usar perlas de vidrio para separar y distribuir las esporas de las tétradas digeridas sobre la superficie de la placa de agar, permitiendo que cada espora forme una colonia individual.

Finalmente, las cepas obtenidas mediante este método serán genotipificadas utilizando un protocolo de secuenciación de ADN multiplexado de alto rendimiento que leerá el código de barras tetraespecífico de cada cepa. Luego, los códigos de barras se utilizan para identificar cada una de las cuatro cepas resultantes de un único evento meiótico. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la disección manual de ascos secos mediante un micromanipulador, es que un solo investigador puede aislar varios miles de progenie recombinante en solo unas pocas horas.

Las células diploides de levadura utilizadas en este estudio han sido previamente transformadas con una biblioteca de plásmidos con códigos de barras como se describe en el manuscrito adjunto y almacenadas a 80 grados Celsius negativos para revivir las células a partir de los tallos congelados. Incúbelas durante la noche en cinco mililitros de YPD más 200 microgramos por mililitro de G cuatro 18 a 30 grados Celsius con agitación al día siguiente. Lave las células de los cultivos nocturnos tres veces en PBS y luego resuspenda las células hasta un volumen final de dos mililitros en medio de esporulación, más 200 microgramos por mililitro.

Agitar los cultivos de esporulación a temperatura ambiente durante cuatro días. Monitorear diariamente el progreso de la esporulación hasta que haya dejado de formarse tétradas nuevas. Típicamente, esto tarda entre dos y cuatro días una vez que los cultivos contienen tétradas bien formadas y relativamente pocas diádicas.

Retire los cultivos de la agitación y déjelos a temperatura ambiente durante al menos siete días antes de la clasificación de tétradas. El aspecto más difícil de este procedimiento es obtener una buena separación de esporas. Hemos encontrado empíricamente que permitir que los cultivos esporulados reposen a temperatura ambiente sin agitación durante al menos una semana antes de la clasificación de tétradas mejora considerablemente la separación de esporas.

Los tétradas procedentes del cultivo de esporulación pueden detectarse y aislarse mediante citometría de flujo activada por fluorescencia o fax, ya que los plásmidos con códigos de barras en las células diploides también portan una proteína de fusión GFP específica de la esporulación. El protocolo descrito aquí fue desarrollado para un fax aria dos. Para comenzar este procedimiento, cargue el cultivo esporulado en el ordenador de fax y configure dos compuertas de dispersión directa y dispersión lateral para excluir restos, células agrupadas y múltiples células por gota.

Debe haber una población de células fluorescentes, que al utilizar el constructo reportero PS dos GFP incluye eventos de diádas y tétradas, el GFP frente a la FSC para incluir estos eventos fluorescentes. Dependiendo del fondo del cepa, puede ser necesario incluir un paso adicional para eliminar agregados que contengan tétradas y otras células. Inspeccione un histograma de FSC de los eventos fluorescentes.

En este ejemplo, los eventos en el pico izquierdo son principalmente tétradas, y los eventos en el pico derecho son generalmente tétradas con un brote asociado; aplique una última compuerta que incluya eventos con una FSC más baja que en su mayoría son tétradas, indicadas por las barras rojas. Verifique la eficiencia del régimen de compuertas separando aproximadamente 1.500 tétradas sobre un portaobjetos y contando la proporción de tétradas frente a no tétradas. Utilizando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 400 veces, el porcentaje de tétradas puede estimarse con precisión contando solo aproximadamente 200 eventos separados, aunque separar alrededor de 1.500 reduce el tiempo empleado en buscar células en el portaobjetos.

Estas imágenes de campo brillante tienen un aumento de 600 veces. Muestre ejemplos de tétradas a la izquierda y no tétradas a la derecha tras la clasificación de hechos. Verifique periódicamente que el clasificador informe con precisión el número de eventos al clasificar 25 tétradas sobre un portaobjetos y examinar las células contenidas en la gota mediante microscopio de contraste de fases con un aumento de 400 veces.

Debe haber 25 tétradas en la gota. Repita tres o cuatro veces para evaluar la varianza del instrumento de fax en ese ensayo. Prepare las placas de agar para este procedimiento calentando el número deseado de placas YPD más G cuatro 18 durante al menos 1,5 horas en un incubador a 37 grados Celsius colocado cerca del clasificador de fax.

Una característica clave del protocolo de clasificación es la capacidad de dirigir con precisión los tétradas clasificados por fax a una ubicación específica en una placa de agar que contiene un pool de solución X. Para ello, primero coloque una placa de 96 pocillos de referencia en la unidad automatizada de deposición celular del clasificador. A continuación, prepare un diseño de clasificación que permita clasificar 25 tétradas en un solo pocillo de una placa de 96.

La clasificación en formato de pocillo con 25 tetras por placa produce colonias bien separadas. Elija un pocillo cercano al centro de la placa. Por ejemplo, el pocillo D cinco.

Saque una pila de 10 placas de agar del incubador a 37 grados Celsius y llévelas al clasificador. Tome una placa de agar y pipetee 25 microlitros de solución zy sobre el agar cerca del centro de la placa. Luego coloque la placa sobre la placa de 96 pocillos de referencia, alineando la gota X sobre el objetivo.

Bien, ese fue el seleccionado anteriormente. Bien D cinco. Inicie la clasificación y coloque 25 tetras en el centro de la gota de zy en la placa de agar.

Retire y cubra la placa. Repita la clasificación para cada placa hasta que se hayan clasificado 25 tétradas en gotas de zamo en cada placa de la pila. Devuelva la pila de placas que contienen tétradas al incubador a 37 grados Celsius.

Lleve el siguiente grupo de 10 placas al clasificador y repita el procedimiento de clasificación. Los esporos pueden separarse después de que las placas de agar que contienen tétradas hayan sido incubadas a 37 grados Celsius durante 1,5 horas. Para iniciar este procedimiento, agregue de 15 a 25 perlas de vidrio estériles de tres milímetros a cada placa y agite las placas en dos grupos de cinco placas durante tres a cinco minutos.

La mejor separación de esporas se logra moviendo rígidamente las placas de un lado a otro o de adelante hacia atrás. No mueva las placas de forma que las perlas giren alrededor del borde exterior de la placa. Deje las perlas sobre las placas al terminar.

Coloque la pila de placas con las perlas hacia arriba en un incubador a 30 grados Celsius. Retire la siguiente pila de placas del incubador a 37 grados Celsius y repita el procedimiento de separación de esporas utilizando las perlas. Incube todas las placas durante la noche a 30 grados Celsius al día siguiente de separar las esporas.

Retire cuidadosamente las placas del incubador a 30 grados Celsius sin perturbar las perlas de vidrio. Deberían haberse formado colonias pequeñas en las placas. Retire las perlas de vidrio invirtiendo cuidadosa y rápidamente las placas sobre un recipiente profundo.

Al golpear suavemente la parte inferior de la placa mientras está invertida, se pueden desprender las perlas que estén adheridas a la placa. Los recipientes deben ser lo suficientemente profundos como para recoger las perlas sin permitir que salten y golpeen la placa de agar. Cuente el número de colonias en cada placa y utilice esta cifra para estimar la eficiencia de la separación y recuperación de esporas.

Por ejemplo, 25 tétradas por placa para un cruzamiento con viabilidad cercana al 100 % podrían producir un total de 100 colonias por placa a partir de placas con un número suficiente de colonias, como más de 65 en el caso de alta viabilidad. Transfiera células cruzadas de cada colonia a un pocillo separado de una placa de 96 pocillos que contenga medio líquido YPD más G cuatro 18. También anote qué pocillos contienen colonias procedentes de la misma placa de agar.

Esta información se utilizará posteriormente para facilitar la asignación de tétradas. El software puede mejorar considerablemente la velocidad con la que se aíslan las esporas procedentes de tétradas. Aunque la versión actual del método presenta cierta pérdida de eficiencia en comparación con la disección manual, se utilizó la distribución binomial para calcular la fracción esperada de tétradas con al menos una espora recuperada con éxito que produzca 1, 2, 3 o cuatro colonias, basándose en la proporción de todas las esporas recuperadas con éxito.

Este gráfico puede servir como una guía aproximada del número de cepas que finalmente se ensamblarán en tétradas de tres o cuatro esporas, tal como se observó aquí. El número de tétradas completas recuperadas aumenta conforme aumenta el número de colonias por placa en este estudio. Se sembraron 25 rads procedentes de cruces con viabilidad de esporas cercana al 100 %, según se determinó mediante disección manual, en 149 placas de agar.

El número máximo de colonias observado por placa fue de 80, lo que indica que 20 esporas no lograron formar colonias discretas. El número medio de colonias por placa fue de 62. Se cosecharon y secuenciaron 4.354 colonias de 61 placas que contenían 65 colonias o más. De las 3.700 cepas que superaron el control de calidad del secuenciado, 2.665, o el 72 %, pudieron asignarse computacionalmente en tres o cuatro tétradas de esporas. Una vez dominado.

Esta técnica puede utilizarse para procesar más de mil tétradas por hora. Aunque para precisiones superiores a tres horas, necesitará asistencia.