Name: Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a identificar proteínas efectoras de c-di-GMP mediante espectrometría de masas con compuestos de captura (CCMS). Este método computacional mejora la especificidad y permite condiciones de lavado rigurosas.

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Agradecemos a Alberto Reinders por su trabajo en la optimización de las condiciones del CCMS para P. aeruginosa. También agradecemos a Pablo Manfredi por la anotación de las proteínas de P. aeruginosa. Este trabajo contó con el apoyo de la beca Sinergia de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNF) CRSII3_127433.

1. Preparación de lisado <ol><li> Crecer P. aeruginosa células en LB a la DO deseada. NOTA: Para obtener orientación: utilizar ≈ 100 ml de cultivo / muestra para cultivos en fase estacionaria y ≈ 500 ml cultur / muestra para cultivos en fase log (OD 600 nm = 0,5). </li><li> Pellet por centrifugación durante 20 min a 5000 x g. </li><li> Resuspender 0,5-1 g de sedimento en 1 ml de tampón de lisis (MES 6,7 mM, 6,7 mM de HEPES, NaCl 200 mM, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) y se añade inhibidor de la proteasa (mini completo, libre de EDTA), así como DNaseI. </li><li> Lisan las células mediante 3 pasos a través de una célula de presión francesa, a 20.000 psi (ver Lista de Materiales). </li><li> Ultra-centrifugar el lisado celular a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Guardar el sobrenadante (vaya al paso 2). </li><li> Lavar el sedimento con 1 ml de 1x tampón de lisis pipeteando arriba y abajo. </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Flash congelar el sedimento ennitrógeno líquido y se almacena a -20 ° C hasta su utilización para la captura de las proteínas de membrana (ver paso 3). </li></ol> 2. La eliminación de los nucleótidos libres c-di-GMP y Otros (Fracción Soluble solamente) <ol><li> Lavar una columna de desalación PD10 (ver Lista de Materiales) con 10 ml de tampón de lisis frío. </li><li> Verter el sobrenadante (≈ 1 ml) en el PD10 con el fin de eliminar los nucleótidos. </li><li> Se eluye con 4 ml de tampón de lisis frío (500 l pasos). </li><li> Seleccione las fracciones más concentradas como se determina mediante el ensayo de Bradford, y los mismos se agrupen. </li></ol> 3. Pellet resuspensión y solubilización (fracción de membrana solamente) <ol><li> Resuspender el precipitado en 500 a 1.000 l de búfer de captura 1x (sin detergente) (ver Tabla 1). NOTA: El pellet es difícil para volver a suspender. Se aconseja primera pipeta de arriba abajo con una pipeta para volver a suspender el sedimento o menos, luego de usar una jeringa de 27 G para así homogeneizar la solución. </li><li> Añadir 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM). </li><li> Incubar a 4 ° C durante al menos 2 horas (o O / N) en una rueda giratoria. </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Se recoge el sobrenadante. </li></ol> 4. Proteína de medición de concentración <ol><li> Medir la concentración de proteína por el ensayo de Bradford (mediante ensayo BCA para la fracción de membrana). </li><li> Ajuste la concentración de proteína total a 10 mg / ml. </li></ol> 5. Captura <ol><li> Mezclar 300 g de proteína con 1 mM del PIB, GTP, ATP, CTP, y 20 l de tampón de captura de 5x (mM HEPES 100 mM, KAc 250 mM, MgAc 50, 5% de glicerol, pH 7,5) (Tabla 1). Ajuste el volumen de reacción de 100 l con H 2 O. NOTA: el volumen total incluye el volumen del CDG-CC y c-di-GMP en el caso del control de la competencia (véase el paso 5.3 y la Tabla 2). NOTA: todos los experimentos se llevaron a cabo en 200 y# 181; l tiras de PCR de 12 tubos (Thermo Scientific). NOTA: para la fracción de membrana, asegúrese de mantener siempre la concentración DDM encima de la concentración micelar crítica (0,01% w / v) hasta la etapa de solubilización de proteínas en urea 8 M (Paso 7.1). </li><li> Incubar a 4 ° C durante 30 min en una rueda giratoria. </li><li> Añadir 10 mM CDG-CC (concentración final). NOTA: incluir un control sin CDG-CC (referido como &quot;el control del grano&quot;), y un control suplementado con 1 mM de c-di-GMP (&quot;control de la competencia&quot;) (ver Tabla 2). NOTA: la concentración CDG-CC se puede ajustar de 1 a 10 mM. </li><li> Incubar a 4 ° C durante al menos 2 h (O / N para la fracción de membrana) en una rueda giratoria, en la oscuridad. </li><li> Después de un giro corto, cross-link mediante la activación del resto reactivo de la CDG-CC con luz UV durante 4 min, utilizando un CaproBox (ver Lista de Materiales, λ = 310 nm, irradiancia ≥10 mW / cm², distancia de la fuente = 2 cm). Nota: Retire la tapa de las tiras de reticulación previa. </li><li> Añadir 25 l de 5x tampón de lavado (NaCl 5 M, Tris 250 mM, pH 7,5) y 50 l de perlas magnéticas de estreptavidina así resuspendidos, homogeneizar suavemente. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 1 hora en una rueda giratoria. </li></ol> 6. Los pasos de lavado NOTA: (Imán: ver Lista de Materiales). Comience con una captura de las perlas magnéticas en la tira tapa PCR, con el imán. A continuación, reemplace la tira de PCR por uno nuevo que contenga la siguiente solución de lavado. Retire el imán y volver a suspender las perlas, y se incuba 2 min. Centrifugar y reemplazar la tapa por una tapa fresco. <ol><li> Las etapas de lavado (fracción soluble únicamente) <ol><li> Lavar 6 veces en 200 l de tampón de lavado 1x. </li><li> Lavar una vez en 200 l de calidad HPLC H 2 O. </li><li> Lavar 6 veces en 200 l 80% de acetonitrilo. </li><li> Lavar 2 veces en 200 l de calidad HPLC H 2 O. </li></ol></li><li> Las etapas de lavado (membrafracción ne solamente) <ol><li> Lavar 5 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,1% DDM. </li><li> Lavar 2 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,05% DDM. </li><li> Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,025% DDM. </li><li> Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,0125% DDM. </li><li> Lavar 3 veces en 200 l mM ABC 100 (bicarbonato de amonio, NH 4 CO 3) + 2 M urea. </li></ol></li></ol> 7. MS Preparación de la muestra <ol><li> Resuspender las perlas (directamente en la tapa) en 20 l mM ABC 100 (mM ABC 100 + 8 M urea para la fracción de membrana) y transferir a tubos de 1,5 ml. </li><li> Fracción de membrana única: se incuba a 60 ° C durante 5 min, agitando a 500 rpm. </li><li> Añadir 0,5 l mM TCEP 200 (tris (2-carboxietil) fosfina) y se incuba a 60 ° C durante 1 hora, con agitación a 500 rpm. Enfriar a 25 ° C. </li><li> Añadir 0,5 l de 400 mM recién preparada yodoacetamida y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos, agitando unaT 500 rpm y en la oscuridad. </li><li> Añadir 0,5 l 0,5 M N-acetil-cisteína y se incuba a 25 ° C durante 10 min, agitando a 500 rpm. </li><li> Fracción de membrana única: añadir 1 l Lys-C e incubar a 37 ° C, O / N. </li><li> Añadir 2 g de tripsina y se incuba O / N a 37 ° C, agitando a 500 rpm (wrap en Parafilm para evitar el secado). NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa. NOTA: fracción de membrana solamente: añadir mM ABC 100 para ajustar la concentración de urea a &lt;2 M antes de la adición de tripsina. </li><li> Brevemente centrifugar los tubos y recoger bolitas con el imán. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml (repita este paso si los granos se dejan). </li><li> Añadir 5 l 5% de TFA (ácido trifluoroacético) + 1 l 2 M HCl (15 l 5% TFA + 5 l 2 M HCl para la fracción de membrana). </li><li> Condición columnas C18 MicroSpin (El Grupo Nest, MA, EE.UU.) con 150 l de acetonitrilo (spin 20 segundos a 2.400 rpm). </li><li> Equilibrate las columnas C18 2 veces con 150 l 0,1% TFA (giro 20 s, 2400 rpm). </li><li> Cargue la muestra y girar 2 min, 2000 rpm. </li><li> Actualizar el flujo a través en la columna y repetir la etapa de hilatura (2 min, 2000 rpm). </li><li> Lavar 3 veces con 150 l 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo (20 segundos, 2400 rpm). </li><li> Tomar un tubo nuevo y se eluye dos veces con 150 l 0,1% de TFA, 50% de acetonitrilo (2 min, 2000 rpm). </li><li> Seque los péptidos en una velocidad-vac. </li><li> Resuspender en 40 l 98% H 2 O, 2% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%. </li><li> Sonicar 20 seg (ciclo de pulso 0,5, amplitud 100%; ver Lista de Materiales) y centrifugar 5 seg, 12.000 rpm (centrífuga de mesa). Vortex 10 seg, y de girar 5 seg, 12.000 rpm. Transferencia en un vial de HPLC para el análisis de LC-MS / MS. </li><li> Congelar a -20 ° C. NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa. </li></ol> 8. LC-MS / MS Analysis <ol><li> Ejecutar un nano-LC (sistemas nano-LC) equipped con una columna RP-HPLC (75 m x 37 cm) rellena con resina C18 (magia C18 AQ 3 m) usando un gradiente lineal de disolvente A (ácido fórmico al 0,15%, 2% de acetonitrilo) 95% y 5% de disolvente B ( 98% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%) a 35% de disolvente B durante 60 min a un caudal de 0,2 l / min. </li><li> Analizar los péptidos utilizando LC-MS / MS (doble presión LTQ-Orbitrap Velos espectrómetro de masas, conectado a una fuente de iones de electrospray). NOTA: El modo de adquisición de datos se creó para obtener una alta resolución MS Analizar en la parte FT del espectrómetro de masas con una resolución de 60.000 FWHM seguido por MS / MS de las exploraciones en la trampa de iones lineal de los 20 iones más intensos. Para aumentar la eficiencia de los intentos de MS / MS, el modus proyección estatal encargada estaba habilitado para excluir sin asignar y solitariamente cobra iones. Colusión disociación inducida se desencadenó cuando el precursor superó los 100 recuentos de iones. La duración dinámica de exclusión se fijó a 30 seg. El tiempo de acumulación de iones se fijó a 300 mseg (MS) y 50mseg (MS / MS). </li></ol> 9. Base de datos de búsqueda <ol><li> Descargue el P. aeruginosa NCBI-base de datos a través de la página de NCBI ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ). </li><li> Convertir los espectros MS prima en archivos genéricos de la mascota (MGF) utilizando la herramienta de conversión MassMatrix ( <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a> ). </li><li> Buscar en este archivo mgf usando MASCOTA versión 2.3 contra la P. aeruginosa NCBI-base de datos que contiene adelante y entradas de proteínas inversa señuelo. </li><li> Realizar una en la digestión de tripsina silico después de lisina y arginina (a no ser seguido por prolina) tolerando dos perdidas divisiones en péptidos plenamente tríptico. </li><li> Establezca los parámetros de búsqueda de base de datos para permitir metioninas oxidado (15.99491 Da) como variable modificaciones y carboxiamidometilación (57.021464 Da) de residuos de cisteína como fijo modificación. Para MASCOTA nos buscaing escaneos de alta resolución, establecer la tolerancia de masa precursor de 15 ppm y establecer la tolerancia de masa fragmento de 0,6 Da. Por último, establezca la proteína FDR al 1%. </li><li> Importe las búsquedas de la mascota de P. experimentos aeruginosa CCMS en Andamios (Proteomesoftware, Versión 3), establecen los parámetros para obtener una proteína FDR cercano al 1%, y extraer los recuentos espectrales totales. </li><li> Para que los resultados representativos presentan en este documento, se utilizó una prueba t pareada para comparar el experimento con el control de la competencia, y sólo se consideran golpes con un valor de p inferior a 0,1, y un índice de recuento espectral por encima del 2 (experimentar recuentos espectrales / espectral control de la competencia recuentos). </li><li> Los datos se pueden exportar en cualquier software de hoja de cálculo para su posterior análisis. </li></ol> 10. Cuantificación-Label gratis <ol><li> Importe los archivos RAW en el software progénesis LC-MS (Dinámica no lineal, versión 4.0). </li><li> Realizar LC-MS alineación y detección de características en setti defectoNGS. </li><li> Exportación de los datos en formato mgf de progénesis LC-MS. </li><li> Buscar en los espectros MS / MS utilizando la mascota contra el NCBI P. base de datos que contiene aeruginosa hacia adelante y entradas de proteínas inversa señuelo. </li><li> Importe los resultados de búsqueda de base de datos en progénesis LC-MS y un mapa de los péptidos identificaciones a características MS1. </li><li> Para la evaluación de datos (cálculo de los niveles de significación, plegables cambio proporciones) se utilizó el guión ProteinSQAnalysis de SafeQuant (umbral: el valor q por debajo de 0,1, índice de recuento espectral superior a 2). </li></ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((You%27ve+come+a+long+way%3A+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li>
<li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li>
<li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria%3A+recent+advances+and+new+puzzles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li>
<li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRP%2FFNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li>
<li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li>
<li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li>
<li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+%28CCMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Köster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Düvel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li>
<li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li>
<li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li>
<li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li>
<li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+receptor+signaling%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li>
<li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+messenger+bis-%283%E2%80%98-5%E2%80%99%29-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Especial cuidado se debe tomar en varias etapas del protocolo. La concentración de proteínas es un parámetro crítico con una concentración de 10 mg / ml siendo difícil de alcanzar cuando las células se cultivan bajo condiciones de crecimiento específicas (por ejemplo biofilms o pequeñas variantes de colonias). Por lo tanto, la resuspensión de pellets se debe realizar en un bajo volumen de tampón de lisis. Las concentraciones de proteína se pueden reducir a 8 mg / ml. En comparación con el método publicado por N...

c-di-GMP es un segundo mensajero clave usada por la mayoría de las bacterias para controlar varios aspectos de su crecimiento y comportamiento. Por ejemplo, c-di-GMP regula la progresión del ciclo celular, la motilidad y la expresión de exopolisacáridos y adhesinas de superficie 2-4. A través de la coordinación de tales procesos de c-di-GMP promueve la formación de biofilm, un proceso que está asociado con infecciones crónicas de una gama de bacterias patógenas 5. c-di-GMP se sintetiza por enzimas llamadas guanilato diguanylate (PED) que albergan un dominio catalítico GGDEF 4. Algunos PED poseen un sitio de inhibidor que regula hacia abajo la actividad de la adenilato sobre c-di-GMP de unión. La degradación de c-di-GMP está catalizada por dos clases distintas de las fosfodiesterasas (PDE) que alberga ya sea un EAL catalítica o HD-GYP de dominio 6,7. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas que se unen directamente c-di-GMP pertenecen a una de las tres clases de proteínas: catalíticaGGDEF o EAL dominios aliado inactivos y dominios Pilz, pequeños interruptores moleculares que experimentan cambios conformacionales a vinculantes c-di-GMP 8. PED, PDE y Pilz proteínas están bien caracterizados y sus dominios se pueden predecir en silico relativamente segura. Un especial interés se centra ahora en la identificación de nuevos tipos de efectores c-di-GMP. Algunos efectores de c-di-GMP con diferentes motivos de unión se describieron recientemente como el CRP / FNR Bcam1349 familia de proteínas en Burkholderia cenocepacia o la FleQ regulador transcripcional en P. aeruginosa 9,10. Además, riboswitches-GMP-específico c-di han sido recientemente identificados y muestran para controlar la expresión génica de una manera c-di-GMP-11 dependiente. Los motivos c-di-GMP de unión de diferentes efectores son sólo mal conservadas hacer predicciones bioinformáticas de tales proteínas difícil. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un método bioquímico, que se basa en el uso de un spe c-di-GMPcaptura compuesto espe- combinada con espectrometría de masas 1,12,13. Hemos diseñado recientemente una captura compuesto c-di-GMP novela trivalente (CDG-CC, la Figura 1) 1. Este andamio química se compone de: 1) un resto de c-di-GMP utilizado como cebo para capturar c-di-GMP proteínas de unión, 2) un grupo reactivo fotoactivable-UV utiliza para reticular el CDG-CC a las proteínas unidas y 3) una biotina para aislar las proteínas capturadas usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El CDG-CC se puede utilizar para capturar directa y específicamente efectores de c-di-GMP a partir de una mezcla compleja de macromoléculas como lisados ​​celulares. Compuesto de captura basada y han sido previamente informado enfoques químicos proteómica basadas ser aplicable a una amplia gama de organismos, por ejemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium y P. aeruginosa 1,14. En este trabajo metodológico,proporcionamos una descripción en profundidad del procedimiento CCMS utilizando extractos de P. aeruginosa como un ejemplo. Este estudio establece CCMS como una herramienta poderosa y versátil para identificar bioquímicamente nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>Lámparas UV acopladas a un bloque de refrigeración de 96 placas, para la fotoactivación</td></tr><tr><td>caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>incluido en el CCMS Starter Kit</td><td>Para una fácil manipulación de partículas magnéticas sin pipeteo</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit caprotec</td><td>bioanalytics</td><td>bajo pedido</td><td>El kit contiene el compuesto de captura c-di-GMP, c-di-GMP (para el control de la competencia), perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, tampón de captura y tampón de lavado</td></tr><tr><td>Columnas desalinizadoras desechables PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de PCR de 12 tubos</td><td>Sonicador Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v con tecnología de ultrasonidos VialTweeter</td><td>Hielscher</td><td>UIS250v y VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Célula de presión francesa en miniatura</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

captura compuesto espectrometría de masas - una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-gmp efectoras proteínas

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Se ha logrado un progreso considerable en la última década hacia la identificación y caracterización de las enzimas implicadas en la síntesis (guanilato diguanylate) y degradación (fosfodiesterasas) del segundo mensajero c-di-GMP. Por el contrario, hay poca información disponible acerca de los mecanismos moleculares y componentes celulares a través del cual esta molécula de señalización regula una amplia gama de procesos celulares. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas pertenecen a la familia Pilz o se degeneró guanilato diguanylate o fosfodiesterasas que han renunciado a la catálisis y han adoptado la función efectora. Por lo tanto, para definir mejor la red de c-di-GMP celular en una amplia gama de bacterias se requieren métodos experimentales para identificar y validar nuevos efectores para el cual fiable en las predicciones in silico fallar. Recientemente hemos desarrollado una novela de captura compuesto Espectrometría de Masas (CCMS) tecnología basada como una poderosa herramienta parabioquímicamente identificar y caracterizar proteínas de unión a c-di-GMP. Esta técnica ha sido previamente informado para ser aplicable a una amplia gama de organismos 1. Aquí se da una descripción detallada del protocolo que utilizamos para investigar tales componentes de señalización. Como un ejemplo, usamos Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista en la que c-di-GMP juega un papel crítico en el control de la virulencia y la biopelícula. CCMS identificó 74% (38/51) de los componentes conocidos o previstos de la red de c-di-GMP. Este estudio explica el procedimiento CCMS en detalle, y lo establece como una herramienta potente y versátil para identificar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.

Para identificar nuevos efectores c-di-GMP en P. aeruginosa se ​​utilizó sistemáticamente CCMS para analizar las fracciones solubles y de membrana de P. aeruginosa cepa PAO1 de un cultivo en fase log (OD 600 = 0,5). Aquí resumimos y discutimos los resultados representativos de esta expedición de pesca. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas independientes. Para cada experimento se utilizaron dos concentraciones CDG-CC diferentes (5 mM y 10 mM). Para investigar la especificidad, los experim...

El ubicuo segundo mensajero c-di-GMP controla el crecimiento y el comportamiento de muchas bacterias. Hemos desarrollado una novedosa tecnología basada en espectrometría de masas de compuestos de captura para identificar y caracterizar bioquímicamente las proteínas de unión a c-di-GMP en prácticamente cualquier especie bacteriana.

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

El objetivo general del experimento de espectrometría de masas de compuestos de captura es capturar e identificar proteínas de unión a GMP de matriz cíclica. Esto se consigue mediante el fraccionamiento, un cultivo celular por prensa francesa y la eliminación de la matriz cíclica libre gmp. Utilizando una columna PD 10 como segundo paso, el compuesto de captura se añade y se activa mediante luz ultravioleta para reticularmente las proteínas de unión a GMP de matriz cíclica unidas al compuesto de captura en ausencia o presencia de un exceso de GMP de matriz cíclica libre.A continuación, el compuesto de captura se une a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina para lavar intensamente las proteínas capturadas. Finalmente, las proteínas capturadas se digieren y se preparan para la espectrometría de masas para identificar los péptidos generados. La principal ventaja de CCMS de nuestros métodos existentes, como la coprecipitación, es que el compuesto de captura mejora la captura específica de los socios directos y permite condiciones de lavado duras gracias a la vinculación de costos covalente.Ahora, este método puede proporcionar información sobre la señalización cíclica de las bacterias di GMP. También se puede aplicar a otros sistemas, como la señalización de nucleótidos en general y prácticamente cualquier molécula alimentada con el compuesto de captura. Antes de comenzar este procedimiento, prepare y lise las células aerogénicas p a través de una ultracentrífuga ultra ultracentrífuga de celdas de presión francesas para lisado celular a 100, 000 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados.Después de guardar el sobrenadante, lave el pellet con un mililitro de un tampón de lisis pipeteando hacia arriba y hacia abajo después de la ultracentrifugación en las mismas condiciones que antes. Congele rápidamente el pellet en nitrógeno líquido, luego almacene la muestra congelada a menos 20 grados Celsius hasta que se use para la captura de proteínas de membrana. A continuación, lavar una columna de desalinización PD 10 con 10 mililitros de tampón de lisis en frío.Vierta el supra nadante en el PD 10 para eliminar nucleótidos, luego eluya con cuatro mililitros de tampón de lisis fría en incrementos de 500 microlitros. Utilice el ensayo de Bradford para determinar las fracciones más concentradas. A continuación, agrupe las fracciones seleccionadas en un tubo Resus de 1,5 mililitros.Suspender el pellet previamente almacenado en 500 a 1000 microlitros de un x tampón de captura sin detergente. Añada a la muestra una solución de 1%peso por volumen de Beta D multi purin. A continuación, incube la muestra a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas en una rueda giratoria.Cuando termine, ultracentrifugar la muestra a 100.000 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de la ultracentrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. En este punto, mezcle 300 microgramos de proteína con un milimolar de G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P y 20 microlitros de cinco tampones de captura.Ajuste el volumen de reacción a 100 microlitros con agua. Después de incubar la muestra a cuatro grados centígrados en una rueda giratoria, agregue 10 micromolares de compuesto de captura GMP de matriz cíclica. A continuación, incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas para la fracción soluble o durante la noche para la fracción de membrana en una rueda giratoria en la oscuridad.Después de un breve centrifugado y extracción de la tapa, reticulación mediante la activación de la fracción reactiva del compuesto de captura GMP de la matriz cíclica con luz ultravioleta durante cuatro minutos utilizando una caja de fila de tapa. A continuación, agregue 25 microlitros de cinco tampones de lavado y 50 microlitros de estreptococo AVID bien resuspendido en perlas magnéticas. Homogeneizar suavemente la muestra.A continuación, incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante una hora en una rueda giratoria. Después de capturar las perlas en la tapa con un imán, lave las fracciones solubles seis veces en 200 microlitros de un tampón de lavado X después de lavar una vez en 200 microlitros de agua de grado HPLC lavar seis veces en 200 microlitros de 80% aceto nitrilo, y dos veces en 200 microlitros de agua de grado HPLC para el lavado de fracción de membrana cinco veces en 200 microlitros de un tampón de lavado X y disminuir las concentraciones de turbulencia final beta D multi puric aparte. A continuación, vuelva a suspender las perlas en 20 microlitros de bicarbonato de amonio de 100 milimolares para la fracción soluble y 100 milimolares de bicarbonato de amonio más urea de ocho molares.Para la fracción de membrana, transfiera cada suspensión a tubos de 1,5 mililitros. Después de incubar la fracción de membrana, agregue 0,5 microlitros de 200 milimolares tris. Dos carboxifosfina etílica a ambas fracciones e incubar a 60 grados centígrados durante una hora con agitación a 500 RPM.Una vez que las muestras se hayan enfriado a 25 grados centígrados, agregue 0,5 microlitros de acetamida de 400 milimolares I oto recién preparada después de la incubación en la oscuridad. Añadir 0,5 microlitros de 0,5 molar y acetilcisteína a cada fracción. Luego incubar las muestras a 25 grados centígrados durante 10 minutos con agitación a 500 RPM.En este punto, agregue un microlitro de LY C a la fracción de membrana después de la incubación durante la noche a 37 grados Celsius. Agregue dos microgramos de tripsina a cada muestra y envuélvalas en paraforma para evitar que se sequen. Después de incubar y centrifugar las muestras, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros con la ayuda del imán para evitar que se acumulen las perlas.A continuación, agregue cinco microlitros de ácido tricloroacético al 5% y un microlitro de ácido clorhídrico molar a la fracción soluble, agregue 15 microlitros de ácido tricloroacético al 5% y cinco microlitros de ácido clorhídrico al 5% molar a la condición de la fracción de membrana. C 18 micro columnas de centrifugado con 150 microlitros de aceto nitrilo girando 20 segundos a 2, 400 RPM. Una vez que las columnas se hayan equilibrado dos veces con 150 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%, cargue la muestra y centrifuga durante dos minutos.A 2000 RPM, vuelva a cargar el flujo a través de las columnas. Después de repetir el centrifugado y lavar las columnas con ácido trifluoroacético 0,1 y acetonitrilo, tome un tubo nuevo y eluya dos veces con 150 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1% y 50% de nitrilo aceto. Una vez que los péptidos se hayan secado en una speed vac Resus, vuelva a suspenderlos en 40 microlitros de 98% de agua, 2% de nitrilo acetil y 0,15% de ácido fórmico.Una vez que las muestras se hayan sonicado durante 20 segundos, gírelas hacia abajo durante cinco segundos a 12.000 RPM Después de vórtice y centrifugado, transfiera las muestras a viales de HPLC para el análisis lc MS MS. La lista de resultados inicial de un cultivo de fase logarítmica P aerogen comprende 768 proteínas de fracción soluble y 433 proteínas de fracción de membrana. Después de eliminar las proteínas capturadas no específicamente, la lista se redujo a 76 proteínas de fractura solubles y 133 proteínas de fracción de membrana. Esto incluyó 13 proteínas solubles y 21 proteínas de membrana de P aerogen que se sabe o se predice que se unen al tinte cíclico. Buenas prácticas de fabricación.Las otras 63 proteínas solubles y las 112 proteínas de membrana son nuevas proteínas cíclicas putativas. Proteínas de unión a GMP, que no contienen uno de los dominios de unión a GMP de matriz cíclica conocidos. CCMS con extractos celulares cosechados de diferentes condiciones de crecimiento y con varios troqueles cíclicos intracelulares.También se utilizaron las concentraciones de GMP. En general, se capturó el 74% de los componentes de señalización p aerogénicos, PO de una matriz cíclica conocidos o previstos, GMP. Dado que se demostró que al menos nueve de estos genes se transcriben en condiciones específicas y que algunos pueden no unirse en absoluto a la muerte cíclica, GMP en absoluto, este grado de cobertura podría estar cerca de la saturación.Esto, junto con la observación de que la mayoría de estos componentes fueron capturados con alta especificidad, argumenta fuertemente que esta técnica es efectiva y poderosa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la selección de candidatos potentes se logrará comparando la especificidad de captura de los efectores psíquicos DGP conocidos. Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como Drac, ubi, reticulación, escaneo diferencial, micros de fluorometría o telemetría isotérmica para validar una unión específica de los candidatos al ciclo de esa GMP.

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Biología

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa...

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Se describe un método de longitud de los fragmentos de restricción polimórficos-reacción en cadena de polimerasa mejorado para el genotipado de especies pufferfish por espectrometría de cromatografía / masa líquida. Una columna monolito de sílice de fase inversa se emplea para la separación de amplicones digeridos. Este método puede dilucidar las masas monoisotópicas de oligonucleótidos, que es útil para la identificación de la composición base.

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

Aprende a identificar proteínas efectoras de c-di-GMP mediante espectrometría de masas con compuestos de captura (CCMS). Este método computacional mejora la especificidad y permite condiciones de lavado rigurosas.

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Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

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