Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

El objetivo general de este procedimiento es perfilar los niveles de expresión génica de células madre embrionarias humanas individuales utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa de una sola célula, o R-T-P-C-R. Esto se logra utilizando primero la clasificación de células activadas fluorescentes para clasificar las células individuales en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contiene tampón de lisis celular. El segundo paso es transcribir inversamente el ARN para generar CDNA a partir de lisados de una sola célula.

A continuación, el CDNA se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El paso final es realizar R-T-P-C-R cuantitativo en el CDNA amplificado. En última instancia, este ensayo es útil para estudiar la expresión génica en poblaciones heterogéneas como las células madre embrionarias humanas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los vasos artificiales cuantitativos de células individuales existentes es que este método, EEG y purificación más robusto antes del fax. Las células madre embrionarias humanas OCT cuatro EGFP o Hess se separan de la placa de 60 milímetros. Retire todo el medio, agregue un mililitro de Accutane e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

Neutralice Accutane con un mililitro de centrífuga de medios ES humanos para granular las células, después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en el tampón de fax y ajuste la concentración a una vez 10 a las seis células por mililitro. A continuación, pase la muestra de células a través de un tubo de tapa de filtro de células de 35 micrómetros. Guarde el tubo en hielo antes de clasificar las células.

Comience este procedimiento preparando una mezcla maestra que contenga un microlitro de D Ns de una sola célula y nueve microlitros de solución de lisis de una sola célula. Para cada pocillo, transfiera 10 microlitros de la solución de mezcla a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos para el programa de análisis por fax, el clasificador de células para clasificar las células positivas de EGFP individuales en los pocillos de la placa de PCR de 96 pocillos después de la clasificación de células, incube las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente para la lisis celular. Para detener la reacción de lisis, agregue un microlitro de solución de parada e incube a temperatura ambiente durante dos minutos.

Para comenzar este procedimiento, primero agregue a cada pocillo de la placa de 96 pocillos un Eloqua de 0.5 microlitros de cebadores SMAT 15 y SMAA de 20 micromolares. Calentar las muestras a 80 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de tampón cinco x, dos microlitros de DTT, un microlitro de transcriptasa inversa y un microlitro de D y tps.

Para cada pozo se realiza la transcripción inversa en un termociclador. Ajuste el programa térmico a 42 grados centígrados durante 90 minutos, seguido de 85 grados centígrados durante cinco minutos. Para inactivar la transcriptasa inversa cuando se completa la transcripción inversa, agregue cuatro microlitros de reactivo exo a cada muestra de CDNA e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para digerir el exceso de oligonucleótidos deslizados, seguido de 80 grados Celsius durante 15 minutos.

Para inactivar el reactivo exo, prepare la mezcla de reacción PCR con dos nano molares del cebador SMAP two. Agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción PCR. A cada muestra transcrita al revés.

Realizar la amplificación que consiste en 20 ciclos de desnaturalización, un arrodillamiento y una extensión después de la amplificación de las muestras realizadas dos conjuntos de reacciones cuantitativas R-T-P-C-R en placas separadas para confirmar los resultados de R-T-P-C-R a cada pocillo de las 2 placas de 96 pocillos agregue 10 microlitros de dos x verde cibernético. Mezcla maestra de PCR: un microlitro de CDNA amplificado, dos cebadores y siete microlitros de agua. Configure el programa a 95 grados Celsius durante tres segundos, seguido de 60 grados Celsius durante 30 segundos.

Durante 40 ciclos, se elimina el escalón de rodillas para reducir el error de imprimación. En este estudio, las cantidades de microgramos de ARN total de Hess se diluyeron a niveles de nano y picogramos para evaluar la variabilidad técnica y la detección de diferencias en cantidades bajas de ARN total cuantitativo R-T-P-C-R del gen G-A-P-D-H se realizó mediante resonancia magnética. NA de cáscaras agrupadas diluidas en serie de 10 nanogramos por microlitro a 0,1 picogramos por microlitro. Cada punto muestra el valor CT del ARNm diluido en serie y el ARNm de una sola célula clasificados por fax.

Se observó una correlación entre cada muestra y los resultados del QR TPCR con varias celdas individuales que mostraron valores de CT similares. Se utilizó el fax para clasificar y seleccionar células positivas para EEG FP fuertes de una línea HESC reportera de EGFP de cuatro OCT. Los resultados muestran una población positiva para EGFP de aproximadamente el 60% en comparación con la población negativa para validar la consistencia entre diferentes lotes de reacciones de transcripción inversa y amplificación.

Los lisados de células individuales purificados por fax se dividieron por la mitad y se aplicó el protocolo a cada mitad para las comparaciones de lotes. Se observó una correlación significativa entre el valor de CT de cuatro OCT de cada mitad de lisados de células individuales. Una presentación de mapa de calor de la expresión génica de una sola cáscara muestra un nivel consistente y robusto de expresión de OCT cuatro, pero niveles variables de otro gen marcador de células madre, NAN og tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que este ensayo de expresión génica de una sola célula es útil para estudiar las heterogeneidades poblacionales de células madre pluripotentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar correctamente el QITP para el transcriptoma de una sola célula.