Name: Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a perfilar la expresión génica en células madre embrionarias humanas individuales mediante RT-PCR cuantitativa. Este método revela heterogeneidades poblacionales esenciales para la medicina regenerativa.

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Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Lee valiosa para los debates sobre el manuscrito. El trabajo en el laboratorio de Lee fue apoyado por becas de Robertson Investigator Award de la Fundación de Células Madre de Nueva York y de Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Preparación de una placa de 96 pocillos <ol><li> Mezclar 1 l de Single Cell Dnase1 a 9 l Single Cell Lysis Solution. </li><li> Ponga la 10 l solución mixta en cada pocillo de placas de 96 pocillos PCR. </li></ol> 2. Extracción hESCs para FACS Purificación <ol><li> Separar Oct4 :: línea celular EGFP ES desde el plato de 60 mm con 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, la cual se neutralizó con los medios de comunicación ES humana. </li><li> Preparar población de células en 1 ml de tampón FACS y ajustar la celda a 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Pasar la muestra de células a través de un tubo con tapa de filtro de células de 35 micras. </li><li> Guarde el tubo en hielo antes de la clasificación de células. </li></ol> 3. Lisis de purificado FACS celda única en cada pocillo de la placa de 96 pocillos <ol><li> Ordene la muestra para células positivas EGFP en un clasificador de células con un operador entrenado. Ponga la única célula en una solución Lysis/DNase1 Single Cell en placas de 96 pocillos PCR. Si es necesario, el 9Placa de 6 pocillos con muestra puede ser almacenada en un -80 ° C congelador menos de un mes. </li><li> Incubar las muestras 5 min a TA durante la lisis celular. </li><li> Añadir 1 l de solución de parada para detener la reacción de lisis. </li><li> Incubar 2 min a TA. </li></ol> 4. Transcripción inversa <ol><li> Añadir en cada una alícuota de 0,5 l de 20 mM SMA-T15, SMA-A. </li><li> Añadir 4 l de tampón 5X, 2 l de DTT, 1 l de la transcriptasa inversa, y 1 l de dNTP a cada pocillo. </li><li> Realizar la transcripción inversa en un termociclador. <ol><li> Establecer el programa térmica a 42 ° C × 90 min e inactivar la transcriptasa inversa a 85 ° C × 5 min. </li></ol></li></ol> 5. Amplificación <ol><li> Añadir 4 l de reactivo ExoSAP-IT a cada muestra invertir transcritas. <ol><li> Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min y 80 ° C durante 15 minutos para inactivar el reactivo ExoSAP-IT. </li></ol></li><li> Prepare la mezcla de reacción de PCR wITH SMA-P2 (2 nM) </li><li> Añadir 10 l de mezcla de reacción de PCR para cada muestra transcripción inversa. </li><li> Realizar la amplificación, que consta de 20 ciclos de desnaturalización (94 ° C durante 30 segundos), recocido (57 ° C durante 30 seg), y extensión (68 ° C durante 10 min). </li></ol> 6. Rendimiento QRT-PCR <ol><li> Añadir 10 l de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 l de ADNc amplificado, 2 nM primers, y 7 l de agua a cada pocillo. <ol><li> Establecer el programa seguido de 95 ° C durante 3 segundos, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos. </li></ol></li><li> Lleve a cabo por duplicado de los errores técnicos. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Solo gen celular de perfiles podría ser una herramienta importante para predecir la funcionalidad de una sola célula o una población entera. Debido a limitaciones técnicas, todo el análisis de perfiles de genes se ha restringido a los promedios de la población. Se han propuesto variaciones en los patrones y niveles entre las células individuales y las subpoblaciones de expresión de genes para causar una interpretación errónea. Estos aspectos celulares diversos se pueden encontrar en hESCs y su heterogeneidad hace que su...

Poblaciones eucariotas más altas son heterogéneos por lo tanto con el análisis de la población total combinada, a menudo es difícil de interpretar sus características celulares. Las células individuales dentro de una población pueden ser sutilmente diferente, y estas diferencias pueden tener consecuencias importantes para la propiedad y el funcionamiento de toda la población de 1, 2. Especialmente, las células madre embrionarias humanas (hESCs) son conocidos por ser heterogéneo, lo que provoca diferentes niveles de pluripotencia y diversas posibilidades para la especificación de linaje en delicadamente formas distintivas 3, 4. Por ejemplo, diferentes antígenos de superficie celular se pueden utilizar para clasificar las células madre pluripotentes no diferenciadas, 5 y el grupo de Austin Smith propuesto diferentes niveles de la pluripotencia en células madre embrionarias de ratón, sobre la base de su morfología, la propensión diferenciación y la dependencia de la vía de señalización 6. Este fenómeno se planteó la hipótesis de embrión humanolas células madre de la NIC 7. Mientras que los estudios se realizaron en general entre las diferentes líneas de células madre, las células madre no solo individuo, que podría ser muy interesante para analizar los diferentes niveles de la pluripotencia en el nivel de células individuales, lo que potencialmente afecta a su capacidad de diferenciación hacia todos los linajes de células somáticas. Heterogeneidad celular y molecular podría ser dictada por la transcripción de perfiles, que se llama la &#39;transcriptoma de células individuales &quot;y hace hincapié en nuevos enfoques para cuantificar los niveles de expresión de genes 8-10. Para el análisis de los niveles de expresión de genes en células individuales, hemos desarrollado un protocolo sencillo, pero robusto de una sola célula RT-PCR cuantitativa. Se confirmó la eficacia y la viabilidad de nuestro protocolo mediante la comparación de cada mitad de lisados ​​de células individuales, así como diluidos en serie RNAs totales de hESCs, dando como resultado variaciones técnicas mínimas y las diferencias. Además, se utilizó una línea reportero genética para aislar p homogéneaoblación de hESCs utilizando sistema de selección de genes. El vector donante para la orientación locus Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro construir) y un par de plásmidos TALEN se utilizaron 11. El vector de donantes y un par de plásmidos Talen se introdujeron en hESCs (H9, WA09) utilizando nuestra nucleofection y protocolo de selección clonal y el mantenimiento de hESCs se realizó sobre la base de nuestro protocolo de rutina 12. Se confirmó esta línea genética reportero expresar EGFP para la expresión OCT4 en OCT4 :: EGFP hESCs. Nuestro resultado demuestra que hESCs individuales (ordenados por OCT4 :: células fuertemente positivas EGFP) mantienen altos niveles de expresión OCT4, pero diferentes niveles de expresión de NANOG. Así, nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para estudiar las heterogeneidades de la población de células madre pluripotentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de PCR de 96 pocillos</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lisis celular Ambion</td> Life <td>Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe transcriptasa inversa</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymerasa</td><td>Invitrogen</td> de alta fidelidad <td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tampón</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu; l DNasa, filtro esterilizado 35</td></tr><tr><td>&mu; m tubos de tapón de filtro de células BD</td><td>Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de células madre embrionarias humanas individual por rt-pcr cuantitativa

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

La heterogeneidad de la población de células madre dificulta la comprensión detallada de la biología de células madre, tales como su propensión hacia la diferenciación de diferentes linajes. Un único ensayo transcriptoma de células puede ser un nuevo enfoque para la disección de la variación individual. Hemos desarrollado el método de QRT-PCR de una sola célula, y confirmado que este método funciona bien en varios perfiles de expresión génica. En el nivel de una sola célula, cada célula madre embrionarias humanas, ordenados por OCT4 :: células positivas EGFP, tiene una alta expresión en OCT4, pero un nivel diferente de expresión NANOG. Nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para interrogar a las heterogeneidades de la población.

Amplificación de ARN de una sola célula eficiente y robusto Para reducir al mínimo la variación transcripcional entre hESCs, utilizamos OCT4 :: EGFP células madre clon para la purificación FACS. Después de la clasificación Oct4 :: células EGFP positivas en una placa de 96 pocillos, cada célula se lisaron en tampón de lisis y se convierte poli (A) + ARN a ADNc de longitud completa usando SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) y cebador de anclaje con SM...

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar los niveles de expresión génica de células individuales de células madre embrionarias humanas mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción reversa de una sola célula, o R-T-P-C-R. Esto se logra primero utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia para separar células individuales en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contiene tampón de lisis celular. El segundo paso consiste en transcribir a la inversa el ARN para generar ADNc a partir de lisados de una sola célula.A continuación, el ADNc se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa. El paso final consiste en realizar una R-T-P-C-R cuantitativa sobre el ADNc amplificado. En definitiva, este ensayo es útil para estudiar la expresión génica en poblaciones heterogéneas, como las células madre embrionarias humanas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos cuantitativos existentes de vaso artificial unicelular es que este método es más eficiente y robusto antes de la purificación por fax. Las células madre embrionarias humanas OCT4-EGFP o Hess se separan de la placa de 60 milímetros. Elimine todo el medio, agregue un mililitro de Accutase e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos.Neutralice el Accutane con un mililitro de medio para células ES humanas, centrifugue para obtener el sedimento celular, deseche el sobrenadante, re suspenda las células en tampón fax y ajuste la concentración a uno por diez a la seis células por mililitro. A continuación, pase la muestra celular a través de un tubo cónico con filtro de 35 micrómetros. Almacene el tubo en hielo antes de la clasificación celular.Comience este procedimiento preparando una mezcla maestra que contenga un microlitro de D Ns uno de célula individual y nueve microlitros de solución de lisis de célula individual. Para cada pozo, transfiera 10 microlitros de la mezcla a cada pozo de una placa PCR de 96 pozos para el programa de análisis por fax, y use el clasificador celular para separar células individuales positivas para EGFP en los pozos de la placa PCR de 96 pozos. Después de la clasificación celular, incube las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente para lograr la lisis celular. Para detener la reacción de lisis, agregue un microlitro de solución de paro e incube a temperatura ambiente durante dos minutos.Para comenzar este procedimiento, agregue primero a cada pocillo de la placa de 96 pocillos 0,5 microlitros de Eloqua de cebadores SMAT 15 y SMAA de 20 micromolares. Incube las muestras a 80 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de tampón 5x, dos microlitros de DTT, un microlitro de transcriptasa inversa y un microlitro de D y tps.En cada pocillo, realice la transcripción inversa en un termociclador. Establezca el programa térmico a 42 grados Celsius durante 90 minutos, seguido de 85 grados Celsius durante cinco minutos. Para inactivar la transcriptasa inversa cuando la transcripción inversa haya finalizado, agregue cuatro microlitros de reactivo exo a cada muestra de ADNc, incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para digerir los oligonucleótidos y cebadores en exceso, seguido de 80 grados Celsius durante 15 minutos.Para inactivar el reactivo exo, prepare la mezcla de reacción de PCR con dos nanomolares del cebador SMAP2. Añada 10 microlitros de la mezcla de reacción de PCR a cada muestra retrotranscrita.Realice la amplificación consistente en 20 ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión. Después de la amplificación de las muestras, realice dos conjuntos de reacciones cuantitativas de R-T-P-C-R en placas separadas para confirmar los resultados de R-T-P-C-R. A cada pocillo de las dos placas de 96 pocillos, añada 10 microlitros de la mezcla maestra de colorante verde ciber dos veces, un microlitro de ADNc amplificado, dos cebadores y siete microlitros de agua. Establezca el programa a 95 grados Celsius durante tres segundos, seguido de 60 grados Celsius durante 30 segundos.En 40 ciclos, se elimina un paso de rodillas para reducir el error del cebador. En este estudio, cantidades en microgramos de ARN total de Hess se diluyeron hasta niveles de nanogramos y picogramos para evaluar la variabilidad técnica y la detección de diferencias; se realizó una R-T-P-C-R cuantitativa del gen G-A-P-D-H con cantidades bajas de ARN total utilizando ARN.M de fundas agrupadas diluidas en serie desde 10 nanogramos por microlitro hasta 0,1 picogramos por microlitro. Cada punto muestra el valor de CT de ARN mensajero diluido en serie y de ARN mensajero de una sola célula clasificado por fax.Se observó una correlación entre cada muestra y los resultados de PCR cuantitativa con varios células individuales que mostraron valores de CT similares. Se utilizó FACS para clasificar y seleccionar células fuertemente positivas para EEG FP a partir de una línea de CESH con reportero OCT4-EGFP. Los resultados muestran una población positiva para EGFP de aproximadamente el 60 % en comparación con la población negativa, lo que valida la consistencia entre diferentes lotes de reacciones de transcripción inversa y amplificación.Los lisados de células individuales purificados por Fax se dividieron en dos mitades y se aplicó el protocolo a cada mitad para comparaciones por lotes. Se observó una correlación significativa entre los valores de CT de OCT cuatro en cada mitad de los lisados de células individuales. Una representación en mapa de calor de la expresión génica en células individuales muestra un nivel constante y robusto de expresión de OCT cuatro, pero niveles variables de otro gen marcador de células madre, NAN og. En conjunto, nuestros resultados demuestran que este ensayo de expresión génica en células individuales es útil para estudiar las heterogeneidades poblacionales de las células madre pluripotentes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar adecuadamente la QITP para el transcriptoma de una sola célula.

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