Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

El objetivo general de este procedimiento es medir la adhesión firme de neutrófilos mediante un ensayo con cámara de flujo que permite la adhesión de neutrófilos humanos en presencia de estrés de corte. Esto se logra primero preparando un sustrato de moléculas de adhesión purificadas o una superficie celular endotelial, como células endoteliales de vena umbilical humana o ve. El segundo paso consiste en separar neutrófilos de sangre periférica humana utilizando un método de centrifugación en dos capas con PHI.

A continuación, se ensambla la cámara de flujo para permitir la inyección de neutrófilos humanos aislados bajo estrés de cizalladura sobre un sustrato de adhesión, ligandos o ve. El último paso consiste en registrar los eventos de adhesión de neutrófilos en la cámara de flujo, seguido de una cuantificación cuidadosa de la adhesión firme. En última instancia, el ensayo en cámara de flujo se utiliza para demostrar la adhesión firme de neutrófilos hacia moléculas de adhesión purificadas y una superficie HX.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como la importancia funcional de las variaciones genéticas en moléculas tisulares que se sabe están asociadas con el desarrollo de la autoinmunidad. Estudios genéticos en pacientes con lupus eritematoso sistémico han demostrado una fuerte asociación con variantes en la integrina Abeta dos, una proteína implicada en la adhesión firme de neutrófilos. Desarrollamos este sistema de ensayo para evaluar las consecuencias funcionales de la variación genética en esta endocrina beta dos llamada Mac uno sobre la adhesión firme. Para preparar las placas de cultivo para su uso en la cámara de flujo.

Añada un mililitro de una solución de fibrina y gelatina a cada placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros y pipetee varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa esté recubierta. Retire el exceso de solución de fibronectina y gelatina y seque las placas al aire durante al menos 30 minutos. Para optimizar la formación de la matriz proteica, recolecte células endoteliales de vena umbilical humana o qve que se hayan cultivado hasta un 80 a 90 % de confluencia utilizando tripsina-EDTA y siembre 500 000 células en cada placa de cultivo recubierta.

Añada dos mililitros de medio de crecimiento a cada placa e incube a 37 grados Celsius. Las células con 5%CO2 deben inspeccionarse visualmente diariamente, con cambios de medio cada dos días. Permita que las células crezcan hasta alcanzar una confluencia del 80 al 90 %.

Para comenzar este procedimiento, utilice un marcador o bolígrafo para dibujar un círculo de 0,5 centímetros de diámetro en el centro de una placa de cultivo celular de 35 milímetros. Añada 20 microlitros de una solución de proteína A a 20 microgramos por mililitro en el área marcada. Use la punta de pipeta para extender la solución de proteína A, cubriendo toda el área dentro del círculo de 0,5 centímetros de diámetro.

Es importante no tocar ni rayar la superficie del recipiente. Incubar las placas de cultivo celular a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, lavar cada placa recubierta con la proteína a tres veces con un mililitro de PBS.

Después de eliminar el PBS de la tercera placa de lavado, añada 50 microlitros de BSA al 1 % en el área marcada para bloquear la unión no específica en la placa. Incube a cuatro grados Celsius durante dos horas. Después de dos horas.

Lave la placa bloqueada tres veces con un mililitro de PBS. Prepare las soluciones de proteína quimérica del ligando del receptor de adhesión FC para el recubrimiento y este experimento, y se utilizará ICAM-1 FC Quimera a 25 microgramos por mililitro y P-selectina FC Quimera a 0,5 microgramos por mililitro. Recubra el área marcada con 50 microlitros del sustrato e incube las placas de cultivo celular durante la noche a cuatro grados Celsius.

Los pocillos deben usarse dentro de los dos días, y no debe permitirse que el área recubierta se seque. Si es necesario, agregue PBS para mantener los 50 microlitros de solución en la placa.

Los neutrófilos para este estudio se aíslan de la sangre de participantes que han dado su consentimiento informado por escrito. Después de extraer la sangre mediante flebotomía en un tubo de recogida con anticoagulante o vacutainer, diluya la sangre al 1:1 con PBS y realice todos los pasos de este procedimiento. A temperatura ambiente, prepare una columna de dos capas de Ficoll para separar las células mononucleares de la sangre periférica o PBMCs y los neutrófilos en tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Primero, agregue 15 mililitros de solución densa de PHI y luego, con cuidado, superponga 10 mililitros de solución liviana de fi sobre la solución densa de fi. Debe haber una frontera nítida entre las capas de solución liviana y densa de fi. Finalmente, coloque cuidadosamente 25 mililitros de la muestra de sangre diluida sobre la solución liviana de fi sin perturbar el PHI.

Llame a la capa de centrifugado los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente después de la centrifugación; deben estar presentes múltiples capas. La capa de neutrófilos con pocas células rojas se encuentra entre el medio ligero y el medio pesado de phi. Utilice una pipeta de transferencia para cosechar y transferir la capa de neutrófilos a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue PBS hasta un volumen final de 50 mililitros.

Centrifugar a 225 ×g durante 10 minutos. A temperatura ambiente después de la centrifugación, aún podrían quedar glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspirar el sobrenadante hasta dejar 10 mililitros.

Marque Resus. Suspenda el sedimento de neutrófilos y glóbulos rojos mediante vortexado breve a baja velocidad y luego lave nuevamente con 50 mililitros de PBS. Aspire el sobrenadante para eliminar los glóbulos rojos contaminantes. Resuspenda las células sedimentadas en el PBS residual mediante vortexado breve a baja velocidad.

Añada 25 mililitros de agua y mezcle suavemente mediante vortex durante 10 segundos. A los piojos. A los glóbulos rojos añada 25 mililitros de cloruro de sodio al 1,8 % y mezcle inmediatamente mediante centrifugación a 225 ×g durante 10 minutos.

Las células sanguíneas rojas contaminantes ahora deben estar lisadas, dejando un sedimento celular blanco de neutrófilos. Lave el sedimento celular de neutrófilos con PBS, deseche el sobrenadante y resuspenda los neutrófilos aislados en medio RPMI con 10 % FBS. Tras determinar la concentración celular bajo un microscopio óptico con un hemocitómetro, ajuste la densidad celular a 500.000 células por mililitro con medio RPMI completo con 10 % FBS.

Antes de comenzar el ensayo de adhesión en cámara de flujo, estimule el VE con 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa humano durante cuatro a seis horas para aumentar y estimular la expresión de moléculas de adhesión. Cuando el VE esté listo, arme la cámara de flujo. Coloque el platillo de 35 milímetros que contiene el VE confluyente sobre la mesa del microscopio.

Para los fines de este video, solo se examinará la adhesión de neutrófilos a VE, pero el mismo procedimiento se aplica al estudio de la adhesión de neutrófilos a moléculas de adhesión purificadas; conecte la cámara de flujo de placas paralelas con la bomba de jeringa y el sistema de vacío, dejando una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo encima de la placa y asegure el ensamblaje de la cámara de flujo. Inicie el programa de grabación de video en la computadora conectada al microscopio.

Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta que sea visible un campo claro con VE completamente desarrollado. Utilizando la bomba de jeringa, enjuague la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara ni en la línea de entrada de neutrófilos.

Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas. Grabe el video porque la adhesión de neutrófilos puede ocurrir rápidamente; generalmente, un video de cuatro a cinco minutos es suficiente para cuantificar los eventos de adhesión para su análisis. Este clip muestra un ejemplo de neutrófilos que se unen a una cámara de flujo recubierta con HU E.

Una célula adherente se define como una célula que se mueve menos de un diámetro celular dentro de cinco segundos. En la superficie recubierta con HU e. Aquí se muestran capturas de pantalla en diferentes momentos a partir de videos de muestra de neutrófilos que se adhieren a una superficie recubierta con ICAM uno P selectina, o a una superficie recubierta con uve.

En ambos experimentos, la velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 microlitros por minuto con una densidad de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. En condiciones típicas, se observó que entre 50 y 70 neutrófilos humanos se adhirieron firmemente a la superficie recubierta con ligando o VE durante un período de grabación de cuatro minutos. Sin embargo, variantes alélicas de las moléculas de adhesión de neutrófilos o variantes alélicas en el sustrato podrían alterar sustancialmente la adhesión cuantitativa de neutrófilos al grabar videos de duración similar con diferentes donantes.

Los neutrófilos, el número de células adheridas por minuto puede calcularse para comparar las propiedades de adhesión entre diferentes donantes. Al realizar este procedimiento, es importante recordar verificar visualmente los neutrófilos en busca de agregación celular causada por la activación inducida durante el aislamiento. Además, se puede realizar una evaluación paralela mediante citometría de flujo para asegurar que el estado de activación de las células sea comparable entre donantes y entre experimentos.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran la adhesión celular en células humanas primarias procedentes de donantes de genotipos con diferentes alelos en la región codificante de la cadena CD11B del integrina beta dos, MAC-1. Estos estudios han permitido una evaluación cuidadosa y cuantitativa del impacto funcional de estas variantes alélicas en el sistema humano.