Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

El objetivo general de este procedimiento es medir la adhesión firme de los neutrófilos mediante un ensayo de cámara de flujo que permite la adhesión de los neutrófilos humanos en presencia de tensión de cizallamiento. Esto se logra preparando primero un sustrato de moléculas de adhesión purificadas o una superficie de célula endotelial, como la vena umbilical humana, las células endoteliales o ve. El segundo paso es separar los neutrófilos de la sangre periférica humana utilizando un método de centrifugación de dos capas llamado PHI.

A continuación, la cámara de flujo se ensambla para permitir la inyección de los neutrófilos humanos aislados bajo esfuerzo de cizallamiento sobre el sustrato de adhesión, ligandos o ve. El paso final es registrar los eventos de adhesión de los neutrófilos en la cámara de flujo, seguido de una cuantificación cuidadosa de la adhesión firme. En última instancia, el ensayo de cámara de flujo se utiliza para mostrar una adhesión firme de los neutrófilos hacia las moléculas de adhesión purificadas y una superficie HX.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo autoinmune, como la importancia funcional de las variaciones genéticas en las moléculas de un tejido que se sabe que están asociadas con el desarrollo de la autoinmunidad. Los estudios genéticos en pacientes con ptosis de lupus eritema sistémico han demostrado una fuerte asociación con variantes y la integrina Abeta dos, una proteína involucrada en la adhesión firme de los neutrófilos. Desarrollamos este sistema de ensayo para evaluar las consecuencias funcionales de la variación genética en este sistema endocrino beta llamado Mac one sobre la adhesión firme para preparar las placas de cultivo para su uso en la cámara de flujo.

Agregue un mililitro de una solución de fibrina y gelatina a cada placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros y pipetea varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa esté cubierta. Retire el exceso de fibronectina y la solución de gelatina y seque las placas al aire durante al menos 30 minutos. Para optimizar la formación de la matriz de proteínas, coseche células endoteliales de la vena umbilical humana o qve que se hayan cultivado hasta un 80 a 90% de confluencia utilizando tripsina EDTA semilla 500, 000 células en cada placa de cultivo de tejido recubierta.

Agregue dos mililitros de medio de crecimiento a cada plato e incube a 37 grados centígrados. Las células de CO2 al 5% deben inspeccionarse visualmente diariamente con cambios de medio cada dos días. Permita que las células crezcan hasta un 80 a 90% de confluencia.

Para comenzar este procedimiento, use un marcador o bolígrafo para dibujar un círculo de 0,5 centímetros de diámetro en el centro de una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros. 20 microlitros de una proteína de 20 microgramos por mililitro, una solución en el área marcada. Utilice la punta de la pipeta para esparcir la proteína, una solución para cubrir toda el área dentro del círculo de 0,5 centímetros de diámetro.

Es importante no tocar ni rayar la superficie del plato. Incubar las placas de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, lave cada proteína en un plato recubierto tres veces con un mililitro de PBS.

Después de retirar el PBS de la tercera placa de lavado, 50 microlitros de 1%BSA en el área marcada para bloquear la unión inespecífica en la placa. Incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de dos horas.

Lave la placa bloqueada tres veces con un mililitro de PBS. Prepare las soluciones de proteínas quiméricas del ligando del receptor de adhesión FC para el recubrimiento y este experimento e ICAM se utilizará un FC Kyra a 25 microgramos por mililitro y una P selectina FC Kyra a 0,5 microgramos por mililitro. Cubra el área marcada con 50 microlitros del sustrato, incube las placas de cultivo de tejidos durante la noche a cuatro grados centígrados.

Los platos deben usarse dentro de los dos días y no se debe permitir que el área cubierta se seque. Si es necesario. Agregue PBS para mantener los 50 microlitros de solución en el plato.

Para este estudio, los neutrófilos se aíslan de la sangre de los participantes que han dado su consentimiento informado por escrito. Después de recolectar sangre por flebotomía en un tubo de recolección de sangre anticoagulante o vacutainer, diluya la sangre uno a uno con PBS y realice todos los pasos de este procedimiento. A temperatura ambiente, prepare una capa de dos capas para separar células mononucleares de sangre periférica o p BMC y neutrófilos en tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Primero, agregue 15 mililitros de llamada PHI pesada y luego superponga cuidadosamente 10 mililitros de llamada de luz sobre la llamada de alta frecuencia. Debe haber un borde nítido entre las capas de llamada de fi ligera y de llamada de fi pesada. Finalmente, coloque cuidadosamente 25 mililitros de la muestra de sangre diluida sobre la señal ligera sin alterar la PHI.

Llame a la capa centrífuga los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente después de la centrifugación, debe haber varias capas. La capa de neutrófilos con pocos glóbulos rojos se encuentra entre el phi ligero y el pesado. Llame mediante una pipeta de transferencia a la recolección y transfiera la capa de neutrófilos a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue PBS hasta un volumen final de 50 mililitros.

Centrifugar a 225 veces G durante 10 minutos. A temperatura ambiente después de la centrifugación, todavía puede haber glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspire el sobrenadante hasta los 10 mililitros.

Marcos Resus. Suspenda el gránulo de glóbulos rojos de neutrófilos brevemente, en vórtice a baja velocidad y luego lave nuevamente con 50 mililitros de PBS para aspirar el sobrenadante para eliminar los glóbulos rojos contaminantes. Vuelva a suspender las células peletizadas en el PBS residual mediante un breve vórtice de baja velocidad.

Agregue 25 mililitros de agua y agite suavemente durante 10 segundos. A los piojos. Los glóbulos rojos añaden 25 mililitros de cloruro de sodio al 1,8% y se mezclan inmediatamente por centrifugación a 225 veces G durante 10 minutos.

Los glóbulos rojos contaminantes ahora deben ser depositados dejando una bolita blanca de células de neutrófilos. Lave el pellet de la célula de neutrófilos con PBS, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los neutrófilos aislados en medio RPMI con 10% de FBS. Después de determinar la concentración celular bajo un microscopio óptico con un hemocitómetro, ajuste la densidad celular a 500, 000 células por mililitro con medio RPMI 10% FBS completo.

Antes de comenzar el ensayo de adhesión a la cámara de flujo, prepare el VE con 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa humano durante cuatro a seis horas para regular al alza y estimular la expresión de la molécula de adhesión. Cuando los VE estén listos, ensamble la cámara de flujo. Coloque el plato de 35 milímetros que contiene el VE confluente sobre la mesa del microscopio.

A los efectos de este video, solo se examinará la adhesión de los neutrófilos a la VE, pero el mismo procedimiento se aplica al estudio de la adhesión de los neutrófilos a las moléculas de adhesión purificadas, conecte la cámara de flujo de la placa paralela con la bomba de jeringa y el sistema de vacío y deje una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo en la parte superior de la placa y fije el conjunto de la cámara de flujo. Inicie el programa de grabación de video en la computadora conectada al microscopio.

Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta que se vea un campo claro con EV completamente desarrollado. Con la bomba de jeringa, enjuague la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara o la línea de entrada de neutrófilos.

Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas. Grabe el video debido a que la adhesión de los neutrófilos puede ocurrir rápidamente, un video de cuatro a cinco minutos suele ser suficiente para cuantificar los eventos de adhesión para el análisis. Este videoclip muestra un ejemplo de neutrófilos que se unen a una cámara de flujo recubierta de HU E.

Una célula adherente se define como una célula que se mueve menos de una célula de diámetro en cinco segundos. En la superficie revestida HU e. Aquí se muestran capturas de pantalla en diferentes puntos de tiempo de videos de muestra de neutrófilos adheridos a una superficie recubierta de ICAM one P selectin o una superficie recubierta de uve.

En ambos experimentos, la velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 microlitros por minuto con una densidad de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. En condiciones típicas, se observó que de 50 a 70 neutrófilos humanos se adhirieron firmemente al ligando o a la superficie recubierta de VE durante un período de registro de cuatro minutos. Sin embargo, las variantes alélicas de las moléculas de adhesión de los neutrófilos o las variantes alélicas en el sustrato podrían alterar sustancialmente la adhesión cuantitativa de los neutrófilos mediante la grabación de vídeos de duración similar con diferentes donantes.

Neutrófilos, se puede calcular el número de células de adherencia por minuto para comparar las propiedades de adhesión entre diferentes donantes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe verificar visualmente los neutrófilos para detectar el pinzamiento celular causado por la activación celular inducida por el aislamiento. Además, se puede realizar una evaluación citométrica de flujo paralelo de la activación celular para garantizar que el estado de activación de las células coincida entre los donantes y entre los experimentos.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran la adhesión celular en células humanas primarias de donantes de genotipos que tienen diferentes alelos de la región codificante de la cadena CD 11 B de la integrina beta dos, MAC uno. Estos estudios han permitido una evaluación cuidadosa y cuantitativa del impacto funcional de estas variantes alélicas en el sistema humano.