Name: Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprende a medir la adhesión firme de neutrófilos humanos usando un ensayo de cámara de flujo bajo estrés de cizallamiento. Este método permite investigar interacciones celulares y factores genéticos asociados con enfermedades autoinmunes.

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Este trabajo es patrocinado por el Instituto de Investigación de Lupus (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 y NIH UL1-TR00165. Agradecemos al Dr. Robert P. Kimberly por su continuo apoyo.

Todos los donantes reclutados para este estudio dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por la Universidad de Alabama en Birmingham Junta de Revisión Institucional. 1. HUVEC Cultura Inicial y Subcultura <ol><li> Cultura vena células endoteliales umbilicales humanas (HUVEC) in vitro en medio de crecimiento completo que se compone de medio basal de células endoteliales (ver Lista de Materiales) suplementado con factores de crecimiento de células endoteliales. Nota: Los factores de crecimiento utilizados en este estudio incluyen: 5 ng / ml de factor recombinante de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina y 50 ng / ml de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de suero fetal bovino (FBS), / ml de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF),, Factor de 0,5 ng 10 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos humano-básico con heparina (hFGF-B) 20 ng / ml humana recombinante de crecimiento tipo insulina ( R3-IGF-1), 1 g de ácido ascórbico / ml, y 22,5 mg / ml de heparina. El medio completose prepara inicialmente a 37 ° C y a continuación se puede almacenar a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes de preparación. </li><li> Para preparar un matraz de células, se añade medio de crecimiento completo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm 2 (1 ml / 5 cm 2) y luego se deja que el matraz se equilibre a 37 ° C / 5% de CO 2 en un incubador humidificado para por lo menos 30 min. HUVEC humano se sembró directamente en este frasco de cultivo equilibrado a una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2. </li><li> Mientras los medios de comunicación está equilibrando, descongelar rápidamente el vial de stock HUVEC en un baño de agua a 37 ° C. Dispersar las células en el vial de almacenamiento original por agitación y luego añadirlos directamente en el matraz de cultivo que contiene el medio de crecimiento completo HUVEC pre-equilibrada para lograr una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2. Agite suavemente el frasco para distribuir uniformemente las células y luego devolver el frasco a la incubadora. Estas células representan ahora el paso 1 ª. </li> &lt;li&gt; Medio se debe cambiar cada dos días hasta que las células son del 70-80% confluente. </li><li> El HUVEC ahora se puede cosechar del matraz de cultivo con tripsina / EDTA. El medio de cultivo se aspiró de los frascos de cultivo, seguido de un enjuague con PBS para eliminar cualquier proteína residual y de calcio de las células. Se añade una solución de tripsina-EDTA 0,25% y el plazo de 2-6 min desprendimiento de las células debe ser evidente según lo evaluado por microscopía de luz. </li><li> Cuando el 90% de las células se redondean hasta fuera de la placa, detener la tripsinización mediante la adición de un volumen igual de inhibidor de tripsina de 2x. Para facilitar la recolección de las células, añadir otra cantidad igual de medio de cultivo completo. Transferir las células separadas a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril. </li><li> Centrifugar las células desprendidas a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, y a continuación, volver a suspender las células en 2-3 ml de medio de crecimiento completo. Determinar la concentración celular y la viabilidad utilizando un hemocitómetro y azul de tripano. </li><li> Para utilizar ªe las células para su estudio, volver a sembrar otros 75 cm 2 frascos con las células a una densidad de 10.000 células / cm 2 cosechado y vaya al paso 2.2. Alternativamente, las células pueden ser congeladas en este punto para futuros estudios. Para la congelación de células, sedimentar las células por centrifugación a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en FBS que contiene 10% de DMSO a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. La suspensión de células se transfiere luego a crioviales y se almacenó a -80 ° C después de la congelación de las células en un recipiente de congelación de células. </li></ol> 2. Preparación de HUVEC Capa <ol><li> El uso de congelados HUVECs paso 2 ª: la reactivación y la cultura. Si el uso de células en crecimiento activo, vaya al paso 2.2. <ol><li> Descongele el vial que contiene 2 HUVECs paso nd del paso 1.8 rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Transferencia de células de la criovial a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, y añadir 10 ml de Medi crecimientoum. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante para eliminar el DMSO residual. </li><li> Resuspender el sedimento celular con medio de crecimiento completo y transferir las células en un matraz de 75 cm 2. Añadir medio de crecimiento a un volumen total de cerca de 20-25 ml y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Examine visualmente el cultivo celular para la confluencia cada día con los cambios de los medios de comunicación cada dos días. Por lo general, el plazo de 2-4 días, las células llegarán a 80-90% de confluencia en el que el tiempo que estará listo para su uso en el ensayo de la cámara de flujo. </li><li> Para preparar la placa de cultivo que se utilizará en la cámara de flujo (véase la Sección 5), añadir 1 ml de 10 mg / ml de fibronectina y 0,05% (w / v) de gelatina a un 35 mm de placa de cultivo de tejido y la pipeta varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa se recubre. Eliminar la solución de fibronectina y gelatina excesiva y el aire seco de la placa durante al menos 30 min para optimizar la formación de la matriz de proteínas. El fsolución ibronectin y gelatina se puede reutilizar hasta 10 veces. </li><li> Recoger las células HUVEC en el paso 2.2 utilizando tripsina-EDTA como se describe en los pasos 1.5 a 1.7. Seed 500.000 células en cada placa de cultivo de tejidos recubiertos. Añadir 2 ml de medio de crecimiento en cada plato y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Permiten a las células a crecer hasta confluencia como en el paso 2.2. Las células deben ser inspeccionados visualmente a diario con cambios de medio cada dos días. Antes de la cámara de ensayo de flujo, el primer HUVEC con 20 ml de TNF-α ng / humano para 4-6 h para regular al alza y estimular la expresión de adhesión molecular. </li></ol> 3. Purificada ligando Revestimiento <ol><li> Dibuje un círculo de 0,5 cm de diámetro con un marcador o un bolígrafo en el centro de un 35 mm de placa de cultivo de tejido. </li><li> Placa 20 l de 20 mg / ml de proteína A en la zona marcada. Use la punta de la pipeta para difundir la proteína de una solución para cubrir toda el área dentro del círculo de diámetro 0,5 cm. Es importante no tocar o rayar la superficie de la dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar las proteína-A revestidos placa 3x con 1 ml de PBS (pH 8,0). </li><li> Placa de 50 l 1% de BSA en la zona marcada para bloquear la unión no específica en la placa. Se incuba durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar la placa 3x los bloqueados con 1 ml de PBS como en el paso 3.3. </li><li> Preparar las soluciones de proteínas quiméricas de ligando-receptor de Fc adherencia para el recubrimiento. En este experimento, se utilizó una solución ICAM-1/Fc quimera a 25 mg / ml y una quimera P-Selectin/Fc a 0,5 mg / ml en PBS (pH 8,0). </li><li> Cubra el área marcada con 50 l de sustrato. Incubar toda la noche a 4 ° C. El plato se debe utilizar dentro de dos días y el área recubierta no se debe permitir que se sequen. Añadir PBS si es necesario para mantener la solución 50 l en la placa. </li></ol> 4. Separación de neutrófilos (todos los pasos realizados a temperatura ambiente) <ol><li> Después de obtener el consentimiento informado, recoger la sangre de los participantes por la flebotomía en unn anticoagulante tubo de recogida de sangre o Vacutainer (EDTA o heparina). Después de la extracción de sangre, se diluye la sangre 1:01 con PBS antes de la separación. </li><li> Prepare una doble capa de Ficoll para la separación de PBMC y neutrófilos en 50 ml tubos de centrífuga. Primero se debe agregar 15 ml de Ficoll pesada (véase la lista de materiales, ρ = 1,118 a 1,120), y luego Capa cuidadosamente 10 ml de Ficoll luz (véase la lista de materiales, ρ = 1,077 a 1,080) en la parte superior de la pesada Ficoll. Debe haber un fuerte fronterizo entre el Ficoll luz y capas de Ficoll pesados. Por último, la capa con cuidado 25 ml de la muestra de sangre diluida en la parte superior de la Ficoll luz sin alterar la capa de Ficoll. </li><li> Centrifugar el tubo a 250 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Nota: El freno de rotor de la centrifugadora debe estar apagado para estos giros para reducir al mínimo la interrupción potencial de la separación de células durante la desaceleración del rotor al final de la centrifugación. Después de la centrifugación, las siguientes capas (de arriba a abajo) están presentes: la capa superior es la siguien plasmaconducido por la capa de PBMC en la parte superior de la capa de Ficoll luz, la capa de neutrófilos con pocos glóbulos rojos (RBC) se encuentra entre la luz y Ficoll pesado seguido por la capa de Ficoll pesado y glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. </li><li> Cosecha y transferir la capa de neutrófilos en un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta de transferencia, añadir PBS hasta un volumen final de 50 ml y centrifugar a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente. <ol><li> Después de la centrifugación, todavía puede haber glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspirar el sobrenadante hasta la marca de 10 ml. Resuspender el sedimento de neutrófilos-RBC mediante agitación suave del tubo (o un breve vórtex baja velocidad) y lavar de nuevo con 50 ml de PBS. </li></ol></li><li> Después del segundo lavado, aspirar el sobrenadante. Para eliminar los hematíes contaminantes, resuspender las células sedimentadas en el PBS residual mediante agitación (o corto agitación), añadir 25 ml de H2O y suavemente vortex durante 10 segundos para la lisis de los glóbulos rojos. <ol><li> Añadir 25 ml de 1,8% de NaCl y mezclar inmediatamentede centrifugación a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente. El RBC contaminar ahora debe ser lisadas dejando un sedimento de células de neutrófilos blanco. </li></ol></li><li> Se lava el sedimento de células de neutrófilos con PBS. </li><li> Resuspender los neutrófilos aislados en medio RPMI con FBS al 10% y determinar la concentración de células bajo microscopio de luz con un hemocitómetro. </li><li> Ajustar la densidad celular a 500.000 células / ml con RPMI completo-10% de medio FBS. </li></ol> 5. Flujo Cámara de ensayo de adhesión <ol><li> Montar la cámara de flujo. Coloque el plato de 35 mm que contiene las HUVEC confluentes o ligandos del receptor de adhesión purificadas en la tabla de microscopio. Conecte la cámara de flujo de placas paralelas con bomba de jeringa, sistema de vacío y dejar una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo en la parte superior de la placa y fije el conjunto de la cámara de flujo 13. (Ver Figura 1) </li><li> Inicie el programa de grabación de vídeo en el ordenador conectado to el microscopio. Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta el campo libre con células HUVEC están bien desarrollados o en un campo en la región de revestimiento ligando es visible. </li><li> Uso de la bomba de jeringa, enjuagar la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara o de la línea de entrada de neutrófilos. </li><li> Si se desea, los neutrófilos pueden ser preparadas con la dosis baja (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Esto permitirá una adaptación del nivel basal de activación de neutrófilos entre diferentes donantes 14. </li><li> Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas (una velocidad de 350 l / min, lo que es igual a una tensión de cizalla de 1,5 dinas / cm 2 se utiliza en este estudio). Grabe el video. Debido a la adhesión de neutrófilos puede ocurrir rápidamente, un video con una longitud de 4-5 minutos es generalmente suficiente para cuantificar eventos de adhesión para el análisis. </li><li> Una de células adherentes se define como una célula que se mueve menos de un diámetro de céluladentro de 5 segundos en la superficie de HUVEC o ligando recubierto 15,16. Cuente el número total de células adherentes en el campo presente en el video grabado con esta regla. Mediante el registro de videos de larga duración similares con neutrófilos diferentes donantes, se puede calcular el adherente células / min para comparar las propiedades de adhesión entre los diferentes donantes. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de guía a la separación y el aislamiento de los neutrófilos activados mínimamente para la cuantificación cuidadosa de la adhesión de neutrófilos bajo condiciones de estrés escarpados. La adhesión de neutrófilos es un proceso crítico en la inflamación. Debido a que las variantes genéticas en múltiples moléculas en este proceso se ha demostrado que predisponen al desarrollo de la enfermedad autoinmune 1,2, se requiere un sistema de ensayo capaz de evaluar cuantitativamente la adhesión firme de neutrófilos humanos. El método descrito en este protocolo permite la determinación cuantitativa de cuidado y el potencial adhesiva firme de los neutrófilos en un ambiente controlado in vitro bajo esfuerzo cortante. Así pues, este método permite la comparación directa de la adhesión de neutrófilos cuantitativa entre individuos con genotipo para determinar la importancia de la variación genética en las moléculas de adhesión 14. Varios pasos de este método merecen una cuidadosa consideración a achievresultados e altamente cuantitativos y reproducibles. En la preparación de HUVEC, que es crítica para alcanzar 100% de confluencia celular antes de usarlos en la cámara de flujo. Para el uso de superficies recubiertas con ligando purificado, el área de recubrimiento sustrato no se debe permitir que se seque para evitar la desnaturalización de la ligando. Además, la preparación de los neutrófilos humanos es crítico para el éxito del experimento. Aspectos críticos de aislamiento de neutrófilos de la sangre incluyen el manejo con cuidado al minimizar vórtex para evitar la activación, manteniendo las células a temperatura ambiente (es decir, la sangre no se debe almacenar en los escalones de hielo y centrifugación se debe realizar a temperatura ambiente) y completar el aislamiento y el experimento en la menor cantidad de tiempo posible. Hay métodos de aislamiento de neutrófilos adicionales que también pueden ser utilizados para preparar las células para estos ensayos 17,18. Desde un punto de vista prácticos ensayos, de adhesión utilizando neutrófilos humanos recién aislados<html> debe iniciarse dentro de 3-6 horas después de la flebotomía participante. Como los neutrófilos son extremadamente sensibles a la manipulación, tiempos prolongados entre la extracción de sangre y el uso podrían afectar los resultados de ensayo. Cuidadosa determinación de la concentración celular de neutrófilos antes de la cámara de ensayo de flujo también es necesario para alcanzar resultados exactos y reproducibles. Durante el ensayo de cámara de flujo, es importante para controlar la grabación de vídeo cuidadosamente para asegurar que la velocidad de flujo es constante y no hay ninguna turbulencia en toda la duración del experimento. Los cambios en las velocidades de flujo o la presencia de la turbulencia que precisen que se repitió el experimento. Después del experimento, también es importante para evaluar los neutrófilos restantes al microscopio para asegurarse de que los neutrófilos no se aglutinación. La formación de grumos en este punto indicaría que los neutrófilos se han convertido activado que podría alterar significativamente la densidad de neutrófilos durante el experimento. contenido &quot;&gt; La cámara de flujo crea una tensión homogénea cerca pura dentro de la cámara (τ = 6Qμ / (wh 2), donde Q = caudal, μ = viscosidad dinámica, y w = ancho de la cámara de flujo, h = altura de la 15 cámara de flujo). En nuestros estudios, hemos utilizado una velocidad de flujo de 350 l / min para la adhesión de neutrófilos, lo que crea una gran tensión de 1,5 dinas / cm 2 (W = 0,25 cm, h = 0,01 cm, la viscosidad del agua a 37 ° C (0.007 poises) se utilizó como una aproximación de la viscosidad de los medios de comunicación RPMI). Para una cámara de flujo específica, se puede cambiar la velocidad de flujo para conseguir diferentes niveles de esfuerzo cortante para imitar diferentes condiciones fisiológicas. tensión de cizallamiento fisiológica Típica en los vasos sanguíneos humanos pueden oscila entre 0,5 a 5,0 dinas / cm 13,16. Shear stress en otros vasos sanguíneos y otros animales fueron listados en la Tabla 1 113,16,19 20. Mientras que nuestro método se ha centrado en el estudio de la adhesión de neutrophi humanaLS, este método no se limita a los neutrófilos y se puede aplicar fácilmente a la adhesión o estudios de rodadura de demás tipos de células con modificaciones sencillas. Además, los sustratos en este método se pueden cambiar para diferentes propósitos. Aunque este protocolo es fácilmente adaptable a diferentes estudios, hay algunas limitaciones. El protocolo tal como se aplica aquí requiere gran número de células primarias para el análisis. Esto puede impedir el análisis de las células primarias de animales pequeños. Además, la necesidad de inmovilizar ligandos de adhesión purificadas en una conformación activa / disponible puede limitar la gama de ligandos. El uso de proteínas de fusión Fc aumenta enormemente las posibilidades de lograr la conformación ligando adecuado en la superficie de la placa. Sin embargo, nuestro método tiene una flexibilidad significativa para permitir el análisis cuantitativo de eventos de adhesión. Estos estudios mejorará en gran medida nuestra comprensión de pares de receptor-ligando de adhesión, y de la importancia potencial en función de las variantes genéticasen estas proteínas, en la patogénesis de las enfermedades humanas.

Las variantes genéticas en ambos β integrinas y 2 en ligandos ICAM son ahora reconocidos para ser asociado con el desarrollo de enfermedad autoinmune 1,2. La determinación de las consecuencias funcionales de estas variantes en células derivadas de los individuos con estas variantes es necesario para nuestra comprensión de cómo estas variantes contribuyen a la patogénesis de la enfermedad autoinmune. Tales estudios funcionales permiten para la determinación de los mecanismos por los que ocurren naturalmente variantes genéticas dan forma a la respuesta inmune tanto en la salud y la enfermedad. En el ejemplo específico de LES, ahora sabemos que las variantes en ITGAM (CD11b) y su ligando, ICAM-1, se asocian fuertemente con el desarrollo de la enfermedad 1,2. Debido a que los neutrófilos son críticos en la respuesta inflamatoria, el estudio cuantitativo de la adhesión de neutrófilos puede proporcionar ideas mecanicistas sobre cómo las variantes genéticas en ITGAM / ICAM alteran la inflamación. NeutrophIL adhesión firme a las células endoteliales (CE) es un proceso altamente regulado y juega un papel esencial en las respuestas inflamatorias 3,4. La firma de adhesión de neutrófilos sigue rodadura de neutrófilos inicial y captura en la CE y en última instancia, puede dar lugar a la transmigración in vivo. Estos procesos implican muchos tipos diferentes de moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina en las células endoteliales y β 2 las integrinas en el neutrófilo 5-9. Por lo tanto, con cuidado de la cuantificación de la adhesión de neutrófilos a partir de donantes con diferentes variantes alélicas de las moléculas de adhesión será importante para entender las consecuencias funcionales y patológicas de estas variantes genéticas. El uso experimental de una cámara de flujo puede crear un entorno in vitro con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo 10-12. De hecho, un ensayo de cámara de flujo acoplado con umbili humanaCal de células endoteliales de la vena (HUVEC) puede imitar el ambiente in vivo de un vaso sanguíneo. Usando este método, se puede estudiar las propiedades adhesivas celulares general hacia las células endoteliales. Además, el medio ambiente altamente controlado de la cámara de flujo también permite la evaluación de células de unión a ligandos de adhesión purificadas tales como ICAM-1 para facilitar el estudio de las interacciones receptor-ligando específicos. Se presenta aquí un método que utiliza un sistema de ensayo de adhesión cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas de los neutrófilos de sangre periférica humanos a HUVEC y a sustratos ligando purificado. El uso de este método con células de donantes que expresan diferentes variantes alélicas molécula de adhesión nos permite evaluar cómo estas variantes genéticas pueden alterar la adhesión firme de los neutrófilos humanos.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td>con rojo de fenol</td></tr><tr><td>2x Inhibidor de tripsina</td><td>Life technologies</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 35 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>Superficie tratada con cultivo de tejidos estándar</td></tr><tr><td>75 cm2 matraz</td><td>de cultivo de tejidos Corning Inc.</td><td>430641</td> Cámara CCD <td>de superficie tratada para cultivo de tejidos estándar</td></tr><tr><td></td><td>Dage-MTI</td><td>Modelo 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación celular&nbsp;</td><td>Biocisión</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC medio basal de crecimiento</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>HUVEC factores de crecimiento para medio basal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10082-147</td><td>Certificado, Gelatina</td></tr><tr><td>Inactivada por Calor Sigma</td><td></td><td>G9391</td><td>de piel bovina</td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>de plasma humano</td></tr><tr><td>Cámara de flujo</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>Cámara de flujo circular para platos de 35 mm</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Heavy Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc quimera</td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> Ficoll Ligero <td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Life technologies</td><td>11875</td><td>con L-glutamina y</td></tr><tr><td>Fenol Rojo Proteína A</td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>resuspender en PBS</td></tr><tr><td>P-Selectin</td><td>R& D Systems</td><td>137-PS</td><td>Fc quimera</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>Life technologies</td><td>PHC3015</td> Solución <td>recombinante de azul</td></tr><tr>de<td>tripano de proteína humana, 0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de adhesión de neutrófilos cámara de flujo humano

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Firme adhesión de neutrófilos a las células endoteliales desempeña un papel crítico en la inflamación, tanto en la salud y la enfermedad. El proceso de adhesión de neutrófilos firma implica muchas diferentes moléculas de adhesión, incluyendo miembros de la familia de las integrinas β 2 y sus contra-receptores de la familia ICAM. Recientemente, variantes genéticas de origen natural en tanto β 2 integrinas y ICAM se informa, se asocia con la enfermedad autoinmune. Por lo tanto, la capacidad adhesiva cuantitativa de neutrófilos de los individuos con diferentes formas alélicas de estas moléculas de adhesión es importante para estudiar en relación con los mecanismos subyacentes desarrollo de autoinmunidad. Estudios de adhesión en los sistemas de cámara de flujo pueden crear un entorno con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo. A continuación, presentamos un método que utiliza un sistema de ensayo cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas cuantitativos de neutrófilos en la sangre periférica humanas a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y a sustratos ligando purificado. Con este método, las capacidades adhesivas de neutrófilos procedentes de donantes con diferentes variantes alélicas en los receptores de adhesión pueden ser evaluados y comparados. Este método también puede ser modificado para evaluar la adhesión de otros tipos de células primarias o líneas celulares.

Ejemplos de la unión de neutrófilos a un ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) cámara de flujo recubierto (Figura 2) o de la unión a un ensayo de cámara de flujo recubierto de HUVEC (Figura 3) de neutrófilos se muestran. Como se muestra en las figuras, los neutrófilos continúan acumulándose / adherirse a la superficie recubierta o HUVEC en condiciones de flujo continuo. Bajo nuestras condiciones experimentales típicas, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente adheridas a la superficie recubierta o HUVEC durante un período de registro de cuatro minutos. Sin embargo, las variantes alélicas de las moléculas de adhesión de neutrófilos, o variantes alélicas en el sustrato (ligando purificado o HUVEC), podrían alterar sustancialmente la adhesión de neutrófilos cuantitativa 14. También hemos evaluado la dependencia temporal de los eventos de adhesión de neutrófilos observados en nuestros estudios. Mientras que estamos manteniendo constantes las condiciones de flujo, es posible que las propiedades adhesivas de las células cambian con el tiempo. Hin embargo, en los cursos de tiempo relativamente cortos en nuestros estudios, no observamos ninguna diferencia consistente en la tasa de adherencia con el tiempo. Por ejemplo, la evaluación de la adherencia a los 1-2 puntos temporales minutos en comparación con la adhesión observada entre los 3-4 puntos temporales min no son consistentemente diferentes. Por supuesto, si las células están siendo estimulados durante el experimento de adhesión, entonces los cambios en las propiedades adhesivas con el tiempo se podía esperar. En nuestros estudios, hemos controlado para la activación de neutrófilos inducida por aislamiento de cebado intencionalmente las células con dosis bajas de fMLP (10 -8 M) durante 10 min antes del estudio. Las células endoteliales (HUVEC en nuestros estudios) también requieren activación antes de regular positivamente la expresión de la molécula de adhesión para una óptima adhesión firme de leucocitos. En ausencia de pre-tratamiento, las células endoteliales (HUVEC) apoyarán muy poco la adhesión de neutrófilos. En nuestros estudios, hemos utilizado 10 ng / ml de TNF para el tratamiento 4-6 horas antes de su uso. IL-1β (10 ng / ml) y se<html> LPS (0,5-1 g / ml) también se pueden utilizar para pre-activar las células endoteliales. Es importante destacar que, HUVEC no tratadas puede ser utilizado como control negativo para asegurar que la adhesión celular es causada por la específica de neutrófilos interacciones de células endoteliales (mediada por los receptores). Alternativamente, los anticuerpos anti-receptor se pueden utilizar para bloquear los receptores específicos para evaluar la especificidad de la adhesión. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración de la cámara de flujo en la platina del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Disparos Figura 2 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a ICAM-1/P-Selectin superficie recubierta en diferentes puntos de tiempo (A:. 0 punto temporal, B: 1 punto temporal min, c: 2 min punto de tiempo, y D: punto de tiempo de 4 min.) La concentración de ICAM-1 es 25 g / ml y P-Selectina es 0,5 g / ml. Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / min con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Disparos Figura 3 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a la superficie de HUVEC revestido en diferentes puntos de tiempo (A: 0 punto del tiempo, B: 1 min punto de tiempo, C: 2 min punto de tiempo, y D: el punto de tiempo de 4 min)..Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / ml con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Especies </td><td > Ubicación </td><td > Esfuerzo cortante (dinas / cm 2) </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria branquial </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> La arteria femoral común </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta suprarrenal </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supracelíaco </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Arteria fermoral Superficial </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Vénulas </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primera arteriolas </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo arteriolas retinianas </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primera vénulas </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo vénulas retinianas </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Perro </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Conejo </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Rata </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Ratón </td><td> Arteria caroid Común </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Perro </td><td> La arteria femoral común </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Conejo </td><td> La arteria femoral común </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Rata </td><td> La arteria femoral común </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tensión de cizallamiento de la muestra en diferentes órganos y diferentes especies. * Resumen de las referencias 13, 16, 19, y 20.

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la adhesión firme de neutrófilos mediante un ensayo con cámara de flujo que permite la adhesión de neutrófilos humanos en presencia de estrés de corte. Esto se logra primero preparando un sustrato de moléculas de adhesión purificadas o una superficie celular endotelial, como células endoteliales de vena umbilical humana o ve. El segundo paso consiste en separar neutrófilos de sangre periférica humana utilizando un método de centrifugación en dos capas con PHI.A continuación, se ensambla la cámara de flujo para permitir la inyección de neutrófilos humanos aislados bajo estrés de cizalladura sobre un sustrato de adhesión, ligandos o ve. El último paso consiste en registrar los eventos de adhesión de neutrófilos en la cámara de flujo, seguido de una cuantificación cuidadosa de la adhesión firme. En última instancia, el ensayo en cámara de flujo se utiliza para demostrar la adhesión firme de neutrófilos hacia moléculas de adhesión purificadas y una superficie HX.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como la importancia funcional de las variaciones genéticas en moléculas tisulares que se sabe están asociadas con el desarrollo de la autoinmunidad. Estudios genéticos en pacientes con lupus eritematoso sistémico han demostrado una fuerte asociación con variantes en la integrina Abeta dos, una proteína implicada en la adhesión firme de neutrófilos. Desarrollamos este sistema de ensayo para evaluar las consecuencias funcionales de la variación genética en esta endocrina beta dos llamada Mac uno sobre la adhesión firme. Para preparar las placas de cultivo para su uso en la cámara de flujo.Añada un mililitro de una solución de fibrina y gelatina a cada placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros y pipetee varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa esté recubierta. Retire el exceso de solución de fibronectina y gelatina y seque las placas al aire durante al menos 30 minutos. Para optimizar la formación de la matriz proteica, recolecte células endoteliales de vena umbilical humana o qve que se hayan cultivado hasta un 80 a 90 % de confluencia utilizando tripsina-EDTA y siembre 500 000 células en cada placa de cultivo recubierta.Añada dos mililitros de medio de crecimiento a cada placa e incube a 37 grados Celsius. Las células con 5%CO2 deben inspeccionarse visualmente diariamente, con cambios de medio cada dos días. Permita que las células crezcan hasta alcanzar una confluencia del 80 al 90 %.Para comenzar este procedimiento, utilice un marcador o bolígrafo para dibujar un círculo de 0,5 centímetros de diámetro en el centro de una placa de cultivo celular de 35 milímetros. Añada 20 microlitros de una solución de proteína A a 20 microgramos por mililitro en el área marcada. Use la punta de pipeta para extender la solución de proteína A, cubriendo toda el área dentro del círculo de 0,5 centímetros de diámetro.Es importante no tocar ni rayar la superficie del recipiente. Incubar las placas de cultivo celular a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, lavar cada placa recubierta con la proteína a tres veces con un mililitro de PBS.Después de eliminar el PBS de la tercera placa de lavado, añada 50 microlitros de BSA al 1 % en el área marcada para bloquear la unión no específica en la placa. Incube a cuatro grados Celsius durante dos horas. Después de dos horas.Lave la placa bloqueada tres veces con un mililitro de PBS. Prepare las soluciones de proteína quimérica del ligando del receptor de adhesión FC para el recubrimiento y este experimento, y se utilizará ICAM-1 FC Quimera a 25 microgramos por mililitro y P-selectina FC Quimera a 0,5 microgramos por mililitro. Recubra el área marcada con 50 microlitros del sustrato e incube las placas de cultivo celular durante la noche a cuatro grados Celsius.Los pocillos deben usarse dentro de los dos días, y no debe permitirse que el área recubierta se seque. Si es necesario, agregue PBS para mantener los 50 microlitros de solución en la placa.Los neutrófilos para este estudio se aíslan de la sangre de participantes que han dado su consentimiento informado por escrito. Después de extraer la sangre mediante flebotomía en un tubo de recogida con anticoagulante o vacutainer, diluya la sangre al 1:1 con PBS y realice todos los pasos de este procedimiento. A temperatura ambiente, prepare una columna de dos capas de Ficoll para separar las células mononucleares de la sangre periférica o PBMCs y los neutrófilos en tubos de centrífuga de 50 mililitros.Primero, agregue 15 mililitros de solución densa de PHI y luego, con cuidado, superponga 10 mililitros de solución liviana de fi sobre la solución densa de fi. Debe haber una frontera nítida entre las capas de solución liviana y densa de fi. Finalmente, coloque cuidadosamente 25 mililitros de la muestra de sangre diluida sobre la solución liviana de fi sin perturbar el PHI.Llame a la capa de centrifugado los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente después de la centrifugación; deben estar presentes múltiples capas. La capa de neutrófilos con pocas células rojas se encuentra entre el medio ligero y el medio pesado de phi. Utilice una pipeta de transferencia para cosechar y transferir la capa de neutrófilos a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue PBS hasta un volumen final de 50 mililitros.Centrifugar a 225 ×g durante 10 minutos. A temperatura ambiente después de la centrifugación, aún podrían quedar glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspirar el sobrenadante hasta dejar 10 mililitros.Marque Resus. Suspenda el sedimento de neutrófilos y glóbulos rojos mediante vortexado breve a baja velocidad y luego lave nuevamente con 50 mililitros de PBS. Aspire el sobrenadante para eliminar los glóbulos rojos contaminantes. Resuspenda las células sedimentadas en el PBS residual mediante vortexado breve a baja velocidad.Añada 25 mililitros de agua y mezcle suavemente mediante vortex durante 10 segundos. A los piojos. A los glóbulos rojos añada 25 mililitros de cloruro de sodio al 1,8 % y mezcle inmediatamente mediante centrifugación a 225 ×g durante 10 minutos.Las células sanguíneas rojas contaminantes ahora deben estar lisadas, dejando un sedimento celular blanco de neutrófilos. Lave el sedimento celular de neutrófilos con PBS, deseche el sobrenadante y resuspenda los neutrófilos aislados en medio RPMI con 10 % FBS. Tras determinar la concentración celular bajo un microscopio óptico con un hemocitómetro, ajuste la densidad celular a 500.000 células por mililitro con medio RPMI completo con 10 % FBS.Antes de comenzar el ensayo de adhesión en cámara de flujo, estimule el VE con 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa humano durante cuatro a seis horas para aumentar y estimular la expresión de moléculas de adhesión. Cuando el VE esté listo, arme la cámara de flujo. Coloque el platillo de 35 milímetros que contiene el VE confluyente sobre la mesa del microscopio.Para los fines de este video, solo se examinará la adhesión de neutrófilos a VE, pero el mismo procedimiento se aplica al estudio de la adhesión de neutrófilos a moléculas de adhesión purificadas; conecte la cámara de flujo de placas paralelas con la bomba de jeringa y el sistema de vacío, dejando una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo encima de la placa y asegure el ensamblaje de la cámara de flujo. Inicie el programa de grabación de video en la computadora conectada al microscopio.Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta que sea visible un campo claro con VE completamente desarrollado. Utilizando la bomba de jeringa, enjuague la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara ni en la línea de entrada de neutrófilos.Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas. Grabe el video porque la adhesión de neutrófilos puede ocurrir rápidamente; generalmente, un video de cuatro a cinco minutos es suficiente para cuantificar los eventos de adhesión para su análisis. Este clip muestra un ejemplo de neutrófilos que se unen a una cámara de flujo recubierta con HU E.Una célula adherente se define como una célula que se mueve menos de un diámetro celular dentro de cinco segundos. En la superficie recubierta con HU e. Aquí se muestran capturas de pantalla en diferentes momentos a partir de videos de muestra de neutrófilos que se adhieren a una superficie recubierta con ICAM uno P selectina, o a una superficie recubierta con uve.En ambos experimentos, la velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 microlitros por minuto con una densidad de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. En condiciones típicas, se observó que entre 50 y 70 neutrófilos humanos se adhirieron firmemente a la superficie recubierta con ligando o VE durante un período de grabación de cuatro minutos. Sin embargo, variantes alélicas de las moléculas de adhesión de neutrófilos o variantes alélicas en el sustrato podrían alterar sustancialmente la adhesión cuantitativa de neutrófilos al grabar videos de duración similar con diferentes donantes.Los neutrófilos, el número de células adheridas por minuto puede calcularse para comparar las propiedades de adhesión entre diferentes donantes. Al realizar este procedimiento, es importante recordar verificar visualmente los neutrófilos en busca de agregación celular causada por la activación inducida durante el aislamiento. Además, se puede realizar una evaluación paralela mediante citometría de flujo para asegurar que el estado de activación de las células sea comparable entre donantes y entre experimentos.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran la adhesión celular en células humanas primarias procedentes de donantes de genotipos con diferentes alelos en la región codificante de la cadena CD11B del integrina beta dos, MAC-1. Estos estudios han permitido una evaluación cuidadosa y cuantitativa del impacto funcional de estas variantes alélicas en el sistema humano.

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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