Name: Las respuestas de la Vejiga Urinaria Distensión Evocados visceromotor como modelo para la vejiga Dolor en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende a establecer un modelo fisiológico de dolor vesical nocivo en ratones mediante distensión urinaria y registro de respuestas viscero-motoras. Este método permite investigar los mecanismos nerviosos de la cistitis intersticial.

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Nos gustaría agradecer a los Dres. Robert Gereau, Henry Lai, y Lara Crock por su valiosa asistencia en la creación de este sistema. También nos gustaría agradecer a las fuentes de financiamiento para este trabajo (BJK - Asociación Internacional para el Estudio del Dolor Early Career Beca de Investigación por el Scan | Fundación de Diseño de Inger &amp; Jens BRUUN y la Hunkele Fondo terrible enfermedad Duquesne University).

El siguiente protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso en la Universidad de Duquesne y está en consonancia con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. 1. Implante quirúrgico de alambre Electrodos y vejiga urinaria Catéter utilizando técnicas estériles (tiempo total de 5 a 10 min) <ol><li> Los siguientes artículos deben estar preparados antes de la cirugía de partida: <ol><li> Activamente controlar y ajustar la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C usando el sistema de monitorización de la temperatura con una almohadilla eléctrica a pilas y de los animales de la sonda de la temperatura corporal (Lista de Materiales) Conecte el sistema automático para una lámpara de calor de baja potencia para el control adicional de la temperatura corporal. </li><li> Equipo necesario para la anestesia isoflurano incluye aire comprimido (por ejemplo, 100% O 2), vaporizador de isoflurano, isoflurano, cámara de inducción con isoflurano (por caída inicial), cono de la nariz, y el sistema de escape. </li><li> Ensamble ªe instrumentos adecuados quirúrgicos, catéter intravenoso, y electrodos (Lista de Materiales) </li></ol></li><li> Inducir el estado anestésico en la cámara de inducción a un 2-3% isoflurano. Retire del ratón de la cámara cuando reflejo de enderezamiento se pierde (0-1 min). </li><li> Coloque el ratón en el cono de la nariz con el 2-2,5% de isoflurano. Apriete los dedos para comprobar si la anestesia completa. No debería haber ninguna respuesta por parte del animal. Inicie el temporizador. </li><li> Coloque 1 gota de pomada oftálmica en cada ojo de ratón. </li><li> Gire ratón sobre tan cara dorsal quede hacia abajo. </li><li> Inserte catéter a través de la uretra y en la vejiga. </li><li> Sumergir catéter en lubricante quirúrgico para lubricar catéter. <ol><li> Aplique suavemente la abertura uretral con unas pinzas puntiagudas perpendiculares al cuerpo del animal. Sosteniendo el catéter con el conjunto 2 º de pinzas, inserte con cuidado extremo de catéter en la uretra en un ángulo perpendicular al cuerpo del animal. </li><li> Cuando el catéter ha entrado en la uretra ~ 1-2 mm, ajuste suavemente catéter de modo que ahora está paralela al cuerpoapuntando hacia la cabeza. Este movimiento es necesario para evitar el hueso púbico. </li><li> Empuje suavemente el catéter hacia el cuerpo del ratón. El catéter debe deslizarse en la cavidad corporal sin problemas y sin resistencia. No fuerce el catéter. Si el catéter no entra sin problemas, vuelva a la posición del catéter perpendicular y empezar de nuevo. </li><li> Con el catéter completamente insertado en la vejiga, empuje suavemente hacia abajo en el abdomen del ratón para expulsar el contenido de la vejiga. Quite toda la orina de catéter empujando un pequeño pedazo de toalla de papel en la abertura del catéter. Cuando toalla de papel está empapado de orina, reemplazar. Retire la orina continuamente durante todo el protocolo que queda incluida en los experimentos distensión vesical (véase el Protocolo 3 a continuación.) </li></ol></li><li> Inserte dos alambres de plata en los músculos abdominales a la izquierda y un alambre de plata en el pecho (como un suelo.) <ol><li> Use alcohol o yodo para desinfectar el área lateral a la derecha del catéter (lado izquierdo del cuerpo de los animales.) </li><li> La exposicion músculo abdominal izquierda. <ol><li> Mantenga la piel cerca del músculo abdominal izquierda con fórceps. Haga una pequeña incisión de 1-2 cm con tijeras quirúrgicas medianas. </li><li> Inserte la punta de la tijera en la incisión y expandir suavemente la incisión hasta 2 cm. </li><li> El uso de fórceps para mover fascia suprayacente para exponer el músculo abdominal oblicuo superior. Tenga cuidado de no cortar / copiar cualquiera de los principales vasos sanguíneos que se encuentran en esta región. </li></ol></li><li> Doblar tres alambres de plata en medio. Utilice afilada aguja 21 G para tomar un pequeño bocado del músculo. A continuación, empuje la aguja a través del músculo. Cuando se inserta en el músculo tenga cuidado de no perforar ningún órgano interno o inducir daño innecesario al músculo. </li><li> Pegue un extremo libre de un alambre de plata en la abertura de la aguja de calibre 21. Tire suavemente la aguja hacia atrás a través del músculo para dibujar el alambre de plata a través de la picadura del músculo. Cuando la aguja está libre de músculo, tire suavemente de alambre de plata a través del músculo hasta que el bucle en el cable esté alineado con lamordedura muscular. </li><li> Repita los pasos 1.7.3-1.7.4 para alambre segundo muscular. Este cable debe ser colocado ~ 0,5 cm de la primera cable muscular. Es importante que los dos cables no se toquen después de la inserción. </li><li> Inserte la tercera alambre de plata (suelo) en el pecho inferior a la del corazón. <ol><li> Utilice afilada aguja 21 G para tomar un pequeño bocado de la piel (no es necesario hacer una incisión o afeitar la piel) y empujar la aguja a través de la piel. </li><li> Inserte el alambre de plata como se describió anteriormente y pasar a través de la piel. </li></ol></li></ol></li><li> Coloque una pequeña cantidad de 37.5 ° C el aceite mineral estéril sobre los músculos expuestos para mantenerlos húmedos y tire de la piel sobre el músculo tanto expuestos como sea posible. </li><li> Inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea para ayudar a mantener los niveles de líquido en los pasos siguientes. </li><li> Rodar suavemente sobre el lado de los animales de manera que la temperatura del cuerpo se puede mantener fácilmente. </li></ol> 2. Procedimiento Step-down anestesia parcial (total Tiempo de ~ 75 min) El siguiente protocolo de anestesia ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso en la Universidad de Duquesne y está en consonancia con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. <ol><li> Inmediatamente después de la Sección I (arriba) es completa, isoflurano inferior a 1,5%. Se mantiene a este nivel durante 15 min. </li><li> Baja isoflurano tal que el animal se anestesia parcialmente. <ol><li> Bajo isoflurano por 0,125% cada 15 minutos hasta exhibiciones de animales de una respuesta a la flexión pizca dedo del pie pero no vocalizar o mover de otra manera. </li><li> Típicamente, un nivel de 0,8-1,0% de isoflurano es óptimo, sin embargo los niveles pueden variar debido a las diferencias en las configuraciones de la anestesia. La vocalización y / o la deambulación son eventos extremadamente raros en que la anestesia está en el nivel adecuado. </li></ol></li></ol> . 3 electromiografía (EMG) de grabación Durante la vejiga Distensión con presiones Graded (15-75 mmHg) (tiempo total - variable según el experimento) <ol&gt; <li> Configurar los siguientes elementos para la grabación de EMG y distensión de la vejiga: <ol><li> Configuración de un amplificador, un digitalizador, y el software de grabación. En esta configuración, el digitalizador tiene una entrada para el amplificador y dos entradas para el regulador de presión (presión y entradas de marcador de estímulo, véase la sección 3.1.2). Configuración del hardware y el software de Exact es personalizable (ver Lista de materiales para obtener instrucciones específicas). </li><li> Configurar un sistema para entregar ráfagas específicas de presión de aire al animal. Este sistema se conoce como el &quot;regulador de presión temporizada&quot; en el siguiente protocolo. Permite el suministro de presión automatizado incluyendo digitalización de presión de aire, el control de la duración del ensayo, la automatización intervalo entre ensayos, el control del número de prueba, y el estímulo de la señal digital de inicio (ver Anderson et al. 14 para esquemática de un regulador de presión temporizada). </li></ol></li><li> Conecte todos los cables de conexión de ratón (2 cables abdominales + 1 cable de tierra) para el amplificador y eldigitalizador y empezar a grabar la señal de EMG en software digitalizador. Nota lo que &quot;Write&quot; tiempo seleccionado en el software digitalizador. </li><li> Retire la toalla de papel de la sonda vesical. Conecte el catéter al tubo de aire (del regulador de presión programado.) </li><li> Entregar un ensayo de 20 segundos a 60 mmHg de presión de distensión. <ol><li> Ajuste el regulador de flujo a 60 mmHg (presión cheque utilizando un esfigmomanómetro analógica.) </li><li> Ajuste el regulador de presión temporizada para suministrar un intervalo de presión previa 20 seg (esta será la señal de estímulo 2V grabada en software digitalizador) seguido por un pulso de presión de distensión 20 seg. </li><li> Inicie el ensayo (intervalo de presión previa + juicio distensión de presión). Cuando comience el juicio presión real, vuelva a comprobar la presión con los 3 esfigmomanómetros conectados al sistema. </li><li> Durante el juicio, la distensión de presión, una fuerte señal de EMG (&gt; 0,5 V) se debe observar durante y posiblemente después de la distensión seg 20. El animal puede mostrar abdomimovimiento nal pero el animal no deben vocalizar o moverse de otro modo. Aunque es raro, si se observan movimientos anormales o vocalizaciones, aumentar el nivel de isoflurano. </li></ol></li><li> Si la distensión mmHg 1 º 60 produce una señal de EMG apropiado, repita el paso 3.4 dos veces más con un intervalo entre ensayos de 1-2 min. </li><li> Sobre la recepción de señales fuertes de los tres 60 mmHg ensayos, realice distensiones experimentales. <ol><li> Muchos estudios utilizan distensiones graduadas comenzando a baja presión (10-15 mmHg) y trabajar hasta presiones nocivas (75-80 mmHg) en incrementos de 10 a 15 mmHg. Ver resultados representativos se muestran a continuación por ejemplo rastros a diferentes presiones. </li><li> Ensayos típicos incluyen un intervalo de 20 segundos de presión previa, una prueba de presión de distensión 20 seg, y un intervalo entre 1-2 min. </li><li> Haz tres distensiones en cada presión y que la media en los tres ensayos (para obtener una sola respuesta para cada visceromotor presión). En un método alternativo, perform cinco distensiones en cada presión, descartar los ensayos de alta y baja, y luego un promedio de las tres respuestas restantes. </li></ol></li><li> Una vez distensiones experimentales son completos, detener la grabación, guarde el archivo experimento, y el sacrificio de los animales utilizando métodos aprobados. </li></ol> 4. Análisis de Raw EMG Traces <ol><li> Análisis de las respuestas visceromotor (es decir, registros de EMG) se realiza fácilmente utilizando el software digitalizador de a bordo oa través de un programa de terceros (Lista de Materiales) Las siguientes instrucciones son instrucciones generales que podrían ser utilizados para analizar estos datos mediante múltiples programas o utilizando el análisis manual . </li><li> Para exportar EMG, presión y datos de señal de estímulo de software digitalizador hacer lo siguiente: <ol><li> Abra el archivo experimental. </li><li> Haga clic en &quot;Archivo&quot; &quot;Exportar como&quot;. </li><li> Cambiar el tipo de archivo a &quot;texto de hoja de cálculo (. Txt),&quot; un nombre al archivo y haga clic en &quot;Guardar&quot;. </li><li> En la poventana de p-up, cambiar la frecuencia de muestreo de salida a &quot;1000&quot;, cambiar la hora de inicio de la recolección de datos se inició momento y cambiar la hora de finalización a &quot;MaxTime ()&quot;. Seleccione el cuadro de marcación &quot;de salida de cambio de hora por lo que la primera línea es un 0.0 seg &quot;, y haga clic en&quot; OK &quot;. </li><li> Los datos ahora pueden exportar como un archivo de texto que se puede abrir en una variedad de programas. El archivo debe contener cuatro columnas (Timer, VMR (EMG), de presión, de estímulo). </li></ol></li><li> Para cada animal experimental probado, realice las siguientes operaciones matemáticas. <ol><li> Rectificar señal EMG para el conjunto mediante el cálculo del valor absoluto de cada punto de tiempo completo de datos. </li><li> Determine el promedio de respuesta de EMG durante la sección de antecedentes del experimento. </li><li> Reste este fondo media EMG respuesta desde todos los puntos de datos rectificados en el experimento para obtener el fondo conjunto de datos corregida. </li><li> Determinar el área bajo la curva (AUC) para cada 20 seg de preintervalo de presión en el fondo conjunto de datos corregida. </li><li> Determinar las AUC para cada 20 seg juicio distensión de presión en el fondo conjunto de datos corregida. </li><li> Divide cada AUC juicio distensión de presión (que se obtiene en el paso 4.3.5) por el intervalo de presión previa más baja AUC de todo el experimento (obtenido en el paso 4.3.4.). Este es el AUC corregido normalizado y el fondo de cada ensayo completo distensión presión. </li></ol></li><li> Para cada animal experimental, múltiples ensayos normalizados promedio de una sola presión para obtener el VMR normalizada en voltios * seg (Vsec). </li><li> Realizar las estadísticas apropiadas sobre los datos dependiendo del diseño experimental. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los seres humanos, la cistitis / vejiga síndrome de dolor intersticial (IC / BPS) representa un problema clínico importante porque los pacientes han dolor que es a menudo no responde al tratamiento del dolor regular de 15 debilitante. Uno de los principales retos en la comprensión y tratamiento de última instancia, el dolor crónico de la vejiga es entender los procesos neuronales normales que están implicados en la respuesta a la distensión de la vejiga nocivo. Con el fin de superar este reto, un modelo an...

El dolor crónico se define oficialmente como el dolor que persiste durante aproximadamente tres meses, o por más tiempo que el tiempo normal de curación de los tejidos 1. Este tipo de dolor es una de las principales razones por las que las personas se ven obligadas a buscar atención médica de 2 y puede llegar a costar hasta $ 635 mil millones de dólares anuales 3. Las estrategias de afrontamiento del dolor crónico actual se consideran arcaica; después de décadas de avances médicos, los AINE (medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos) y los opiáceos siguen siendo los principales tratamientos prescritos por los médicos. Sin embargo, estos tratamientos se dirigen a todos los diferentes tipos de dolor de la misma manera, proporcionar efectos analgésicos en todo el cuerpo en lugar de centrado específicamente en la causa de ese incidente exacta dolor. Con el fin de ayudar mejor a las personas que sufren de dolor crónico, atención de la investigación debe ser desplazado hacia la etiología y los posibles tratamientos para el dolor específico asociado con las causas más comunes de dolor crónico. El objetivo de este manuscript es describir un modelo utilizado para comprender mejor una condición conocida como síndrome de la cistitis intersticial / dolorosa de la vejiga (IC / BPS). IC / BPS es una condición debilitante que afecta a millones de personas, principalmente mujeres mayores de 40 años 4. Las causas exactas de la IC / BPS no se conocen, sin embargo la prevalencia se ha relacionado con la genética 5, dietas específicas, y altos niveles de estrés 6 . Los síntomas de la IC / BPS incluyen pero no se limitan a: Aumento de la urgencia de orinar, aumento de la frecuencia de la micción, dolor, perforación, o ardor durante el llenado de la vejiga y la micción, nicturia y 7. Los pacientes que experimentan estas condiciones tienen mayores niveles de estrés y son más ansiosos 8. Esto aumentó el estrés resulta en un aumento del dolor, lo que aumenta los niveles de estrés originales. Los estudios han demostrado que los niveles de depresión y ansiedad disminuyen siguientes tratamientos que alivian el dolor urinaria, rompiendo así eficazmente este ciclo de retroalimentación positiva <sup&gt; 9. Uno de los retos en el descubrimiento de nuevos tratamientos para IC / BPS ha sido la escasez de una comprensión de la ciencia básica de dolor en la vejiga. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, se han desarrollado muchos modelos animales para imitar el dolor y los síntomas asociados con IC / BPS. Tradicionalmente, la cistitis se ha recreado en animales con la introducción de diversos productos químicos tales como aceite de mostaza, acetona, lipopolisacárido, ácido clorhídrico, y ciclofosfamida en la vejiga. Sin embargo no hay agentes extranjeros están presentes en la orina estéril de pacientes IC / BPS, cuestionando así la validez de estos modelos. Otro modelo murino de dolor urológico es la distensión de la vejiga urinaria (UBD) 10. En este modelo, el aire comprimido de una presión determinada se entrega a la vejiga de un animal despierto o ligeramente anestesiados durante un período determinado de tiempo. Durante todo el procedimiento, los alambres en el oblicuo músculos abdominales registro activ eléctrico superiordad del músculo (con un electromiograma (EMG)). Esta actividad se conoce como la respuesta visceromotor (VMR) y es fiable medida, reproducible de la nocicepción 10. Similar distensión órgano hueco (por ejemplo, la vejiga, el recto) en voluntarios humanos sanos produce sentimientos de malestar y aumentos significativos en el dolor reportado 11,12, rasgos que se utilizan a menudo para diagnosticar IC / BPS. Por lo tanto, en conjunción con métodos eléctricos, farmacológicos, y optogenetic de estimulación o inhibición, UBD es un modelo útil y válida para comprender tanto los componentes del sistema nervioso periférico y central de la nocicepción y el dolor de la vejiga. Aquí se describe el procedimiento para UBD que se utiliza actualmente en nuestro laboratorio dentro de los miembros femeninos de la cepa de ratón común, C57Bl/6J. Debido a las dificultades en el proceso de cateterismo de machos, este procedimiento se lleva a cabo principalmente en ratones hembra. Este protocolo ha sido adaptado de la desarrollada por Ness &lt;em&gt; et al 10. y publicado previamente en nuestro laboratorio 13. El siguiente protocolo describe cuatro componentes principales de este modelo en animales anestesiados: (1) del catéter de la vejiga y cirugía electrodo de registro (2) inducción de la anestesia parcial (3) distensión de la vejiga y de grabación VMR, y (4) de análisis de datos de huellas primas VMR / EMG . Las diferencias sutiles en el procedimiento UBD-VMR debido a la elección del organismo, la profundidad de la anestesia y la inducción, y la temperatura corporal se discuten a continuación.

<table><tbody><tr><td>Manta calefactora infrarroja y sistema de monitoreo</td><td>Kent</td><td>Scientific Right-Temp System&nbsp;</td><td>Este sistema está configurado para monitorear dos temperaturas separadas. Esto debe incluir al animal y la manta térmica. Además, el sistema puede ajustar automáticamente la temperatura para mantener una temperatura establecida. Sin embargo, esta función automática produce interferencias eléctricas durante el registro EMG y debe apagarse. Kent puede proporcionar un paquete de baterías para la almohadilla térmica para su uso durante la parte de grabación riEMG del experimento.</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Draeger</td><td>Vapor 19.1</td><td>Cualquier vaporizador de isoflurano funcionará, pero es útil tener uno que tenga múltiples muescas entre 0-2% de isoflurano.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>100% Tanque de aire de oxígeno</td><td>múltiples</td><td>fuentes n/a</td><td>Para la ventilación de animales Grado de</td></tr><tr><td>respiración</td><td>de aire múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td>Para la distensión de la vejiga</td></tr><tr><td>24 G 0.56 en catéter intravenoso</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>381411</td><td>Para el cateterismo vesical</td></tr><tr><td>Surgilube (estéril)</td><td>Savage Laboratories</td><td>0281-0205-02</td><td>Cualquier lubricante de grado quirúrgico funcionaría bien.</td></tr><tr><td>Aceite mineral (estéril)</td><td>múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina (estéril)</td><td>múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>AG8W Alambre de plata, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, Sin aislamiento&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1318 &nbsp;</td><td>Cualquier alambre de plata con estas especificaciones funcionará. El alambre no necesita ser "clorado".</td></tr> <tr><td>Pomada oftálmica</td><td>de múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas</td> múltiples <td>fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas afiladas</td><td>de múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aguja</td><td>de múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de césped P511 con cable de entrada de 3 conductores Instrumentos de</td><td>hierba</td><td>P511 ( F-P5IC3/REV1)</td><td>Este es el "amplificador" utilizado en el protocolo. Amplificador con los siguientes ajustes: Calibrador = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplificación = 20; Alta frecuencia = 10 kHz; Filtro de línea = pulg.</td></tr><tr><td>Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (o equivalente)</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>1401 Plus</td><td>Este es el "digitalizador" utilizado en el protocolo. Otros sistemas digitalizadores de WINDAQ u otras empresas funcionarían bien; Necesita entradas para la señal de presión, EMG y señal de estímulo.</td></tr><tr><td>Software CED Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike 2</td><td>Este es el "software digitalizador" utilizado en el protocolo. Debe ser del mismo fabricante que el digitalizador. El programa debe configurarse con 3 canales para la presión (escala de 0-100 mmHg), la señal EMG (generalmente rango de -5 a +5 V) y el rango del marcador de estímulo (0-2 V).</td></tr><tr><td>Diagrama de flujo desde el tanque de aire hasta el catéter vesical</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Secuencia de conexiones desde el tanque de aire presurizado hasta la vejiga del animal:&nbsp; Tanque de aire hasta tubería de 1/4 de pulgada hasta el caudalímetro Gilmont hasta el conector Y. Rama 1 del conector y al esfigmomanómetro. Ramal 2 a una sola entrada en la válvula de grupo de 4 vías a la válvula de 4 vías salida al regulador de presión temporizado a tubería de 3/32 desde el regulador de presión temporizado hasta el conector 2nd y (rama 1 a esfigmomanómetro) con rama 2 a tubería de 3/32&nbsp; a un conector 3º Y.&nbsp; La rama 1 del conector y a un 3er esfigmomanómetro y la rama 2 al catéter de vejiga de animal.</td></tr><tr><td>Caudalímetro Gilmont &nbsp;</td><td>Gilmont</td><td>GF8321-1401</td><td>Varias marcas de medidores de flujo funcionarán. Para el aire de distensión de la vejiga, el medidor de flujo debe ser capaz de manejar altas presiones (como este medidor Gilmont).&nbsp; Para respirar aire, el caudal debe ser ajustable hasta 100 ml/min (la tasa típica del ratón es de 500-1.000 ml/min).</td></tr><tr><td>Válvula de grupo de 4 vías</td><td>Elite</td><td></td><td>Este es un equipo específico. La válvula de banda Elite está diseñada para peceras a bajas presiones de aire. En la configuración de distensión de la vejiga, esta válvula actúa como válvula de seguridad en caso de que la presión aumente. Una presión demasiado alta durante el encendido inicial del tanque arruinará el transductor de presión en el regulador de presión temporizado y / o los esfignómetros. Además, al proporcionar una pequeña cantidad de fuga en el sistema, esta válvula facilita el ajuste de la presión entre 10 y 80 mmHg. &nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de 1/4</td> pulg. múltiples <td>fuentes</td><td>n/</td><td></td></tr><tr><td>a Tubo de 3/32 pulgadas</td> de múltiples <td>fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>, conectores "Y" (1/4 y 3/32 pulg.),</td> <td>múltiples fuentes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Esfigmomanómetro</td><td>CVS</td><td></td><td>Cualquier esfigmomanómetro analógico de una farmacia funcionará para esta aplicación. &nbsp;</td></tr><tr><td>Regulador de presión temporizado</td><td>personalizado</td><td></td><td>Esta es una máquina personalizada (Universidad de Washington en el taller de máquinas de St. Louis) que permite la entrega automatizada de presión, incluida la digitalización de la presión del aire, el control de la duración del ensayo, la automatización del intervalo entre ensayos, el control del número de prueba y la señal digital de inicio de estímulos. Sin embargo, los componentes básicos del sistema (encendido y apagado de presión durante un período de prueba determinado) podrían controlarse con un simple interruptor en línea de encendido/apagado. &nbsp; Este control análogo de un ensayo requeriría parámetros de análisis adicionales (véase el Protocolo 4).&nbsp; Además, habría que asignar manualmente la presión en función del esfigmomanómetro analógico durante el análisis de datos. &nbsp;</td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>n/a</td><td>Para el análisis de la señal EMG. Se pueden utilizar muchos tipos diferentes de software para el análisis de datos en estos experimentos.</td></tr></tbody></table>

las respuestas de la vejiga urinaria distensión evocados visceromotor como modelo para la vejiga dolor en ratones

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Aproximadamente 3-8 million de personas en Estados Unidos sufren de síndrome de cistitis dolor / vejiga intersticial (IC / BPS), una condición debilitante que se caracteriza por el aumento de la urgencia y la frecuencia de la micción, así como la nicturia y dolor pélvico general, especialmente en el llenado de la vejiga o micción. A pesar de años de investigación, la causa de la IC / BPS sigue siendo difícil de alcanzar y las estrategias de tratamiento no son capaces de proporcionar un alivio completo a los pacientes. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, se han desarrollado muchos modelos animales para imitar el dolor y los síntomas asociados con IC / BPS. Uno de estos modelos murinos es la distensión de la vejiga urinaria (UBD). En este modelo, el aire comprimido de una presión determinada se entrega a la vejiga de un animal ligeramente anestesiados durante un período determinado de tiempo. Durante todo el procedimiento, los cables de los músculos abdominales oblicuos superiores registran la actividad eléctrica del músculo. Esta actividad se conoce como la respuesta visceromotor (VMR) eisa medida fiable y reproducible de la nocicepción. A continuación, describimos los pasos necesarios para llevar a cabo esta técnica en ratones, incluyendo manipulaciones quirúrgicas, grabación fisiológica, y el análisis de datos. Con el uso de este modelo, la coordinación entre las neuronas sensoriales primarias, la médula espinal aferentes secundarias, y áreas del sistema nervioso central superior que participan en dolor de la vejiga puede ser descifrado. Este conocimiento básico de la ciencia puede entonces ser clínicamente traducido para el tratamiento de pacientes que padecen IC / BPS.

Un ejemplo de la configuración general UBD-VMR se puede ver en la Figura 1A. El aumento de las medidas de presión inducen un aumento en la VMR en bruto (es decir, EMG) (Figura 1B). La VMR prima, la presión, y la señal de marcador de estímulo que debe ser observado durante la grabación usando el software digitalizador se puede ver en la Figura 2. El canal superior visto en La figura 2 es la huella EMG (en V). La señal de fondo de la traza EMG de...

Aproximadamente 3-8 million de personas en Estados Unidos sufren de síndrome de dolor cistitis intersticial / vejiga (IC / BPS), una condición debilitante que se caracteriza en parte por el dolor pélvico. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, un modelo fisiológico de dolor en la vejiga urinaria se utiliza en ratones y ratas.

Las respuestas de la Vejiga Urinaria Distensión Evocados visceromotor como modelo para la vejiga Dolor en ratones

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo fisiológico de dolor nocivo en la vejiga y en ratones durante todo el procedimiento. La temperatura corporal se mantiene mediante una almohadilla calefactora y un calentador radiante superior. El primer paso en la cirugía consiste en insertar un catéter en la uretra del ratón anestesiado.El segundo paso consiste en realizar una incisión para exponer el músculo abdominal izquierdo. El tercer paso consiste en tomar un fragmento de músculo utilizando una aguja de calibre 21. Luego, se introduce un electrodo de alambre plateado doblado dentro de la aguja.A continuación, se retira la aguja a través del músculo, dejando el alambre dentro del músculo. Este proceso se repite para un segundo electrodo de alambre de plata. El cuarto paso consiste en colocar un alambre de tierra en el pecho del ratón.El quinto paso, ahora que se ha completado la cirugía, consiste en distender la vejiga y registrar las respuestas de EMG. Esto se realiza conectando primero los tres electrodos de alambre de plata a un amplificador y un digitalizador para registrar la respuesta motora visceral o VMR. A continuación, se conecta el catéter de la vejiga a un regulador de presión temporal y a un tanque de aire para administrar estímulos específicos que distiendan la vejiga con diferentes presiones a 15 milímetros de mercurio.No se registra ningún VMR. Sin embargo, a 30, 45 y 60 milímetros de mercurio, el VMR aumenta con la presión creciente. Cuando se representa gráficamente, se observa un aumento escalonado y progresivo del VMR normalizado conforme aumentan las presiones.Este procedimiento puede ayudar a comprender el dolor visceral de la vejiga. En particular, utilizando el modelo de distensión de la vejiga urinaria, se puede investigar todo el sistema nervioso en el contexto de la estimulación visceral nociva. Esto incluye el registro e investigación de los propios nervios periféricos, neuronas secundarias en la médula espinal y neuronas superiores en el tronco encefálico y el cerebro.Además, se pueden probar nuevos fármacos para el tratamiento del dolor de vejiga en humanos en este modelo fisiológico de dolor de vejiga. Induzca un estado anestésico colocando el ratón en una cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 2 al 3 %. Retire al ratón de la cámara de inducción después de que haya perdido el reflejo de righteo.Coloque el ratón en el cono nasal con isoflurano al 2 - 2,5%. A continuación, déle la vuelta al ratón para que su lado dorsal quede hacia abajo. Una vez volteado, compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie con pinzas.No debería haber ninguna respuesta por parte del animal. A continuación, sostenga suavemente la abertura uretral perpendicular al cuerpo del ratón con pinzas e introduzca la punta del catéter en la uretra. Baje el catéter para que quede paralelo al cuerpo del ratón e introduzca suavemente el catéter en el cuerpo del ratón.Presione suavemente sobre el abdomen para expulsar cualquier orina presente en la vejiga. Absorba esta con un trozo de papel absorbente. Aplique alcohol en el abdomen para desinfectar la zona.Realice una incisión de uno a dos centímetros en el área esterilizada para exponer el músculo abdominal izquierdo. Utilice las tijeras para separar la piel y aflojar la fascia de manera que quede expuesto el músculo abdominal oblicuo superior. En esta imagen, el músculo abdominal se encuentra cerca de la parte superior de la abertura quirúrgica y el músculo lug está en la parte inferior.Utilice una aguja de calibre 21 para tomar un pequeño fragmento de músculo. Pase la aguja a través del músculo. Es importante evitar cualquier vaso sanguíneo durante este proceso.A continuación, introduzca un extremo del alambre de plata en la aguja. Retire la aguja a través del músculo para introducir el alambre de plata en el músculo; el alambre debe quedar al ras con el trozo de músculo. Repita este procedimiento.Implante un segundo alambre de plata, aproximadamente a 0,5 centímetros del primer alambre. A continuación, implante un tercer alambre de plata en el tórax. Este alambre sirve como tierra.Aplique aceite mineral tibio sobre los músculos abdominales expuestos para mantenerlos húmedos. Reposicione al ratón de modo que quede de lado en una posición muy cómoda. A continuación, conecte las pinzas del electrodo a los electrodos de alambre de plata.Coloque los tres clips de manera que los cables no se toquen. Reduzca la anestesia a 1,5 % después de completar la cirugía. A continuación, reduzca el nivel de anestesia en 0,125 % cada 15 minutos hasta que el ratón presente una respuesta de flexión al pellizco del dedo del pie.Pellizco sin vocalización ni ambulación. Conecte el catéter vesical al tubo de aire que está conectado al regulador de presión temporal. Esto se utiliza para controlar la duración del intervalo previo a la presión, la prueba de distensión por presión y el intervalo interensayo posterior a la presión.Realice una distensión a 60 milímetros de mercurio para probar la respuesta del ratón a la distensión. Debe observarse una señal fuerte de EMG superior a 0,5 voltios. Si se observa esto, realice dos distensiones más para confirmar la respuesta.Si no se observa la respuesta adecuada, debe reducir el nivel de fluoruro de isoflurano. Si el ratón comienza a vocalizar o a moverse durante la prueba de distensión, debe aumentar el nivel de fluoruro de isoflurano. En el ejemplo actual, se puede observar una respuesta EMG intensa.Esto se consideraría una buena respuesta bimodal a la distensión vesical y no sería necesario ningún cambio en el nivel de isoflurano. Muchos estudios utilizan distensiones graduadas que comienzan a presiones bajas, como 15 milímetros de mercurio, y aumentan progresivamente hasta alcanzar presiones más nocivas. Ahora los datos han sido recopilados.Debe ser procesado y analizado. El primer paso consiste en rectificar todo el conjunto de datos tomando el valor absoluto de cada punto. Esto se logra más fácilmente utilizando software de análisis de datos, pero también puede hacerse manualmente.Ahora que tiene los datos corregidos, determine la respuesta media de EMG durante la sección de fondo del experimento. Reste esta respuesta de EMG de fondo de cada punto de datos del experimento para obtener el conjunto de datos corregido respecto al fondo. A continuación, determine el área bajo la curva para el intervalo previo a la presión, seguido del área bajo la curva para un ensayo de distensión por presión.Este proceso se repite para todos los intervalos de presión previa y los ensayos de distensión por presión. A continuación se muestra una captura de pantalla de un conjunto de datos analizados. Las gráficas aparecen en orden de arriba hacia abajo: la EMG cruda, la presión registrada por un transductor de presión, la señal de estímulo y, finalmente, la gráfica del área bajo la curva.En este ejemplo, para determinar el VMR no normalizado en el primer ensayo de distensión por presión, simplemente se debe restar el área calculada bajo la curva al inicio del ensayo del área bajo la curva al final del ensayo. Finalmente, cada área bajo la curva de los ensayos de distensión por presión se normaliza respecto al ensayo del intervalo previo a la presión con el valor más bajo medido. Esto se realiza dividiendo cada ensayo de distensión por presión entre el ensayo del intervalo previo a la presión más bajo para obtener el VMR normalizado en voltios por segundo.Aquí hay un gráfico que muestra el VMR normalizado para un solo conjunto de distensiones que van desde 15 hasta 75 milímetros de mercurio. Puede observarse un aumento progresivo del VMR en el eje Y con el incremento de las presiones en el eje X. Además, tras tres conjuntos de distensiones progresivas que van desde 15 hasta 75 milímetros de mercurio, puede verse que el VMR total de este ratón es consistente entre los conjuntos.La estabilidad de esta técnica permite realizar manipulaciones que pueden durar varias horas. Finalmente, se ilustra la importancia de un monitoreo cuidadoso de la temperatura corporal durante el procedimiento del RMV mediante distensión vesical. A continuación se presentan un conjunto de datos que muestran que una disminución de la temperatura corporal de 37,5 a 33,5 grados Celsius provoca una reducción significativa del RMV ante una distensión vesical de 60 milímetros de mercurio.Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo implantar quirúrgicamente electrodos de alambre y un catéter en la vejiga urinaria para usarlos con el modelo de distensión de la vejiga urinaria como representación del dolor visceral. También debería tener una mejor comprensión de cómo se analizan los datos generados por este ensayo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

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La infección de la próstata puede ser un factor contribuyente en la mediación de dolor pélvico en la prostatitis crónica. Se describe el procedimiento para la preparación de inóculo estandarizado bacteriana, la instilación de bacterias en la uretra de ratones machos y metodología para medir la alodinia táctil en ratones con el tiempo.

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El modelo de vejiga libre de detrusores permite el acceso directo al suburotelio para estudiar los mecanismos locales para la regulación de la disponibilidad de mediadores biológicamente activos en suburothelium/lamina propria durante el almacenamiento y la anulación de la orina. La preparación se asemeja mucho al llenado de una vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión sin influencias sistémicas.

Un modelo de vejiga murina descentralizada (Ex Vivo) con el músculo detrusor eliminado para el acceso directo al suburotelio durante el llenado de la vejiga

Aquí se proporcionan métodos para la inducción simple y rápida de un modelo de dolor de espalda en ratones utilizando una inyección intraligamentosa de activador del plasminógeno urinario.

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Aprende a establecer un modelo fisiológico de dolor vesical nocivo en ratones mediante distensión urinaria y registro de respuestas viscero-motoras. Este método permite investigar los mecanismos nerviosos de la cistitis intersticial.

Las respuestas de la Vejiga Urinaria Distensión Evocados visceromotor como modelo para la vejiga Dolor en ratones

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