Las respuestas de la Vejiga Urinaria Distensión Evocados visceromotor como modelo para la vejiga Dolor en ratones
27 de abril de 2014
Aproximadamente 3-8 million de personas en Estados Unidos sufren de síndrome de dolor cistitis intersticial / vejiga (IC / BPS), una condición debilitante que se caracteriza en parte por el dolor pélvico. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, un modelo fisiológico de dolor en la vejiga urinaria se utiliza en ratones y ratas.
El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo fisiológico del dolor de vejiga nocivo y ratones durante todo el procedimiento. La temperatura corporal se mantiene con una almohadilla térmica y un calentador radiante de techo. El primer paso en la cirugía es insertar un catéter en la uretra del ratón anestesiado.
El segundo paso es hacer una incisión para exponer el músculo abdominal izquierdo. El tercer paso es dar un mordisco al músculo con una aguja de calibre 21. A continuación, se introduce en la aguja un electrodo de alambre de plata doblado.
Luego, la aguja se retira a través del músculo, dejando el alambre en el músculo. Este proceso se repite para un segundo electrodo de alambre de plata. El cuarto paso es colocar un cable de tierra en el pecho del ratón.
El quinto paso, ahora que se ha completado la cirugía, es distender la vejiga y registrar las respuestas de EMG. Esto se hace conectando primero los tres electrodos de alambre de plata a un amplificador y digitalizador para registrar la respuesta del motor de las vísceras o VMR. A continuación, el catéter vesical se conecta a un regulador de presión de tiempo y a un tanque de aire para entregar estímulos específicos que distienden la vejiga con diferentes presiones a 15 milímetros de mercurio.
No se registra ningún VMR. Sin embargo, a 30, 45 y 60 milímetros de mercurio, el VMR aumenta con el aumento de la presión. Cuando se traza, puede ver un aumento gradual en el VMR normalizado con presiones crecientes.
Este procedimiento puede ayudar a comprender mejor el dolor visceral de la vejiga. En particular, utilizando el modelo de distensión de la vejiga urinaria, se puede investigar todo el sistema nervioso en el contexto de la estimulación visceral nociva. Esto incluye el registro y la investigación de los propios nervios periféricos, las neuronas secundarias en la médula espinal y las neuronas superiores en el tronco encefálico y el cerebro.
Además, se pueden probar nuevas terapias para el tratamiento del dolor de vejiga en humanos en este modelo fisiológico de dolor de vejiga. Inducir un estado anestésico colocando al ratón en una cámara de inducción a dos a 3% de flúor. Retire el ratón de la cámara de inducción después de que haya perdido su reflejo de escritura.
Coloque el ratón en el cono de la nariz a dos a 2,5% de flúor. A continuación, gire el ratón para que su lado dorsal quede hacia abajo. Una vez volteado, pruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie con pinzas.
No debe haber respuesta por parte del animal. A continuación, sujete suavemente la abertura uretral perpendicular al cuerpo del ratón con pinzas e inserte la punta del catéter en la uretra. Baje el catéter para que quede paralelo al cuerpo del ratón e inserte suavemente el catéter en el cuerpo del ratón.
Presione suavemente el abdomen para expulsar la orina de la vejiga. Absorbe esto con un pedazo de toalla de papel. Aplique alcohol en el abdomen para desinfectar el área.
Haga una incisión de uno a dos centímetros en el área esterilizada para exponer el músculo abdominal izquierdo. Use las tijeras para extender la piel y aflojar la fascia para que el músculo abdominal oblicuo superior quede expuesto. En esta imagen, el músculo abdominal está cerca de la parte superior de la abertura quirúrgica y el músculo del asa está en la parte inferior.
Use una aguja de calibre 21 para tomar un pequeño bocado de músculo. Empuje la aguja a través del músculo. Es importante evitar los vasos sanguíneos durante este proceso.
A continuación, introduce un extremo del alambre de plata en la aguja. Tire de la aguja hacia atrás a través del músculo para tirar del alambre plateado hacia el músculo, el alambre debe estar al ras con la mordida del músculo. Repite este proceso.
Implante un segundo alambre de plata, aproximadamente a 0,5 centímetros del primer alambre. A continuación, implante un tercer alambre de plata en el pecho. Este cable actúa como tierra.
Aplique aceite mineral tibio a los músculos abdominales expuestos para mantenerlos húmedos. Vuelva a colocar el mouse de modo que quede de lado en una posición muy cómoda. A continuación, conecte los clips de electrodos a los electrodos de alambre de plata.
Coloque los tres clips de manera que los cables no se toquen. Bajar la anestesia al 1,5%Una vez finalizada la cirugía. A continuación, baje el nivel de anestesia en un 0,125% cada 15 minutos hasta que el ratón muestre una respuesta de flexión a la punta del pie.
Pellizcar sin vocalización ni deambulación. Conecte el catéter vesical al tubo de aire que está conectado al regulador de presión de tiempo. Esto se utiliza para controlar la duración del intervalo de prepresión, el ensayo de distensión de presión y el intervalo entre ensayos de postpresión.
Realice una distensión a 60 milímetros de mercurio para probar la respuesta del ratón a la distensión. Se debe ver una señal EMG fuerte de más de 0,5 voltios. Si esto se ve, realice dos distenciones más para confirmar la respuesta.
Si no se observa la respuesta adecuada, debe reducir el nivel de flúor. Si el ratón comienza a vocalizar o a volverse ambulatorio durante la prueba de distensión, debe aumentar el nivel de flúor de Isof. En el ejemplo actual, puede ver una fuerte respuesta EMG.
Esto se consideraría una buena respuesta bimo a la distensión de la vejiga y no sería necesario ningún cambio en el nivel de flúor de Isof. Muchos estudios utilizan distensiones graduadas que comienzan a bajas presiones, como 15 milímetros de mercurio, y suben a presiones más nocivas. Ahora se han recopilado los datos.
Debe ser procesado y analizado. El primer paso es rectificar todo el conjunto de datos tomando el valor absoluto de cada punto. Esto se logra más fácilmente utilizando software de análisis de datos, pero también se puede hacer manualmente.
Ahora que tienes los datos rectificados, determina la respuesta promedio de EMG durante la sección de fondo del experimento. Reste esta respuesta EMG de fondo de cada punto de datos del experimento para obtener el conjunto de datos corregidos en segundo plano. A continuación, determine el área bajo la curva para el intervalo de prepresión, seguido del área bajo la curva para una prueba de distensión de presión.
Este proceso se repite para todos los intervalos de prepresión y ensayos de distensión de presión. Esta es una captura de pantalla de un conjunto de datos analizados. Los gráficos están en orden de arriba a abajo, el EMG bruto, la presión registrada de un transductor de presión, la señal de estímulo y, finalmente, el gráfico de área bajo la curva.
En este ejemplo, para determinar el VMR no normalizado para el primer ensayo de distensión de presión, simplemente hay que restar el área calculada bajo la curva al principio del ensayo del área bajo la curva al final del ensayo. Finalmente, cada área de prueba de distensión de presión bajo la curva se normaliza a la prueba de intervalo de prepresión medida más baja. Esto se hace dividiendo cada prueba de distensión de presión por la prueba de intervalo de prepresión más baja para obtener el VMR normalizado en voltios por segundos.
Aquí hay un gráfico que muestra el VMR normalizado para un solo conjunto de distensiones que van de 15 a 75 milímetros de mercurio. Puede ver un aumento gradual en el VMR en el eje Y con presiones crecientes en el eje x. Además, en tres conjuntos de distensiones graduadas que van de 15 a 75 milímetros de mercurio, se puede ver que el VMR general de este ratón es consistente entre conjuntos.
La estabilidad de esta técnica permite realizar manipulaciones que pueden durar varias horas. Por último, se ilustra la importancia de controlar cuidadosamente la temperatura corporal durante el procedimiento de VMR de distensión vesical. Aquí hay un conjunto de datos que muestran que una disminución en la temperatura corporal de 37.5 a 33.5 grados Celsius conduce a una disminución significativa en el VMR a 60 milímetros de distensión de la vejiga de mercurio.
Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo implantar quirúrgicamente electrodos de alambre y un catéter de vejiga urinaria para usar con el modelo de distensión de la vejiga urinaria del dolor visceral. También debe tener una mejor comprensión de cómo se analizan los datos generados por este ensayo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Descripción general
Este estudio establece un modelo fisiológico de dolor vesical nocivo en ratones. El modelo tiene como objetivo investigar las contribuciones del sistema nervioso a la cistitis intersticial/síndrome de dolor vesical (IC/BPS), una afección que afecta a millones de personas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología
- Urología
Antecedentes
- La cistitis intersticial/síndrome de dolor vesical (IC/SDV) afecta a entre 3 y 8 millones de personas en Estados Unidos.
- La IC/SDV se caracteriza por dolor pélvico y síntomas urinarios.
- Comprender los mecanismos subyacentes es fundamental para desarrollar tratamientos.
- Los modelos animales son esenciales para estudiar los mecanismos del dolor.
Objetivo del estudio
- Crear un modelo confiable para estudiar el dolor vesical.
- Explorar el papel del sistema nervioso en la IC/EBP.
- Facilitar investigaciones futuras sobre estrategias de manejo del dolor.
Métodos Utilizados
- Mantener la temperatura corporal con una almohadilla calefactora y una lámpara de calor radiante.
- Insertar un catéter en la uretra de ratones anestesiados.
- Realizar una incisión para exponer el músculo abdominal izquierdo.
- Usar una aguja de calibre 21 para tomar un fragmento de músculo e insertar un electrodo de alambre de plata doblado.
Resultados principales
- El modelo induce con éxito dolor de vejiga en ratones.
- Se pueden medir las respuestas fisiológicas al dolor de vejiga.
- Este modelo puede utilizarse para estudios adicionales sobre la IC/EBP.
- Los hallazgos podrían conducir a un mejor entendimiento y opciones de tratamiento.
Conclusiones
- Se ha establecido un modelo fisiológico del dolor vesical.
- Este modelo ayudará a comprender los mecanismos de la IC/EBP.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para mejorar la atención al paciente.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo proporciona un sistema fisiológicamente relevante para estudiar los mecanismos del dolor visceral subyacentes al cistitis intersticial/síndrome de dolor vesical (IC/BPS), una afección con una necesidad médica significativa no satisfecha. Al permitir respuestas visceromotoras (VMR) graduadas y cuantificables ante la distensión vesical, apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. La reproducibilidad del ensayo y su lectura a nivel del sistema nervioso facilitan la continuidad traslacional desde la identificación de dianas hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de respuestas nociceptivas en compartimentos del sistema nervioso periférico, espinal y suprarraquídeo.
- Valor operativo: Proporciona una lectura fiable y dependiente de la dosis (VMR) que apoya estudios de interacción con el blanco y modulación de vías.
- Valor estratégico: Refuerza la confianza predictiva en la selección de blancos al modelar la fisiología del dolor vesical humano en un sistema murino.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos y normalizados de RMV que permiten comparar las respuestas al dolor vesical entre diferentes condiciones experimentales.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de cirugía y estimulación garantizan la reproducibilidad entre laboratorios y puntos temporales.
- Valor estratégico: Permite la selección escalable de nuevos tratamientos para el dolor vesical mediante un punto final fisiológicamente validado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Modela el dolor inducido por la distensión vesical, relacionado con enfermedades, alineándose con los síntomas clínicos de la IC/EBP.
- Valor operativo: Permite estudios longitudinales debido a la respuesta estable del reflejo visceromotor durante varias horas con un control adecuado de la temperatura.
- Valor estratégico: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar información mecanicista sobre la eficacia analgésica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo de distensión de la vejiga urinaria-VMR se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del objetivo hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente para analgésicos que actúan sobre el sistema nervioso central y moduladores dirigidos a la vejiga.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre las contribuciones del sistema nervioso al dolor visceral mediante el registro de aferencias primarias, médula espinal y regiones cerebrales.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas del RVM dependientes de la presión, adecuadas para evaluar los efectos de compuestos sobre la señalización del dolor vesical.
- Análisis: Ofrece mediciones normalizadas del área bajo la curva del RVM que permiten comparaciones estadísticas entre grupos de tratamiento y gradientes de presión.
- Investigación Traducional: Modela el dolor por llenado vesical clínicamente relevante, favoreciendo la continuidad hacia la validación preclínica de terapéuticos específicos para la vejiga.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma reutilizable para evaluar mecanismos del dolor visceral en múltiples programas terapéuticos y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías del dolor vesical mediante la integración de lecturas del sistema nervioso periférico, espinal y central.
- Valor operativo: La implantación estandarizada de electrodos, la distensión controlada por presión y el análisis de la respuesta motora visceral aseguran la reproducibilidad del ensayo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos objetivos y cuantificables sobre la modulación del dolor en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapias para el dolor vesical basada en perfiles de respuesta a la dosis y de interacción con el objetivo.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en cirugía de roedores, implante de electrodos y cateterización de la vejiga.
- Los instrumentos incluyen reguladores de presión, amplificadores, digitalizadores y sistemas de monitoreo de temperatura.
- La estandarización en la técnica quirúrgica, la profundidad de la anestesia y los parámetros de distensión vesical es esencial para la comparabilidad de los datos.
- La adaptación a diferentes cepas de ratones o modelos de dolor puede requerir la validación de las curvas basales de respuesta motora visceral (VMR) y de presión-respuesta.
- Mantener la normotermia es fundamental, ya que la hipotermia atenúa significativamente la respuesta motora visceral (VMR) y compromete la integridad de los datos.
