Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo

Las defensas innatas contra infecciones virales son activadas por receptores de reconocimiento de patrones o PRR. Presentes en las células del sistema inmunitario innato durante una infección. Los PRR citoplasmáticos RIG-I y PKR se unen a ARN virales característicos, cambian su conformación al unirse a los ligandos y activan señales antivirales. Para monitorear los cambios conformacionales de RIG-I y PKR y su ligandización in vitro, se infectan células humanas A549 con el virus de la fiebre del Valle de Rift.

Clone 13 para estimular la activación de los PRR. Luego se preparan lisados celulares de células control e infectadas para analizar los cambios conformacionales de rig eye y PKR. Se realiza una digestión limitada con tripsina.

Si han ocurrido cambios conformacionales en la estructura de la proteína, esta será más resistente a la digestión y se observarán bandas mediante el análisis por inmunotransferencia. Para analizar la formación de todos los complejos nativos, se realiza electroforesis nativa seguida de análisis por inmunotransferencia. Si ha ocurrido toda la ligamentización, se observan complejos más altos de todas las formas ligadas y complejos PKR. La principal ventaja de la digestión limitada con proteasa y la electroforesis nativa es que estas técnicas facilitan la medición directa de la activación de rega y PKR.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad innata, como cuál es la naturaleza y el origen exactos de las especies de ARN relevantes para la activación de rig eye y PKR. Estos métodos pueden proporcionar información sobre los agonistas de rig eye y PKR. También pueden aplicarse a otras proteínas sensoras citoplasmáticas, como MDA cinco, demostrando el procedimiento que realizará Mila Viva, estudiante de doctorado de mi laboratorio, antes de comenzar este procedimiento.

Tenga en cuenta que el virus de la fiebre del Valle de Rift, clon 13, denominado a partir de ahora CL 13, es un mutante viral atenuado que, en Alemania, debe manipularse bajo condiciones BSL-2. Precaliente el medio PBS sin suero y el medio de cultivo celular que contiene 5 %FCS. Colóquelos en un baño de agua en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Prepare 1,25 veces 10 a la séptima PFU por mililitro de CL 13 en medio sin suero para infectar 2,5 veces 10 a la sexta.

Se preparan células A 5 49 con una multiplicidad de infección o MOI de cinco, aproximadamente un 10 % más de lo necesario para compensar errores de pipeteo. Retire las células A 5 49 del incubador, aspire el medio y agregue 10 mililitros de PBS; gire suavemente o incline el frasco de cultivo para lavar las células y luego elimine el PBS. A continuación, agregue un mililitro del CL 13 diluido o, para el control no infectado, una infección simulada (mock).

Añada un mililitro de medio sin suero e incube durante una hora cada 15 minutos. Incline cuidadosamente el matraz para asegurar una distribución uniforme del medio. Después de una hora de infección, retire el inóculo.

Añada cinco mililitros de medio de cultivo celular precalentado con FCS al 5%, e incube durante cinco horas. Prepare PBS con Triton X-100 al 0,5% y colóquelo a cuatro grados Celsius. No agregue inhibidores de proteasas sirios.

A continuación, lave las células con PBS frío y agregue 10 mililitros de PBS fresco. Luego, utilizando un raspador celular, desprenda las células del recipiente. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 800 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, elimine el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 30 microlitros de PBS con 0.5% de Triton X-100. Transfiera el lisado a un tubo nuevo de 1.5 mililitros e incube durante al menos 10 minutos en hielo. Centrifugue el lisado a 10.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, transfiera el lisado celular clarificado a un tubo nuevo. Realice un ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína en el lisado celular clarificado. Almacene a menos 20 grados Celsius o proceda inmediatamente a la digestión con tripsina o a electroforesis nativa para analizar cambios conformacionales en los receptores de reconocimiento de patrones. Primero, diluya la tripsina tratada con tosilo clorometil cetona (TPCK) en PBS hasta una concentración de trabajo final de dos microgramos por mililitro en dos tubos nuevos para cada condición. Ajuste la concentración final de proteína de los lisados de CL 13 y del control no infectado a 25 microgramos en un volumen final de nueve microlitros con PBS. Un conjunto de lisados se utilizará como control de entrada y el otro será tratado con tripsina TPCK; agregue un microlitro de PBS a los otros dos tubos restantes.

Añada un microlitro de tripsina TPCK de dos microgramos por microlitro para alcanzar una concentración final de 0.2 microgramos por microlitro. Mezcle las reacciones pipeteando. Incube los lisados a 37 grados Celsius durante 25 minutos.

Detenga la reacción añadiendo tampón muestral desnaturalizante cinco veces y luego hirviendo durante cinco minutos a 95 grados Celsius. Es importante no prolongar el tiempo de incubación con tripsina. Tenga en cuenta que el control preciso del tiempo de digestión con tripsina es fundamental para la detección de fragmentos resistentes sin fondo; si no se detectan proteínas resistentes o si se detectan en exceso, ajuste la duración de la digestión en consecuencia.

Después de hervir, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius o cargue las muestras en dos geles de dodecil sulfato sódico poliacrilamida, compuestos por un gel de apilamiento al 5% sobre un gel de resolución al 12%. Separe las proteínas a 25 miliamperios por gel hasta que el azul de bromofenol salga del gel.

Después de correr los geles, transfiera las proteínas de un gel a una membrana de fluoruro de polivinilo y analice mediante inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos contra rig eye y PKR; tiña el otro gel con azul brillante de Coomassie G 250. Luego, almacene el gel en etanol al 25 %, ácido acético al 8 % y glicerol al 4 % a cuatro grados Celsius o proceda a realizar la obtención de imágenes y el análisis. Para analizar los estados oligoméricos de los receptores de reconocimiento de patrones, prepare 50 microgramos de lisado celular en un volumen final de 10 microlitros con PBS y agregue tampón de muestra 5x hasta una concentración final de 1x.

Cargue inmediatamente las muestras en un gel nativo de poliacrilamida con una gel de apilamiento al 5% y una gel de separación al 8%. Cualquier demora provocará una pérdida de los complejos nativos. Corra el gel a 20 miliamperios por gel a cuatro grados Celsius.

Detenga la electroforesis 45 minutos después de que la banda de azul de bromofenol haya salido del gel, tras un total de aproximadamente 1,5 a dos horas, antes de realizar la transferencia para inmunotransferencia usando anticuerpos dirigidos contra rig eye y PKR, tal como se describe en el documento adjunto, para analizar el cambio conformacional y la formación de oligómeros inducidos por el reconocimiento de un agonista viral por rig eye o PKR. La digestión con proteasa limitada y la electroforesis nativa se realizaron como se describe en este video. La digestión con tripsina de lisados de células mock infectadas provocó una degradación rápida de rig eye, mientras que la infección con el clon 13 condujo a la generación de un fragmento resistente de rig eye de 30 kilodaltones. PKR también muestra resistencia parcial a la digestión con tripsina en muestras infectadas, lo que coincide con su fosforilación. Para monitorear la eficiencia y especificidad de la digestión con tripsina, los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie G-250. Las muestras no tratadas muestran cantidades iguales de proteínas cargadas. Someter lisados de células mock y C13 a digestión con tripsina conduce a una disminución comparable de las cantidades globales de proteínas.

Esto demuestra que el tratamiento con tripsina tiene la misma eficiencia en muestras infectadas con CL 13 y en muestras control en células no infectadas. Solo se detectaron monómeros de R EYE y PKR como control adicional. Se incluyó el factor de transcripción IRF tres, que está presente como un monómero, pero se sabe que forma dímeros tras la activación mediante R Eye.

La infección por el clon 13 provoca una fuerte acumulación de complejos oligoméricos de RIG-I en forma de mancha difusa, así como de dímeros u oligómeros de PKR e IRF3 en forma de una banda proteica definida. Estos resultados demuestran que las técnicas de digestión limitada y electroforesis nativa son herramientas útiles para monitorear los cambios conformacionales y la formación de oligómeros de RIG-I y PKR tras la infección. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo monitorear el cambio conformacional y la oligomerización de RIG-I y PKR una vez dominadas las técnicas.

Esta técnica puede realizarse en dos días siguiendo este procedimiento. Como método, se pueden realizar ensayos tipo pro para responder preguntas adicionales, como si existe una interacción estable con el ligando estimulante tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunidad innata exploraran el estado de activación de los receptores de reconocimiento de patrones en células estimuladas por virus.