Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo

Las defensas innatas a las infecciones virales son desencadenadas por los receptores de reconocimiento de patrones o prrs. Presente en las células del sistema inmunitario innato durante una infección. El PRRS citoplasmático y PKR se unen a los ARN de la firma viral, cambian la confirmación de todos los ojos de liga y activan la señalización antiviral para monitorear los cambios de confirmación de PKR y PR y todas las células de ligamentización in vitro A 5 49 humanas están infectadas con el virus de la fiebre del Valle del Rift.

Clon 13 para estimular la activación de PRR. A continuación, se preparan los lisados celulares de las células de control y las células infectadas para analizar los cambios de confirmación en el ojo de la plataforma y la PKR. Se realiza una digestión de prueba limitada.

Si se han producido cambios confirmatorios en la estructura de la proteína, la proteína es más resistente a la digestión y se observarán bandas con Western blot. Se realiza un análisis para analizar la formación de una página nativa de allgas, seguido de un análisis de Western blot. Si toda la ligamentización se ha producido más arriba, se ven todos los complejos de ojo de la liga y PKR. La principal ventaja de la digestión limitada de proteasas y la página nativa es que estas técnicas facilitan la medición directa de la activación de rega y PKR.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad innata, como cuál es la naturaleza exacta y el origen de las especies de ARN relevantes para la activación del ojo de la plataforma y PKR. Estos métodos pueden proporcionar información sobre los agonistas del ojo de la plataforma y la PKR. También se pueden aplicar a otras proteínas sensoras citoplasmáticas como la MDA cinco, demostrando el procedimiento será Mila Viva, una estudiante de doctorado de mi laboratorio antes de comenzar este procedimiento.

Tenga en cuenta que el clon 13 del virus de la fiebre del Valle del Rift, denominado en lo sucesivo CL 13, es un mutante del virus atenuado, que en Alemania debe manipularse bajo dos condiciones BSL para precalentar el medio libre de suero PBS y el medio de cultivo celular que contiene 5% de FCS. Colóquelos en un baño de agua en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Preparar 1,25 veces 10 a la séptima UFP por mililitro de CL 13 en medio libre de suero para infectar 2,5 veces 10 a la sexta.

A 5 49 células con una multiplicidad de infección o MOI de cinco preparan aproximadamente un 10%más de lo necesario para tener en cuenta los errores de pipeteo. Retire las células A 5 49 de la incubadora, aspire el medio y agregue 10 mililitros de PBS, gire o incline el matraz de cultivo para lavar las células y luego retire el PBS. A continuación, agregue un mililitro del CL 13 diluido o para el control no infectado o infección simulada.

Añadir un mililitro de medio libre de suero e incubar durante una hora cada 15 minutos. Incline con cuidado el matraz para asegurar una distribución equitativa del medio. Después de una hora de infección, retire el ocular.

Añadir cinco mililitros de medio de cultivo celular precalentado con 5%FCS, e incubar durante cinco horas. Prepare PBS con 0.5%tritton X 100 y colóquelo a cuatro grados centígrados. No agregue inhibidores de la proteasa siria.

A continuación, lave las celdas con PBS frío y agregue 10 mililitros de PBS fresco. Luego, con un raspador de células, separe las células del plato. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuga a 800 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después del centrifugado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 30 microlitros de PBS con 0,5%Triton X 100. Transfiera el lisado a un tubo nuevo de 1,5 mililitros e incube durante al menos 10 minutos en hielo. Centrifugar el lisado a 10.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, transfiera el lisado celular clarificado a un tubo nuevo. Realizar un ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteínas en el lisado celular clarificado Almacene a menos 20 grados centígrados o proceda inmediatamente a probar y digerir o página nativa para probar cambios confirmatorios de los receptores de reconocimiento de patrones primero diluidos L un tosto cloro, metilcetona tratada o TPCK tripsina en PBS a una concentración de trabajo final de dos microgramos por mililitro en dos tubos nuevos para cada condición, ajustar la concentración final de proteínas del CL 13 y de las proteínas de control no infectadas lisadas a 25 microgramos en un volumen final de nueve microlitros con PBS, un conjunto de lisados se utilizará como control de entrada y el otro se tratará con tripsina TPCK a los tubos de control no tratados. Agregue un microlitro de PBS a los dos tubos restantes.

Agregue un microlitro de dos microgramos por microlitro de tripsina TPCK para llevar la concentración final a 0,2 microgramos por microlitro. Mezclar las reacciones mediante pipeteo. Incubar los lisados a 37 grados centígrados durante 25 minutos.

Detenga la reacción agregando cinco tampones de muestra desnaturalizantes y luego hirviendo durante cinco minutos a 95 grados Celsius. Es importante no prolongar el tiempo de incubación de la tripsina. Tenga en cuenta que el momento preciso de la digestión de la tripsina es fundamental para la detección de fragmentos resistentes sin ningún antecedente, si no se detectan proteínas resistentes o si se detectan demasiadas, ajuste la duración de la digestión. En consecuencia.

Después de hervir, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados o cargue las muestras en dos sulfato de sodio. Geles de poliacrilamida que consisten en un gel apilante al 5% sobre un gel resolutivo al 12%. Separe las proteínas a 25 miliamperios por gel hasta que se agote el azul de fenol bromo.

Después de ejecutar los geles, transfiera las proteínas de un gel a una membrana de fluoruro de vid polivina y se analice mediante Western blot con anticuerpos dirigidos contra el ojo de la plataforma y PKR tiña el otro gel con kumasi brilliant blue G two 50. Luego, almacene el gel en 25% de etanol, 8% de ácido acético y 4% de glicerol a cuatro grados centígrados o proceda a realizar imágenes y análisis. Para analizar los estados oligoméricos de los receptores de reconocimiento de patrones, prepare 50 microgramos de lisado celular en un volumen final de 10 microlitros con PBS y agregue cinco tampones de muestra hasta una concentración final de 1 x.

Cargue inmediatamente las muestras en un gel de poliacrilamida nativo con un 5% de apilamiento y un 8% de gel. Cualquier retraso resultará en una pérdida de complejos nativos. Ejecute el gel a 20 miliamperios por gel a cuatro grados centígrados.

Detenga la electroforesis 45 minutos después de que la banda azul de fenol Bromo haya abandonado el gel después de un total de aproximadamente 1,5 a dos horas por realización de Western blot utilizando anticuerpos dirigidos contra el ojo del aparejo y la PKR como se describe en el documento adjunto para el ensayo de conmutación de confirmación y oligonucleótidos inducidos por el reconocimiento de un agonista viral por ojo en el aparejo o la digestión limitada de la proteasa PKR y la página nativa se realizaron como se describe en este video. La digestión con tripsina de lisados de células infectadas simuladas resultó en una rápida degradación del ojo de la plataforma, mientras que la infección del clon 13 condujo a la generación de un fragmento de ojo de la plataforma resistente a 30 kilodalton. PKR también muestra resistencia parcial a la digestión de tripsinas en muestras infectadas, lo que coincide con su fosforilación para monitorear la eficiencia y especificidad de los geles de digestión de tripsinas que se tiñeron con azul brillante de kumasi G dos 50. Las muestras no tratadas muestran cantidades iguales de proteínas cargadas, el sometimiento simulado y los lisados de células C 13 a la digestión de tripsinas conduce a una disminución comparable de las cantidades globales de proteínas.

Esto demuestra que el tratamiento con tripsina tiene la misma eficacia para muestras infectadas simuladas y CL 13 en células no infectadas. Solo se detectaron monómeros de R, EYE y PKR como control adicional. Se incluyó el factor de transcripción IRF tres, que está presente como monómero, pero se sabe que se dimeriza al activarse a través de R Eye.

La infección del clon 13 conduce a una fuerte acumulación de complejos oligoméricos de ojo de plataforma en forma de frotis y de PKR e IRF tres dímeros u oligómeros como una banda de proteína definida. Estos resultados demuestran que los viajes limitados en la digestión y la página nativa son herramientas útiles para monitorear los cambios confirmatorios y la formación de oligonucleótidos en el ojo de la plataforma y la PKR después de la infección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear la conmutación y la ización de confirmación de WIC eye y PKR una vez dominado.

Esta técnica se puede realizar en dos días después de este procedimiento. Como métodos, se pueden realizar ensayos como los profesionales para responder a preguntas adicionales, como si hay una interacción estable con el ligando estimulante después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunidad innata exploraran el estado de activación de los receptores de reconocimiento de patrones en células estimuladas por virus.