Name: Técnica de Subnormothermic Ex Vivo Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende la técnica de perfusión hepática subnormotérmica ex vivo para preservar y evaluar injertos hepáticos marginales antes del trasplante. Este método reduce la lesión por preservación y permite la evaluación funcional del órgano.

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El estudio fue apoyado por becas de investigación de la Transplant Roche Organ Research Foundation (ROTRF) y Astellas. Markus Selzner fue apoyado por un premio de desarrollo ASTS carrera. Matthias Knaak fue apoyado por la beca Astellas Investigación. Damos las gracias a Uwe Mummenhoff y la familia Birmingham por su generoso apoyo.

Una visión general esquemática del protocolo se presenta en la Figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" /> Figura 1. protocolo de estudio. El diseño del estudio porcino de lesión hepática se basa en un modelo de donación después de la muerte cardíaca (DCD). Después de la disección de los vasos hepáticos, muerte cardiaca se induce seguido por 45 min de isquemia caliente injerto. Para simular un transporte de injerto entre los donantes y receptores hospitales en un entorno clínico, el injerto se almacena en hielo durante 4 h después de frío, de doble descarga. Después de almacenamiento en frío, el órgano se perfunde subnormothermic durante 6 horas con el fin de evaluar la estabilidad de perfusión. En un modelo de trasplante, el tiempo de perfusión podría ser más corto con el fin de recargar el almacenamiento de energía y para evaluar la viabilidad del órgano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic en él</a>volver a ver una versión más grande de esta figura. 1. Animales NOTA: los cerdos macho Yorkshire, 30-35 kg, se utilizaron para este estudio. Todos los animales recibieron atención humanitaria en el cumplimiento de los &quot;Principios&quot; de Laboratorio Animal Care &#39;&#39; formulados por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica y la &quot;Guía para el Cuidado de Animales de Laboratorio &#39;&quot;, publicado por los Institutos Nacionales de Salud. El Comité de Cuidado Animal del Instituto de Investigación General de Toronto aprobó todos los estudios. 2. Recuperación de Órganos <ol><li> Casa masculinos cerdos Yorkshire en las instalaciones de investigación para 1 semana antes de la perfusión / trasplante para reducir el nivel de estrés y para acostumbrar a los animales a las condiciones de la vivienda. Menos de 2 días de alojamiento dentro de las instalaciones dará lugar a una reacción física inducida por el estrés, que puede alterar el resultado de la perfusión 22,23. </li><li> Anestesiar cerdospor una inyección intramuscular (IM) de una mezcla de ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg) y midazolam (0,15 mg / kg). </li><li> Antes de la intubación, asegurar el cerdo respira espontáneamente 2 L de O 2 dosificado con 5% de isoflurano. Rocíe las cuerdas vocales con lidocaína al 2% 2 min antes de la intubación para evitar los espasmos de las cuerdas vocales. Por ejemplo, para un cerdo de 35 kg utilizar un fr 6.5. tubo traqueal. Bloquear el tubo traqueal con 3-5 ml de aire de la habitación. </li><li> Después de la intubación, utilizar la capnografía para confirmar la correcta intubación. Bajar el gas isoflurano al 2%. Ajuste el ventilador para 14-16 respiraciones / min y un volumen corriente de 10 ml / kg de peso corporal. </li><li> Coloque una (iv) catéter 20 G intravenosa en una de las venas de la oreja para permitir la infusión de solución de lactato de Ringer (200 ml por hora). Luego frote el cerdo y la cubrirá con paños estériles. </li><li> Hacer una incisión de línea media seguido de una extensión lateral izquierdo. Use una toalla para cubrir los intestinos grandes y pequeños y colóquelos en el lado izquierdo. </li><li> Infe separadavena cava rior (IVC) y la aorta distal entre sí; aorta se ramifica ligar a la parte de atrás; aislar y arterias renales libres del tejido adherente. </li><li> Divida el ligamento falciforme y el ligamento triangular usando cauterio. </li><li> Soltar la vena porta por una incisión del peritoneo entre el páncreas y la vena portal. Ate venas de drenaje del páncreas a la vena porta. </li><li> Disecar el tronco celíaco por debajo de la vena porta y seguir hacia atrás a la aorta. Rodea la arteria mesentérica con un empate 2-0; rodear las arterias gástricas esplénica y de izquierda, que se ramifican posteriormente al tronco celíaco. Disecar el tronco celíaco de la vena porta. </li><li> Ligar los vasos linfáticos en el ligamento hepatoduodenal para evitar fugas linfático. Divida la arteria gástrica derecha entre los lazos. Ligar las venas más pequeñas. Separe el conducto de la bilis desde el ligamento y se divide distalmente después de la ligadura. </li><li> Diseccionar la aorta detrás del diafragma entre el corazón y tr celíacaunk; colocar un empate 2-0 alrededor de la aorta. </li><li> Soltar el hígado a partir de la cava inferior en el lado derecho usando electro cauterización; utilizar tijeras para la parte superior, entre cava y el hígado. </li><li> Retire la vesícula biliar y cauterizar vasos sangrantes de lecho vesicular. </li><li> Administrar iv 1.000 UI / kg de peso del donante de Heparina. Para un modelo de DCD, inducir un paro cardiaco por inyección intracardiaca de 40 mEq KCl 3 min después de la administración de heparina. Conjunto paro cardiaco como el punto de partida de la isquemia caliente. </li><li> Para la perfusión, recoger 1,6 L de sangre de cerdo en CPDA bolsas (citrato, fosfato, dextrosa, adenosina) inmediatamente después de la muerte cardíaca. Efectuar un lanzamiento suave (2000 xg sin freno). Retire el plasma y la capa leucocitaria en condiciones estériles (de bioseguridad de clase II del gabinete) y almacenar los eritrocitos en CPDA bolsas para transfusión. </li><li> Vena porta cannulate y aorta con líneas de lavado de órganos. Ate los lazos establecidos con anterioridad en torno femoral, renal, esplénica, mesentérica, y el arte gástrica izquierdaerie, así como la aorta superior. Para un modelo de corazón latiendo donante (HBD), realizar la canulación de la aorta y la vena porta en condiciones latidos de su corazón. </li><li> Después de 45 minutos de isquemia caliente, lavar el hígado con (UW) solución de la Universidad de Wisconsin usando doble perfusión a través de la aorta (bolsa de presión) y la vena porta (por gravedad). </li><li> Cortar el hígado de cerdo, dejando a todos los buques que permanezcan mucho tiempo. </li><li> Durante la preparación de back-mesa, sujetar la parte superior del IVC utilizando un Satinsky abrazadera y el hígado a eliminar una segunda vez con aproximadamente 0,5 L de solución de UW retrógradamente a través de IVC inferior hasta que el flujo de salida de la vena porta es clara. </li><li> Ate todas las ramas arteriales de la aorta y tronco celíaco. Realizar una presión de perfusión arterial back-mesa con aproximadamente 0,5 l de solución de UW. </li><li> Lave el conducto biliar usando solución UW. </li><li> Cannulate las partes superior e inferior de la vena cava inferior utilizando un medio &quot;x 3.8&quot; reductores con Luer Lock; canular la vena porta y la arteria hepática utilizando 8.3 &quot;; x 1/4 &quot;y 1/4&quot; x 3.8 &quot;reductores con Luer Lock. Utilice la vena cava superior e inferior como drenaje venoso. </li><li> Coloque el hígado en una bolsa de órganos, cerrar la bolsa de órganos, y almacenar el hígado en hielo hasta que se ha iniciado la perfusión. </li></ol> 3. ex vivo de perfusión de hígado <ol><li> Preparar la solución de perfusión que contiene la solución 2,000 ml Steen, 400 ml de eritrocitos lavados, 550 mg de piruvato de sodio, 100 ml de solución de ácido amino (10% Travasol), 10 mg de gluconato de calcio, 1000 IE de insulina de acción rápida, 1 g de cefazolina, 500 mg metronidazol, y 10.000 UI de heparina. Añadir otras moléculas de la vasodilatación, la inmunosupresión, la compactación de especies reactivas de oxígeno, o tratamiento con células del hígado basado en el protocolo de estudio particular. </li><li> Para el componente de diálisis, utilizar dializado estándar que contiene 3,5 mM de potasio, bicarbonato 25 mM, glucosa 27 mM, así como 275 mg / L piruvato. </li><li> Configure el circuito de perfusión (ver esquema de la figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" /> Figura 2. Circuito configurado. Viniendo desde el depósito principal como el punto de partida y final, la solución de perfusión es impulsado por una bomba centrífuga a través de un oxigenador. Justo después de la oxigenación de la solución, el circuito se divide en una línea más pequeña corriendo a una unidad de dializador para la homeostasis del electrolito y una línea más grande en ejecución a un filtro de leucocitos para la reducción de las células blancas de la sangre remanentes (WBC). La solución que se ejecuta a través del dializador devuelve al depósito principal. Después de que el filtro de leucocitos, el circuito se divide otra vez en 2 líneas iguales. Una línea funciona a alta presión (alrededor de 60 mm de Hg) directamente en la aorta para perfundir la arteria hepática. La otra línea desemboca en un segundo depósito. Desde este depósito se perfunde la vena portal. La presión de la perfusión portal depende de la energía de elevación de nivel de la solución del depósito (alrededor de 2-6 mm de Hg). Todos los fluidos son drobjetivó a través de la infraestructura y supra-hepática cava de vuelta al depósito principal. Para la reducción de la gravedad y la perfusión homogénea, el hígado se coloca en una piscina llena de agua con regulación de temperatura. Se separa del agua por una membrana impermeable y que nada en una suspensión de la perfusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Recoge todos los fluidos del circuito en un 3 L depósito (reservorio principal) y sujetar la salida. </li><li> Conectar la salida a una bomba centrífuga seguido de un oxigenador comercial. </li><li> Detrás del oxigenador, dividir el tubo en 2 líneas. Conecte una línea a un dializador y escurrir de nuevo en el depósito principal. Conecte la segunda línea a un filtro de reducción de leucocitos. </li><li> Dividir la línea después del filtro de reducción de leucocitos en una línea arterial, que suministra solución de perfusión de la arteria hepática, y un portal vlínea endógeno entrega de solución de perfusión a un segundo depósito, que drena en la vena portal de salida por gravedad. Sujete la entrada del portal. </li><li> Conecte la línea arterial a una línea de vena cava desemboca en el principal reservorio de recolección de líquidos. </li><li> Para la recolección de ascitis o fuga de la solución de perfusión del hígado, preparar una línea de succión conectado al depósito principal. </li></ol></li><li> Soltar la abrazadera de flujo de salida desde el depósito principal y llenar el circuito con la solución de perfusión. Arranque la bomba centrífuga a 1500 revoluciones / min. La solución de perfusión conducirá a través de la línea arterial en la línea de la vena cava de vuelta al depósito principal. Asegúrese de que todo el aire es expulsado del circuito. </li><li> Abra el suministro de gas para el oxigenador. </li><li> Tome el hígado fuera del hielo. Enjuague la solución UW utilizando solución salina. </li><li> Coloque el hígado, con su lado convexo hacia abajo para facilitar el acceso a los vasos, idealmente en un ambiente libre de gravedad para evitarcompresión de órgano en la superficie de contacto. Use un baño de agua y calor refrigerable. Ajuste la temperatura inicial del baño de circuito y el agua a 20 ° C. Cubra el baño de agua con una membrana impermeable y colocar el hígado en esa membrana. Reducir la gravedad de compresión impulsado por sumergir el hígado con una solución de perfusión. </li><li> Reducir la velocidad de la bomba centrífuga a 1.000 revoluciones / min y colocar dos abrazaderas en la conexión de las líneas arteriales y la vena cava. Luego, cortar el tubo entre las abrazaderas. El uso de un conector de 3 vías, unir las dos salidas de cava y conectarlos a la línea de la vena cava. </li><li> Suelte la abrazadera de la línea arterial, vierta la solución de perfusión en la cánula arterial de deshacerse de las burbujas, y conecte la línea a la cánula. Aumente la bomba centrífuga a 1.500 vueltas / min. Suelte la segunda pinza de la línea de la vena cava. </li><li> Suelte la abrazadera del reservorio venoso portal a fin de llenarlo. Deje que la solución de perfusión verter en el portal cannula y conectarlo. Tenga especial cuidado de los niveles de líquidos estables en el depósito portal. </li><li> Conecte las líneas de presión a las Esclusas de Luer de las cánulas arterial, portal y la vena cava. </li><li> Para imitar las condiciones fisiológicas, aplicar tratamientos en el recipiente de la derecha. Inyectar la glucosa en la vena portal y no en la línea arterial con el fin de establecer un gradiente de imitar un mayor gradiente de glucosa venosa portal y la inducción de la síntesis de glucógeno 24,25. </li><li> Después de conectar el hígado al circuito, elevar la temperatura a 33 ° C dentro de 60 min. </li><li> Objetivo para un flujo arterial comenzando en alrededor de 250 ml / min a 40 mmHg. Esto puede llegar a 700 ml / min durante la perfusión una vez que la presión se incrementa hasta 70 mmHg. </li><li> Al comenzar la temperatura, el objetivo de un flujo de la vena porta de 500-600 ml / min a 3-5 mmHg. Después de elevar la temperatura, controlar el flujo venoso portal, que aumentará hasta 1100 ml / min a 4-6 mmHg. Evite sobrepasar la presión portal por encima de physiologicavalores l (alrededor de 8 mmHg) para proteger fenestraciones sinusoidales 26. Evitar sobrepasar el flujo total por encima de 2.000 ml / min con el fin de evitar daños en el órgano. Ajuste el flujo de salida de -2 mmHg bajando el principal reservorio para evitar la congestión del hígado por la obstrucción del flujo funcional. </li><li> Añadir el componente de diálisis para el circuito con el fin de equilibrar la solución de perfusión a los valores predeterminados 27. Ajuste el flujo de dializado de 500 ml / hr. Tome especial atención para ajustar el flujo de salida de diálisis para que la solución de perfusión se diluye ni tampoco se concentró. Dentro de la primera hora de la perfusión del depósito principal debe ser vigilado cuidadosamente! </li><li> Asegurar la oxigenación del tejido homogéneo para recuperar y mantener la función del órgano mediante el uso de un principal componente de la mezcla de gas de O 2 (95-98%) y CO 2 (2-5%). Utilice gas variable durante la perfusión ya que el hígado cambia su metabolismo y su demanda pH durante la perfusión. </li><li> Mantener un pH bajo durante el inicio deperfusión para proteger el órgano mediante el concepto de pH paradoja 28 y evitar daños graves en los tejidos que pueden resultar de conexiones rápidas a pH fisiológico bajo reoxigenación, ya que después de almacenamiento en solución UW, el órgano tenga un pH por debajo de 7 acidótico Ajustar la presión parcial de CO 2 continuamente a 25-30 mmHg modo que el pH alcance un nivel fisiológico dentro de 1 h. </li><li> Añadir bicarbonato de sodio o de potasio para el circuito para lograr una concentración fisiológica de bicarbonato estándar en la solución de perfusión. Inyectar cuidadosamente bajo gas sangre repetitivo y control de electrolito. </li><li> Vigilar la perfusión por periódico venosa y arterial de gases en sangre y AST análisis. El PO 2 venosa permanece por encima de 175 mmHg durante la perfusión. Monitorear el flujo y la presión vascular y nota una perfusión estable por una resistencia vascular constante. </li><li> Mantener el sistema de perfusión estable durante un máximo de 8 horas. Al final del período ex vivo de perfusión, frescopor el sistema de perfusión a 20 ° C y, después de desconectar el tubo del circuito desde el hígado, enjuagar la solución de perfusión a cabo el hígado dualmente con solución UW hielo frío. Almacenar el hígado, una vez más colocado en hielo en una bolsa de órganos estéril. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En un modelo de cerdo que imita DCD trasplante de hígado, hemos demostrado que la perfusión del hígado con un subnormothermic celulares resultados solución de perfusión en los parámetros estables de perfusión de hepatocitos, lesión mínima, y ​​metabolismo hepático activo. Nuestra perfusión subnormothermic establecido ha demostrado para recuperar una homeostasis hepatocelular y el metabolismo. Almacenamiento de glucógeno se restaura y metabolitos se descartan. Ex vivo la perfusión del hígado como técnica de conservación ofrece por primera vez la oportunidad de evaluar marcadores de la función del injerto y la lesión durante la preservación de órganos y antes del trasplante. Además de la evaluación macroscópica de la homogeneidad de la perfusión del injerto, los valores de flujo proporcionan un buen indicador de la viabilidad del injerto y el grado de la lesión isquémica que había sufrido anteriormente 29. El consumo de oxígeno y la producción de bilis son marcadores de la función metabólica. Los niveles de enzimas hepáticas como AST se pueden utilizar comoSess el grado y la dinámica de la lesión hepatocelular 30. Esta evaluación exhaustiva injerto puede permitir una discriminación fiable entre órganos trasplantables marginales y no trasplantables. Elegimos una temperatura subnormothermic de 33 ° C en nuestro sistema de perfusión porque la temperatura es suficiente para permitir el metabolismo, así como ATP y la síntesis de glucógeno. Al mismo tiempo, proporciona una demanda de oxígeno disminuido en comparación con la configuración de perfusión normothermic que proporciona seguridad adicional contra la lesión isquémica. En general, las temperaturas de perfusión por encima de 30 ° C han demostrado para minimizar la lesión isquémica en frío y proporcionar suficiente actividad metabólica 31. A diferencia de otros grupos, no usamos sangre entera como perfusión, sino una solución de albúmina-normo osmótica (Steen) con glóbulos rojos lavados y filtrados. Al excluir los componentes del plasma, así como trombocitos y leucocitos, la solución de perfusión es defirmado para minimizar la señalización proinflamatoria durante la perfusión ex vivo. Además de la evaluación de injerto, condiciones de perfusión estables durante varias horas permiten el tratamiento de injerto. Numerosas moléculas han demostrado para atenuar la lesión por reperfusión en condiciones experimentales 32. Sin embargo, casi ningún régimen de tratamiento ha hecho su camino en la práctica clínica, sin embargo. Una de las razones parece ser la falta de oportunidad de aplicar los tratamientos durante el almacenamiento en frío. Un hígado metabólicamente activa en un sistema de perfusión ex vivo es óptimo para aplicar cualquier tipo de tratamiento. En este sentido, no sólo tratamientos para mejorar las condiciones de reperfusión como la atenuación de la actividad de las células de Kupffer o eliminadora de especies de oxígeno reactivas son concebibles sino también tratamientos como la terapia génica para acondicionar el injerto, por ejemplo, contra la hepatitis C recurrencia. Otras estrategias potenciales podrían incluir la reducción en la esteatosis durante la perfusión ex vivoperíodo de 33. En resumen, la perfusión del hígado ex vivo es una nueva estrategia para minimizar la lesión isquémica en frío y para evaluar injertos de hígado marginales antes del trasplante de hígado. El ajuste de la perfusión ex vivo proporciona la oportunidad única de reparación y condiciones injertos antes del trasplante.

El trasplante de hígado es la única opción de tratamiento para los pacientes con enfermedad hepática en fase terminal o el carcinoma hepatocelular avanzado. Durante los últimos 25 años, el número de candidatos en lista de espera ha aumentado gradualmente y superado el número de injertos disponibles. El número de donantes a corazón ha disminuido en la última década. Al mismo tiempo, el número de injertos marginales, tales como la donación después de la muerte cardíaca (DCD), así como hígados grasos viejos y han aumentado 1,2. Injertos marginales a menudo se disminuyeron para el trasplante de hígado debido a la mayor probabilidad de la función incumplimiento o retraso primario del injerto. En los injertos de DCD, el desarrollo de las estenosis biliares de tipo isquémico (ITBS) es motivo de especial preocupación. Con la técnica de conservación en frío estática convencional, ITBS ocurren en aproximadamente el 10-40% de los injertos DCD. En la mayoría de los pacientes, ITBS conduce a re-trasplante o la muerte del paciente. Especialmente prolongados tiempos de isquemia caliente y frío de riesgofactores para ITBS 3-7. La edad del donante, las predisposiciones genéticas (como CCR5 delta 32), y la elección de la solución de preservación también se han discutido como factores de riesgo adicionales 7-10. Microtrombosis parcial de los vasos peribiliary se ha sugerido como mecanismo potencial para ITBS después del trasplante hepático con injertos de DCD 11. Antes de la introducción clínica de trasplante de hígado, ex vivo perfusiones del hígado se han utilizado para estudiar el metabolismo hepático y la fisiología 12,13. Después de un trasplante de hígado encontró su camino en el ámbito clínico en la década de 1960, se han hecho innumerables intentos de utilizar la perfusión ex vivo de hígado como método de conservación mediante la imitación de las condiciones de nutrición y oxigenación fisiológicas. Su utilidad para la preservación de los injertos marginales se ha investigado en la última década, pero no llegar a la atención clínica estándar. Recientemente hemos descrito una reducción de la lesión de la vía biliar en DCD trasplante de hígado perfundido ex vivo por la preservación 14. Se realizaron diferentes enfoques con respecto a la solución de perfusión. La selección abarca desde soluciones celulares como toda la sangre del animal donante o de glóbulos rojos en combinación con plasma humano, a los enfoques acelulares como máquina Universidad de Wisconsin solución, solución IGL, o solución Steen 14-19. La temperatura oscila 4-37 ° C 20. La nomenclatura de hipotermia, subnormothermic y normothermic es muy variables e inconsistentes. Todas las diferentes técnicas, soluciones y configuraciones de temperatura tienen como objetivo 1) condiciones de perfusión estables, 2) de oxigenación suficiente, y 3) el restablecimiento de la función del órgano. Una capacidad de conservación mejorada, así como la capacidad de evaluación y el tratamiento de órganos durante la perfusión normotérmica y subnormothermic se enfrenta a mayor complejidad técnica y los costes en comparación con perfusión hipotérmica 20,21. Hemos desarrollado un sistema de perfusión vivo subnormothermic ex hígado en los últimos 4 años. El sistema se puede utilizar para 1) &quot;recargar&quot; el contenido de energía hepática, 2) para evaluar la calidad del injerto, y para 3) reparar hígados marginales antes del trasplante. El siguiente protocolo contiene toda la información para una perfusión hepática estable.

<table><tbody><tr><td>circuito</td><td>Maquet (Hirrlingen, GER)</td>depósito principal <td>hecho a medida</td><td>(3 L, 3/8" de salida) 
Depósito de pórtico (1,5 L, 1/4", salida) 
bomba centrífuga 
oxigenador 
filtro de licocitos </td></tr><tr><td>Tubos (1/4" x 1/16")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>Tubos (3/8" x 3/32")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>Conectores de tubos</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td></td><td>varios tamaños</td></tr><tr><td>Filtro de diálisis, Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>La solución STEEN</td><td>XVIVO (G&ouml; teborg, SWE)</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Concentrado de ácido para diálisis A</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>Aminoácido, Travasol 10%</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P2256</td><td>1,1 g</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40.000 iU</td></tr><tr><td>Calcio gluconato</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Insulina de acción rápida</td><td>varios proveedores</td><td></td><td>1,000 iU</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>varios proveedores</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

técnica de subnormothermic<em&gt; ex vivo</em&gt; perfusión hepática para el almacenamiento, evaluación y reparación de marginales injertos hepáticos

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

El éxito del trasplante de hígado se ha traducido en una dramática escasez de órganos. En la mayoría de las regiones de trasplante 20-30% de los pacientes en lista de espera para un trasplante de hígado mueren sin recibir un trasplante de órganos o se retiraron por progresión de la enfermedad. Una de las estrategias para aumentar el número de donantes es la utilización de injertos marginales, tales como hígados grasos, los injertos procedentes de donantes mayores, o la donación después de la muerte cardíaca (DCD). La técnica de conservación actual de almacenamiento estático en frío sólo se tolera mal por hígados marginales que resultan en daño a órganos importantes. Además, el almacenamiento de órganos en frío estática no permite la evaluación del injerto o reparación antes del trasplante. Estas deficiencias de conservación estática en frío han provocado un interés en la preservación de órganos perfundidos tibia para reducir la lesión de isquemia fría, evaluar los injertos hepáticos durante la conservación, y explorar la posibilidad de reparar hígados marginales antes del trasplante. Las pres óptimascondiciones seguras y de flujo, temperatura de perfusión, la composición de la solución de perfusión y la necesidad de un portador de oxígeno ha sido controvertida en el pasado. A pesar de los resultados prometedores en diversos estudios en animales, la complejidad y los costes han impedido una aplicación clínica más amplia hasta ahora. Recientemente, con una mejora de la tecnología y una mejor comprensión de la fisiología hepática durante la perfusión ex vivo el resultado del calentamiento de la perfusión hepática ha mejorado y consistentemente buenos resultados se puede lograr. Este artículo le proporcionará información acerca de la recuperación del hígado, las técnicas de almacenamiento, y la perfusión aislada de hígado en cerdos. Vamos a ilustrar a) los requisitos para garantizar un suministro suficiente de oxígeno al órgano, b) las consideraciones técnicas sobre la máquina de perfusión y la solución de perfusión, y c) los aspectos bioquímicos de órganos aislados.

A continuación, se presentan los resultados de 5 experimentos de perfusión con DCD-injertos después de 45 min de calentamiento y la isquemia de 4 h en frío antes del inicio de la subnormothermic perfusión ex vivo. El objetivo principal de una perfusión del hígado ex vivo es asegurar un suministro de oxígeno suficiente para el órgano. La isquemia produce vasoconstricción, aumentando así la resistencia a la perfusión. El logro de los flujos vasculares con constantes presiones estables es un buen indicador de la oxigenación adecuada. Durante un período de inducción de 1-2 h, la solución de perfusión y el órgano se calientan hasta 33 ° C, la cual decesos la resistencia vascular del hígado. Una vez que se alcanza la temperatura objetivo de 33 ° C, los valores de flujo de nivel en un rango constante, casi fisiológico para el resto del tiempo de perfusión 6 hr (Figuras 3A-3D). Al mismo tiempo, el órgano se convierte metabólicamente activo. Figura 4A muestra la pO venosa &lt;sub&gt; 2, un marcador del consumo de oxígeno. Dentro de la 2 hr inicial los venosos pO 2 descensos a una meseta constante. En este estado metabólicamente activo, el hígado comienza a producir bilis (Figura 4B). El dializador proporciona una homeostasis electrolítica equilibrada (Figuras 4C-4D). Un hiperpotasemia inicial se estabilizó rápidamente. Medición de AST en línea sirve como seguimiento de daño hepatocelular. Figura 5 muestra sólo un aumento superficial AST lineal a lo largo de todo el período de perfusión. Tinción H &amp; E después de 6 horas de la perfusión revela necrosis de hepatocitos &lt;5%, con un lobular intacta y estructura sinusoidal (Figura 6). Tinción PAS en el mismo punto de tiempo muestra repone el almacenamiento de glucógeno celular en comparación con el almacenamiento agotado DCD-injertos conservados en frío (Figura 7). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" /> Figura 3. flujos de perfusión y la presión (n = 5, las barras de error muestran la desviación estándar). (A, B) de la arteria hepática (HA) de flujo y presión: Durante la fase de calentamiento en la primera 1-2 horas, el caudal aumenta a presiones estables y es constante después. En cuanto a la presión venosa portal decreciente (C), el aumento del flujo de HA hacia el final de la perfusión puede ser una reacción de autorregulación del hígado. (C, D) La venoso portal (PV) aumenta el flujo correspondiente al flujo durante HA las primeras 2 horas de calentamiento. Las presiones se mantienen relativamente estables. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" /> Figura 4. Parámetros de control (n = 5, las barras de error muestran la desviación estándar). (A) La pO 2 venosa como un marcador de la demanda de oxígeno y la actividad metabólica disminuye dentro de la fase inicial de calentamiento debido a cellula activadometabolismo r; se mantiene estable después (B) La producción de bilis como un marcador de actividad metabólica se inicia a temperaturas alrededor de 30 ° C y, por tanto, entre la primera y la segunda hora de la perfusión (C, D) El dializador asegura la homeostasis del electrolito..; una hiperpotasemia inicial es rápidamente equilibrada. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" /> Figura 5. AST (n = 5, las barras de error muestran la desviación estándar) AST es un marcador sensible de daño hepatocelular.; el aumento superficial sugiere que no hay una lesión importante durante la perfusión ex vivo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" /> Figura 6 H &amp; E tinción (aumento 20X). (A) muestra Sham hígado antes de isquemia caliente, un lóbulo del hígado representante con Architectur intactae. (B) muestra de hígado después de 45 min de isquemia caliente, 4 h de isquemia fría, y 6 hr de la perfusión subnormothermic, la arquitectura lobular está intacto sin necrosis y sólo hinchazón célula mínima, los espacios sinusoidales están ligeramente dilatados en comparación con el muestra simulada.

Injertos marginales, tales como hígados grasos, los injertos procedentes de donantes de edad avanzada, o hígados recuperados después de la muerte cardíaca (DCD) toleran el almacenamiento estático convencional, fría solamente mal. Hemos desarrollado un novedoso modelo de subnormothermic vivo de perfusión ex hígado para su conservación, evaluación y reparación de los injertos hepáticos marginales antes del trasplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

El objetivo de este procedimiento es preservar y evaluar un injerto hepático en condiciones casi fisiológicas. Esto se logra recuperando primero el injerto de hígado de un cerdo donante. En el segundo paso, se canula el hígado y luego se conecta el injerto al circuito de perfusión ex vivo.En el paso final, se controlan las propiedades de perfusión y las características del injerto hepático para determinar el tiempo de perfusión deseado. En última instancia, se utilizan los niveles de aspartato amino transferasa o ST y los análisis histológicos de las biopsias parenquimatosas para mostrar la preservación de la lesión y la viabilidad del injerto hepático. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de preservación existentes, como el llamado almacenamiento estático, es que la preservación en condiciones fisiológicas da como resultado menos lesiones por preservación y permite la evaluación funcional y el tratamiento del injerto antes del trasplante de órgano real.Inmediatamente después de inducir la muerte cardíaca por la administración de cloruro de potasio, recoja 1,6 litros de sangre de un cerdo Yorkshire macho de 30 a 35 kilogramos en bolsas CPDA para cerrar el abdomen, deje el hígado intraabdominal durante 45 minutos para inducir una lesión isquémica caliente inmediatamente antes del final de la isquemia caliente. El tiempo también canula la aorta y la vena porta con líneas de enrojecimiento de los órganos. Utilice la perfusión dual a través de la presión de la aorta y las bolsas impulsadas por la gravedad portal para lavar el hígado con la solución de la Universidad de Wisconsin.A continuación, corta el hígado del cerdo, dejando todos los vasos restantes a largo plazo y colócalo en una bolsa de órganos. Cánula de las partes supra e infrahepáticas de la vena inferior con reductores de media pulgada por tres octavos de pulgada con un bloqueo de señuelo. Cánula la vena porta y la arteria hepática con tres octavos de pulgada por cuarto de pulgada y cuarto de pulgada por tres octavos de pulgada.También se reduce con un bloqueo de señuelo en este momento. Luego cierre la bolsa y almacene el hígado en hielo hasta la perfusión. Para configurar el circuito de perfusión ex vivo, conecte el flujo de salida de un depósito principal a una bomba centrífuga y un oxigenador comercial detrás del oxigenador.Divida el tubo en dos líneas. Conecte una línea a un dializador que drene de nuevo al depósito principal. Conecte la otra línea a un filtro de reducción de leucocitos.Divida la línea después del filtro de reducción de leucocitos en una línea arterial para suministrar perfusión ocho a la arteria hepática y en una línea venosa porta para administrar perfusión ocho a un segundo depósito que drena en la vena porta por gravedad. Pinza el flujo de entrada portal y luego conecte la vía arterial a un asa de espeleología vena que drena hacia el reservorio principal. Para la recolección de líquidos, ajuste la temperatura de inicio del circuito y del baño de agua a 20 grados centígrados.A continuación, cubra el baño con una membrana impermeable para recoger la ascitis o la fuga de la perfusión de ocho. Conecte una línea de succión accionada por una bomba de rodillos al depósito principal. A continuación, suelte la pinza de salida del depósito principal y llene el circuito con la solución de perfusión.Encienda la bomba centrífuga a 1.500 disparos por minuto, asegurándose de que todo el aire salga del circuito. A continuación, abra el suministro de gas al oxigenador. Conectar el hígado al circuito es la parte más complicada del procedimiento.Tenga cuidado de evitar que el tubo se retuerza y de eliminar las burbujas para evitar el impedimento de la salida del hígado. También hay que seguir atentamente el nivel del embalse del portal. Nunca debe quedarse vacío.Retira el hígado del hielo y enjuaga la solución de la Universidad de Wisconsin con solución salina. A continuación, coloque el hígado sobre la membrana sobre el baño de agua. Reduzca la velocidad de la bomba centrífuga a 1000 disparos por minuto y coloque dos pinzas en el lado arterial del asa del espeleólogo de venas.A continuación, corte el tubo entre las abrazaderas y conecte ambos desagües de salida de la vena espeleadora a la línea de la vena espeleadora. Suelte la pinza de la vía arterial. Vierta perfugo ocho en la cánula arterial para deshacerse de las burbujas y conectar la línea a la cánula.Aumente la bomba centrífuga a 1.500 disparos por minuto y suelte la segunda pinza de la línea de la cueva de chapa y suelte la pinza del depósito venoso portal para llenarla. Deje que la solución de perfusión se vierta en la cánula portal y luego conéctela. Teniendo cuidado de mantener estables los niveles de líquido en el depósito portal.Después de conectar el hígado al circuito, eleve la temperatura del baño de agua a 33 grados centígrados durante los próximos 60 minutos. Apunte a un flujo arterial inicial de aproximadamente 250 mililitros por minuto a 40 milímetros de mercurio. Esto puede alcanzar los 700 mililitros por minuto durante la perfusión.Una vez que la presión se incrementa hasta 70 milímetros de mercurio, apunte a un flujo de vena de puerto de 500 a 600 mililitros por minuto a tres a cinco milímetros de mercurio. Después de elevar la temperatura, el flujo venoso del puerto aumentará hasta 1.100 mililitros por minuto. Baje el depósito principal para ajustar el flujo de salida a menos dos miligramos de mercurio para evitar la congestión hepática por obstrucción funcional del flujo de salida, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas en el tubo caval.Ajuste el flujo de diálisis ocho a 500 mililitros por hora. Teniendo cuidado de ajustar el flujo de salida de diálisis para que el PERFUSE eight no se diluya ni se concentre. Mantener un pH bajo durante el inicio de la perfusión para proteger el órgano.Ajustar la presión parcial del dióxido de carbono de forma continua hasta 25 a 30 milímetros de mercurio para que el pH alcance un nivel fisiológico en una hora. Para imitar las condiciones fisiológicas, inyecte continuamente glucosa e insulina en la vena porta. Inyectar cuidadosamente bicarbonato de sodio o potasio en el circuito bajo control repetitivo de sangre, gases y electrolitos, y monitorear la perfusión mediante gasometría venosa y arterial periódica y análisis de ST.Controle el flujo vascular y la presión. Una perfusión estable mantendrá una resistencia vascular constante al final del período de perfusión ex vivo. Llame al sistema de perfusión y luego, después de desconectar el tubo del hígado, enjuague el PERFUSE eight dualmente fuera del hígado con una solución helada de la Universidad de Wisconsin.Finalmente, almacene el hígado en hielo en una bolsa estéril para órganos antes del trasplante. Lograr flujos vasculares constantes con presiones estables es un buen indicador de una oxigenación adecuada. Una vez que se alcanza la temperatura objetivo de 33 grados centígrados, el nivel de valores de flujo en un rango constante, casi fisiológico, durante el resto del período de perfusión, al mismo tiempo que el órgano se vuelve metabólicamente activo.Este gráfico muestra la presión parcial venosa de oxígeno, un marcador del consumo de oxígeno. Dentro de las dos horas iniciales, la presión parcial venosa de oxígeno disminuye a una meseta constante. En este estado metabólicamente activo, el hígado comienza a producir bilis y el dializador proporciona una homeostasis electrolítica equilibrada.La medición en línea del A ST sirve como monitor del daño celular hepático. Por ejemplo, en este experimento, solo se observa un aumento superficial de A ST durante todo el período de perfusión. La tinción de H y E después de seis horas de perfusión revela una necrosis hepatocitaria inferior al 5% con una estructura lobulillar y sinusoidal intacta.La tinción BAS de un hígado perfundido ex vivo en el mismo punto de tiempo demuestra un almacenamiento de glucógeno celular repuesto en comparación con el almacenamiento agotado observado en los injertos de muerte cardíaca de donantes conservados en frío. Después de este procedimiento, se puede realizar un modelo de reperfusión de órganos, como un trasplante de hígado, para estudiar el efecto de la perfusión hepática ex vivo sobre la lesión de reperfusión y la función de los órganos.

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El estudio de la fisiología de los órganos animales se puede lograr mediante la realización de un sistema experimental de perfusión ex vivo. La adición de un riñón porcino, como órgano homeostático a nuestro modelo de perfusión hepática ex vivo desarrollado anteriormente, puede ser un paso principal para lograr un mejor entorno fisiológico.

Pasos para el Experimento de Hígado-Riñón Porcino Perfundido Autólogo Ex vivo

Aquí se presenta un protocolo que describe ex situ oxigenada máquina de perfusión de los injertos de hígado de donantes. Este artículo contiene un paso a paso el protocolo para adquirir y preparar el injerto hepático para la máquina de perfusión, preparar el líquido de perfusión, cebar la máquina de perfusión y realizar oxigenada máquina de perfusión normotérmica del injerto hepático.

Ex Situ Normotérmica máquina de perfusión de hígados de donantes

Se describe un método ex vivo de la máquina de perfusión de injertos de hígado humano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Funcional hígado humano Conservación y Recuperación de Medios de Subnormothermic máquina de perfusión

La grave escasez de órganos ha dado lugar a un mayor uso de los injertos renales marginales para el trasplante. Esto ha provocado el interés en los métodos de almacenamiento alternativos, ya que los injertos marginales especialmente toleran mal almacenamiento en frío. La técnica de la normotérmica ex vivo de perfusión de riñón (NEVKP) representa un método de conservación novedoso para injertos renales antes del trasplante.

Normotérmica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión renal para la Preservación de riñón Injertos antes del trasplante

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

La perfusión con máquina normothermic ex vivo (NEVP) apenas se ha explorado para la preservación de los aloinjertos pancreáticos. Presentamos una técnica innovadora de preservación de aloinjertos pancreáticos antes del trasplante.

Perfusión pancreática normothermic ex vivo para la preservación de los aloinjertos pancreáticos antes del trasplante

El modelo porcino de máquina de perfusión normotérmica hepática (NMP), descrito aquí, se puede utilizar con éxito para estudiar la NMP como estrategia de preservación, una herramienta para la evaluación de la viabilidad y una plataforma para la reparación de órganos. Tiene un alto valor traslacional, sin embargo, es técnicamente desafiante y requiere mucha mano de obra.

Perfusión hepática aislada normomermica porcina

Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.

Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón

Este protocolo describe la metodología para establecer un modelo porcino que utiliza perfusión mecánica (MP) a temperatura variable controlada para la preservación del hígado del donante, seguido de un trasplante hepático ortotópico (OLTx). Su objetivo es promover la tasa de éxito de OLTx utilizando la donación de hígado después de la muerte circulatoria (DCD) de un donante y establecer un modelo estable.

Preservación del hígado de donación porcina después de la muerte circulatoria (DCD) por perfusión y trasplante hepático ortotópico

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de almacenamiento y trasplante de hígado en frío a largo plazo en ardilla terrestre dauriana (DGS), que ha sido técnicamente desafiante en modelos estándar de roedores.

Almacenamiento en frío y trasplante de hígado en ardillas terrestres daurianas adaptables al frío

Aprende la técnica de perfusión hepática subnormotérmica ex vivo para preservar y evaluar injertos hepáticos marginales antes del trasplante. Este método reduce la lesión por preservación y permite la evaluación funcional del órgano.

Técnica de Subnormothermic Ex Vivo Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos (Video) | JoVE Journal

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