Name: Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende el trasplante cardíaco heterotópico en ratones mediante microcirugía. Este método permite estudiar mecanismos de rechazo inmunológico y compatibilidad entre cepas en modelos experimentales.

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Este trabajo fue apoyado por el Health and Medical Research Council Nacional (NHMRC) de Australia Proyecto Subvención 1.029.205, por la Fundación Microsearch de Australia, y por la Fundación de Investigación Médica Myee Codrington.

Antes del comienzo de los experimentos, obtener la aprobación del Comité de Ética del cuidado animal de la institución pertinente para los experimentos planeados. Mantener los ratones en la conformidad con los requisitos de su institución. El siguiente protocolo ha sido aprobado por los comités de la Universidad de Sydney y el Hospital Royal Prince Alfred. Antes de comenzar la cirugía, todos los instrumentos deben limpiarse a fondo y se esterilizaron por inmersión en etanol al 80%. Algunas instituciones estipulan autoclave sin embargo, esto puede dañar los instrumentos de microcirugía finos en el largo plazo. Siempre que sea posible el uso de equipo desechable estéril. 1. Anestesia <ol><li> Anestesie ratón con isoflurano en un recipiente sellado y luego colocarlo en decúbito supino sobre una tabla de funcionamiento, conectando rápidamente cono de la nariz anestésico. Prueba de adecuación de la anestesia pellizcando la pata trasera para asegurar que no hay reflejo. </li><li> Shave la piel con una cuchilla quirúrgica yesterilizar con etanol al 80%. Además, clorhexidina al 2% en 70% de alcohol isopropílico se puede utilizar para la esterilización de la piel. Durante la inducción de la anestesia de la concentración de isoflurano es del 3%, pero reducir esto a 1-1,5% para el mantenimiento. Hacer pequeños ajustes a esta concentración para mantener una respiración regular y la frecuencia cardíaca. Mantenga la temperatura del animal sobre una almohadilla térmica. </li></ol> 2. Operación de donantes <ol><li> Hacer una toracotomía para exponer el corazón y los vasos cortando el pecho a través de ambos lados de la caja torácica desde el borde de costilla hasta la axila seguido de un corte transversal a nivel de la xiphisternum para formar un colgajo de la pared torácica. Levante esta solapa hacia arriba al lado de la cabeza y el pin a la placa operativo. Arranque pericardio para exponer el corazón y los vasos. </li><li> Levante la vena cava inferior con unas pinzas en una mano y con la otra inyectar 1 ml frío proximal salina heparinizada al corazón a través de la vena cava inferior, a continuación, poner una abrazadera de las arterias pequeñas en el IVC para prevenciónt flujo de la solución de perfusión a través del agujero de la aguja. </li><li> El uso de una gasa y un bastoncillo de algodón, retraiga el corazón hacia abajo para exponer la aorta ascendente y la arteria pulmonar. Pasar una hoja de un par de microtijeras a través del canal (seno transverso) posterior al haz de la aorta y la arteria pulmonar y cortar la aorta y la arteria pulmonar juntos hasta distalmente como sea posible para asegurar una longitud suficiente para la anastomosis. </li><li> Empate y dividir el IVC, la vena cava superior derecha (SVC), izquierda SVC y las venas pulmonares utilizando hilo de seda 6-0. Ate el IVC y derecha SVC separado y luego coloque un solo hilo posterior al corazón para rodear el SVC izquierda junto a las venas pulmonares y atarlo. Coseche el corazón de la zona donante mediante la reducción de los vasos distales a los lazos, a continuación, guárdelo en una solución salina estéril en frío a 4 º C hasta el trasplante. Esto da lugar a la muerte del donante por desangrado. </li></ol> 3. Operación Receptor <ol><li> Se anestesia ladestinatario que el anterior (sección 1). Afeitarse con cuidado el abdomen para evitar la irritación, a continuación, hacer una laparotomía por línea media incisión desde el pubis al xiphisternum y retraer el uso de clips de papel doblado para formar retractores. Envuelva el intestino en caliente salina empapado gasa estéril y se retraen a la parte superior derecha del abdomen. </li><li> Para exponer la aorta infra-renal y la vena cava inferior, liberar los segmentos de paquetes de aorta y vena cava inferior de la arteria renal izquierda y la vena a la bifurcación ilíaca dividiendo ellos de los vasos lumbares utilizando un dispositivo de cauterio. Tenga cuidado de que el cauterio esté a la temperatura correcta y se utiliza durante un tiempo suficiente para dividir y sellar los extremos de los vasos. </li><li> Aplicar pequeñas pinzas atraumáticas vasos a la aorta y segmentos IVC distal y proximal. Hacer una incisión en la pared frontal de la aorta por primera perforación de un agujero con una aguja 30 G; luego se corta una incisión vertical con micro tijeras para que coincida con el tamaño de la aorta de donantes. Enjuague el lumen de la aorta con solución salina heparinizada para eliminar cualquier blcoágulos ood. </li><li> Traiga el corazón del donante a la zona receptora cubierto con una gasa empapada en solución salina fría y colóquela en el lado derecho del abdomen. Asegúrese de que la aorta del donante se coloca al lado de la incisión en la aorta receptor y la arteria pulmonar del donante posicionado al lado del receptor IVC. </li><li> Anastomosan el lado de extremo a extremo de la aorta del donante a la aorta destinatario utilizando corriendo 10-0 de nylon partir de la esquina y la sutura proximal a lo largo del lado izquierdo primero, hasta llegar a la esquina distal, en cuya etapa el animal se gira 180 °. Mover suavemente el corazón del donante hacia el lado izquierdo del abdomen para exponer el lado derecho de la aorta y continuar la sutura a través del lado derecho de la pared aórtica desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Antes de cerrar la anastomosis aórtica, lave suavemente el lumen con solución salina heparinizada para eliminar cualquier coágulo y aire. </li><li> Anastomosis de la arteria pulmonar del donante (PA) de extremo a lado con el destinatario IVC. Hacer una incisión verticamente con microtijeras en la pared frontal de la VCI en un sitio de conformidad con la anastomosis de la arteria. Anastomosan el donante PA para el destinatario IVC con el funcionamiento de suturas de nylon 10-0 a partir de el extremo distal de la pared de la izquierda dentro del lumen de la vena cava inferior. Después de alcanzar el extremo proximal, continuar suturas a lo largo de la pared lateral delantera derecha hasta el extremo distal para completar la anastomosis. Antes de cerrar la anastomosis, lave suavemente la luz para eliminar cualquier coágulo y aire. </li><li> Antes de liberar el buque, abrazaderas colocar piezas de Gelfoam alrededor de los sitios de anastomosis, y aplique una presión suave con un aplicador de algodón hasta conseguir la hemostasia. En el momento de la revascularización, liberar la pinza distal primero, seguido por la mordaza proximal. </li><li> Tras la revascularización, aplique una solución salina caliente a 37 ° C para el injerto de forma externa para ayudar a su recuperación. El injerto por lo general comienza auricular inmediatamente y vuelve espontáneamente a ritmo sinusal dentro de unos pocos minutos. Inyectar 0,6 ml de abrigopor vía subcutánea de solución salina para mantener la hidratación del destinatario. Inyectar por vía subcutánea buprenorfina para la analgesia antes de la finalización de la cirugía </li><li> Cierre la herida abdominal con una sutura continua absorbible 5-0 para ambas capas. Comience por completar la capa interna y continuará a lo largo de la piel. </li></ol> 4. Recuperación y Monitoreo de injerto <ol><li> Inyectar la ampicilina para la profilaxis de la infección y colocar el receptor sobre una almohadilla de calentamiento a 37 ° C durante la recuperación. La mayoría de los animales se recuperan rápidamente y por lo general están bebiendo y comiendo a menudo menos de 3 horas. Si el ratón muestra signos de sufrimiento, examinar de cerca para determinar la causa. Si hay una causa obvia, el tratamiento con buprenorfina y vigilar de cerca. Consulte a un veterinario si los síntomas son severos o persisten más de 8 horas y considerar la eutanasia. Si es necesario, dar continuo 12 inyecciones por hora de buprenorfina hasta que los síntomas desaparezcan. Si el ratón muestra signos de sufrimiento después de 8 horas, que sigan siendo 12inyecciones por hora de buprenorfina hasta que los que resuelven. Consulte con el veterinario si los síntomas continúan por más de 48 horas y la eutanasia si es necesario. </li><li> Monitorear injerto latido del corazón mediante palpación abdominal directa y registrar la fuerza de latido como + + + + para un injerto sano a + para tiempo débil debido al rechazo avanzada y - como no golpes debido a completar el rechazo del injerto. Monitorear los ratones diariamente durante los primeros 10 días, a continuación 3 veces por semana durante la duración del experimento. </li></ol>

<ol><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+but+not+transforming+growth+factor-beta+is+essential+for+generation+and+suppressor+function+of+regulatory+cells+induced+by+intratracheal+delivery+of+alloantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen.</a> Transplantation. 79, 568-576 (2005).</li>
<li>Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+granzyme+A+and+perforin+in+mouse+heart+transplants+immunosuppressed+with+donor-specific+transfusion+and+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 61, 625-629 (1996).</li>
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<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).</li>
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<li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-gp39+interactions+play+a+critical+role+during+allograft+rejection.+Suppression+of+allograft+rejection+by+blockade+of+the+CD40-gp39+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway.</a> Transplantation. 61, 4-9 (1996).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).</li>
<li>Callaghan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+allograft+survival+by+inhibitory+FcgammaRIIb+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling.</a> J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).</li>
<li>Qian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+donor+MHC+Class+I+or+Class+II+antigen+deficiency+on+first-+and+second-set+rejection+of+mouse+heart+or+liver+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts.</a> Immunology. 88, 124-129 (1996).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+acceptance+of+mouse+kidney+allografts+is+associated+with+increased+Foxp3+expression+and+differences+in+the+B+and+T+cell+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments.</a> Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Heart Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Mottram, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+monitoring+of+cardiac+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice.</a> Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Ratón trasplante de corazón es un método microquirúrgico difícil que requiere considerable habilidad quirúrgica de dominar. El aspecto más difícil es el pequeño diámetro de los vasos. Además, es necesario limitar el tiempo de funcionamiento destinatario y sangrado. La técnica para el trasplante de corazón de ratón fue descrita por primera vez por Corry et al. en 1973 y posteriormente por Mottram et al 12. Nuestros modificaciones incluyen los siguientes puntos. En primer lugar, la perfusión i...

Los modelos animales de trasplante de órganos pueden proporcionar información valiosa para mejorar el tratamiento de los pacientes con trasplante clínico. Los modelos de ratón son particularmente útiles para estudiar el mecanismo inmunológico de rechazo de trasplante de órgano o aceptación debido a la amplia gama de ratones y reactivos específicos para los ratones que no están disponibles para otros modelos animales 1-3 modificados genéticamente. Uno de los retos con los modelos de ratón de trasplante es el pequeño tamaño de los donantes y los receptores que requiere considerable habilidad técnica para lograr resultados satisfactorios. Una técnica fue descrita por primera vez para el trasplante heterotópico de corazón en ratas 4 que fue adaptado posteriormente para el trasplante de corazón de ratón por Corry et al 5. Esta técnica implicó la preparación del receptor antes de la operación de donante y sin perfusión del corazón del donante, ambos de los cuales son susceptibles de comprometer la supervivencia del corazón o t trasplantadoél recibe. El procedimiento ha sido ampliamente utilizado como se describe originalmente para examinar los mecanismos de rechazo de trasplante y la tolerancia 6-8. Otros han adaptado el procedimiento de trasplante de corazón originales de rata de Ono y Lindsey para trasplantes de corazón en ratones 9,10. Más recientemente, se publicó una técnica para el ratón trasplante de corazón que se sobrepuso a algunos de los problemas asociados con el método de Corry et al 11. El protocolo descrito aquí incorpora nuestras modificaciones, basados ​​en el método de Mottram et al 12, que incluyen: en la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría inmediatamente después de la toracotomía y la realización de la operación de donantes antes de la operación destinatario para minimizar el tiempo de operación de receptor. Además, utilizamos pequeñas pinzas atraumáticas vasos en lugar de 6-0 corbatas de seda. Aunque las abrazaderas de los vasos tienen la desventaja de tener más espacio que son más fáciles de controlar que los lazos, que no debe ser demasiado apretado o sueltoy son menos fáciles de eliminar que abrazaderas. Nuestro método utiliza una única sutura continua para la anastomosis recipiente, aunque en el aprendizaje inicial etapas de una alternativa es usar suturas de sujeción en los extremos proximal y distal esquinas para garantizar la uniformidad de las suturas y de este modo la permeabilidad de la anastomosis.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de operación&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Suiza</td><td>M651</td><td>Máquina anestésica de aumento de 10-25X</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia</td><td>Vett3</td><td>Capaz de suministrar una mezcla de isoflurano y oxígeno en el aire&nbsp;</td></tr><tr><td>Tablero de operaciones&nbsp;</td><td>Ferretería o proveedor</td><td></td><td>de oficina Corcho denso o sintético capaz de tomar alfileres</td></tr><tr><td>Solución salina heparinizada (5 U/ml, 4 & deg; C)</td> <td>Pfizer, EE. UU</td>. <td>FW25</td><td>En jeringa de 1 ml con aguja de 23 G en hielo</td></tr><tr><td>Solución salina normal (37 &deg; C)</td><td>AstraZeneca Pty Ltd, Australia</td><td>4538</td><td>En jeringa de 1 ml con aguja de 23 G en almohadilla tibia</td></tr><tr><td>Suturas 10- nylon, 5-0 Vicryl</td><td>Ethicon, Inc. NJ, USA</td><td>2870G/J421H</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,05 mg/kg en solución salina de 0,1 ml)</td><td>Reckitt Benckiser, Sydney, Australia</td><td></td><td>En jeringa de 1 ml con aguja de 23 G en hielo</td></tr><tr><td>Ampcillina (5 mg/kg en solución salina de 0,1 ml)</td><td>Álamo, Sydney, Australia</td><td></td><td>En jeringa de 1 ml con aguja de 23 G en hielo</td></tr><tr><td>Gel Foam</td><td>Pharmacia & Upjohn Co. EE. UU.</td><td>801289304</td><td>Cortado en trozos pequeños</td></tr><tr><td>Dispositivo de cauterización de alta temperatura</td><td>Medtronic, EE. UU</td>. <td>8444000</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica / Temperatura correcta</td><td>Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Instrumentos de microcirugía: < / fuerte></td><td>Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microneedleholders</td><td>Shanghai, China</td><td>WT2020</td><td></td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>Micropinzas WT1020</td><td></td></tr><tr><td>(punta recta)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Micropinzas (punta curva)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3020</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para micromosquitos (1 par)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40350</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas atraumáticas de microvasos (1 par)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40130/W40150</td><td></td></tr></tbody></table>

un método modificado para heterotópico ratón corazón trasplante

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Los ratones a menudo se utilizan como donantes de trasplante de corazón y de los beneficiarios en los estudios de la inmunología del trasplante debido a la amplia gama de ratones transgénicos y reactivos disponibles. Una dificultad se presenta debido al pequeño tamaño del animal y los desafíos técnicos considerables de la microcirugía involucrados en el trasplante de corazón. En particular, una alta tasa de fallo técnico poco después del trasplante puede ser consecuencia de la muerte del receptor y las complicaciones postoperatorias tales como parálisis de las extremidades posteriores o un corazón no late. Aquí, la técnica completa para un trasplante cardíaco heterotópico ratón se demuestra, que implica la recolección del corazón del donante y su posterior implante en un ratón receptor. El corazón del donante se cosecha inmediatamente después de la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría y transección de la aorta ascendente y la arteria pulmonar. La operación de receptor implica la preparación de la aorta abdominal y la vena cava inferior (VCI), seguido poranastomosis de extremo a lado de la aorta del donante con la aorta destinatario utilizando un solo funcionamiento 10-0 microsutura y una anastomosis similar de la arteria pulmonar del donante con el receptor IVC. Después de la operación el animal se inyecta con 0,6 ml por vía subcutánea con solución salina normal y se le permite recuperarse de una almohadilla térmica 37 ° C. Los resultados de 227 trasplantes de corazón de ratón se resumen con una tasa de éxito a las 48 h de 86,8%. De los 13,2% de fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores, 10 (4,4%) tenían un corazón sin latir debido a injertar lesiones y / o trombosis isquémica, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 horas .

Después de un periodo de formación inicial, se analizaron 227 casos de ratón heterotópico trasplante de corazón en nuestro grupo. La tasa de éxito dentro de la primera 24 horas fue del 90,3% y a las 48 horas era 86,8%. De los 30 (13,2%) los fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores y tuvo que ser sacrificado, 10 (4,4%) tenía un corazón sin latir debido a la lesión de isquemia del injerto y / o trombosis, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 horas. Algunas...

Se demuestra una técnica para el procedimiento microquirúrgico para el trasplante heterotópico de corazones en ratones, incluyendo métodos simplificados para la recolección de donantes y la anastomosis de los vasos receptores.

Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

El objetivo general de este procedimiento es trasplantar un corazón desde un donante hasta un ratón receptor. Esto se logra primero extrayendo el corazón de la cavidad torácica del donante y almacenándolo en solución salina fría. Los siguientes pasos consisten en trasplantar el corazón al abdomen del receptor y luego monitorear los latidos del corazón trasplantado.Finalmente, el rechazo del trasplante se confirma mediante inspección visual y análisis patológico. En última instancia, los resultados muestran que los corazones trasplantados entre cepas no relacionadas de ratones son rechazados, mientras que los corazones trasplantados entre la misma cepa son aceptados. La demostración en video a largo plazo de esta medición es fundamental, ya que los pasos microquirúrgicos son difíciles de aprender debido al tamaño muy pequeño de los animales donantes y receptores.El complicado procedimiento quirúrgico implicado y la necesidad de aumentar la precisión y la velocidad al realizar las operaciones en los receptores hacen que siempre sea fundamental asegurarse de que todos los instrumentos se limpien y esterilicen completamente en un baño de etanol al 80 %. Es muy recomendable el uso de equipos estériles desechables. Después de anestesiar al ratón donante en una cámara de isoflurano, colóquelo en posición supina sobre la mesa de operaciones.Luego conecte rápidamente el cono nasal, administrando el anestésico. Asegúrese de probar la calidad de la anestesia con una compresión en la pata trasera. Si no hay respuesta de retirada, comience a afeitar la piel utilizando una hoja quirúrgica.Luego, esterilice la piel con tres pasadas alternas de clorhexidina al 2% en alcohol isopropílico al 70% durante toda la cirugía. Monitoree visualmente la respiración y el latido cardíaco del animal. Ajuste la administración de isoflurano en consecuencia.Comience realizando una toracotomía para exponer el corazón y los vasos, abriendo el tórax por ambos lados de la caja torácica. Corte desde el borde de las costillas hacia la axila y en sentido transversal al nivel del esternón xifoides. Esto crea un colgajo de la pared torácica.Fije el colgajo abierto al tablero de operaciones cerca de la cabeza. Luego, retire el pericardio alrededor del corazón. Levante la vena cava inferior con pinzas y administre un mililitro de solución salina fría heparinizada a la VCI próxima al corazón.Luego, sujete una pinza arterial pequeña a la VCI para evitar que la solución fluya de regreso a través del orificio de la aguja con gasa y un aplicador de algodón. Mueva el corazón hacia abajo para exponer la aorta y la arteria pulmonar. El seno transverso es el canal situado posterior al haz de la aorta y la arteria pulmonar.A continuación, corte la aorta y la arteria pulmonar lo más distal posible para maximizar la longitud de los vasos para la anastomosis. Ahora divida la vena cava inferior, la vena cava superior derecha, la vena cava superior izquierda y las venas pulmonares. Cada una debe ligarse por separado utilizando hilo de seda 6.0.Primero, ligue la VCI y la VCS derecha. Luego, ligue la VCS izquierda y las venas pulmonares. Ahora, retire el corazón cortando todos los vasos distales a los ligamentos.Guarde el corazón en solución salina fría y estéril a cuatro grados Celsius hasta el trasplante. Después de preparar el animal para la cirugía como se describió para el donante, comience realizando una laparotomía. Corte a lo largo de la línea media desde el pubis hasta el esternón xifoides.Utilizando clips doblados en forma de retráctores. Abrir el abdomen, envolver las vísceras en gasa empapada con solución salina tibia y retraerlas hacia la parte superior derecha del abdomen. A continuación, exponer la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (IVC) entre la bifurcación ilíaca y la arteria y vena renales izquierdas.Suelte el segmento empacado de aorta y VCI. Luego, seccione la aorta y la VCI de los vasos lumbares con un dispositivo de cauterización calibrado. Aplique pequeños pinzas atraumáticas a los extremos proximal y distal del segmento de aorta y VCI liberado.Con una aguja de calibre 30, haga un orificio en la pared anterior de la aorta desde el corte vertical, creando un orificio del tamaño de la aorta del donante. Aproveche esta oportunidad para eliminar cualquier coágulo sanguíneo del lumen de la aorta mediante un enjuague con solución salina heparinizada. Ahora introduzca el corazón del donante en solución salina fría.Coloque el corazón donante junto a la incisión en la aorta del receptor. Coloque la arteria pulmonar donante junto a la VCI del receptor utilizando suturas de nylon continuas de 10 oh. Anastomose las aortas de extremo a lado.Comience en la esquina proximal y sutúre a lo largo del lado izquierdo hasta la esquina distal. Luego, gire al animal 180 grados. A continuación, mueva el corazón hacia un lado y continúe con las suturas a través del lado derecho de la pared aórtica, de distal a proximal.Antes de cerrar la anastomosis, enjuague suavemente la luz con solución salina con heparina para eliminar coágulos y aire. Luego, termine la sutura. A continuación, realice una incisión vertical en la pared anterior de la VCI donde se realizará la anastomosis con la arteria pulmonar.En segundo lugar, utilice 10 puntos continuos para la anastomosis. Comience los vasos en el extremo distal de la pared izquierda dentro de la luz de la VCI en el extremo proximal. Continúe a lo largo de la pared frontal derecha y sutúre hasta el extremo distal nuevamente.Dé un buen lavado al lumen antes de completar la anastomosis. A continuación, coloque trozos de espuma de gel alrededor de la anastomosis. La hemostasia se logra mediante presión suave con aplicadores de algodón.Para revascularizar al receptor. Libere primero el clamp distal y luego el clamp proximal. Durante la operación del receptor, es fundamental optimizar la precisión y la velocidad de la cirugía.Por lo tanto, el tiempo de pinzamiento cruzado debe ser idealmente inferior a 30 minutos. Para favorecer la recuperación, aplique solución salina tibia a 37 grados Celsius en el sitio del injerto. La fibrilación debe ser inmediata y revertir espontáneamente al ritmo sinusal en cuestión de minutos.Antes de cerrar el sitio quirúrgico, se debe administrar una inyección de buprenorfina por vía intramuscular. Finalice la operación cerrando la herida con un punto continuo absorbible cinco cero para todas las capas del tejido. Después de cerrar la herida quirúrgica, inyecte al animal receptor ampicilina y una inyección subcutánea de 0,6 mililitros de solución salina.Para ayudar a la hidratación, coloque el animal sobre una placa calefactora ajustada a 37 grados Celsius hasta que recupere la conciencia. La mayoría de los animales beben e incluso comen dentro de las tres horas posteriores a la cirugía. Si después de ocho horas el ratón aún muestra signos de malestar, administre inyecciones de buprenorfina cada 12 horas hasta que los síntomas desaparezcan.Si el ratón permanece en estado de malestar durante más de 48 horas, comuníquese con un veterinario durante los primeros 10 días posteriores a la cirugía. Monitoree directamente el latido del injerto mediante palpación abdominal. Registre diariamente la intensidad del latido, desde cuatro más para un injerto saludable hasta uno más para un latido débil debido a un rechazo avanzado.Registre un injerto sin latidos como negativo debido al rechazo completo del injerto después de 10 días. Continúe monitoreando el pulso del corazón injertado tres veces por semana. Tras 227 trasplantes heterotópicos de corazón, el 90,3 % tuvieron éxito durante 24 horas y el 86,8 % tuvieron éxito durante 48 horas. El fracaso incluyó parálisis de las extremidades posteriores, un corazón sin latidos debido al injerto, lesión isquémica y/o trombosis; los sobrevivientes del injerto fueron catalogados.La causa del fracaso del trasplante cardíaco se estableció mediante patología. El análisis del corazón trasplantado, marcado aquí con una flecha, indicó que la trombosis y la infarto del tejido cardíaco fueron la causa del fracaso de este corazón injertado en la combinación de cepas C57 Black Six como donante y receptor; en este caso, ningún corazón fue rechazado y los corazones trasplantados sobrevivieron más de 100 días. En este caso, el corazón se había reducido ligeramente de tamaño debido a la atrofia muscular secundaria a su estado no sostenible para la vida.En contraste, en la combinación de cepas con rechazo de donante DBA dos a receptor C 57 Black seis, este corazón trasplantado había dejado de latir para el día siete y mostraba evidencia de rechazo a los 100 días. El mismo corazón estaba completamente fibrotizado y encogido una vez analizado. Esta técnica puede realizarse en 90 millones o menos si se lleva a cabo adecuadamente, y no olvide que trabajar con gas de óxido nitroso puede ser extremadamente peligroso.El uso de un sistema de captación de gases anestésicos está ampliamente disponible.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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