RNAscope para In situ Detección de transcripcionalmente activo Virus del Papiloma Humano en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la detección sensible y específica del ARNm de alto riesgo de HPVE seis, E siete en células tumorales en cánceres de cabeza y cuello mediante el uso de una nueva técnica de hibridación in situ de ARN llamada alcance de ARN. Esto se logra mediante un primer pretratamiento, las muestras de tejido en los portaobjetos con calor y proteasa para permear las células y permitir el acceso a la sonda. Como segundo paso, incube los portaobjetos con un cóctel de sondas de VPH dirigido a siete tipos de VPH de alto riesgo, que se hibrida a E seis E siete ARNm.

A continuación, amplifique las señales de hibridación hibridándolas secuencialmente con el amplificador preamplificador y la sonda de etiqueta conjugada HRP. A continuación, la señal se detecta con un cromógeno y se visualiza bajo los resultados de la microscopía de campo claro estándar que muestran las señales de HPVE seis E siete mRNA como precipitantes marrones punteados en los tumores VPH positivos, pero no en los tumores VPH negativos. El ensayo de alcance RRA utiliza una estrategia de diseño de sonda novedosa y patentada para la hibridación de insectos.

Permite la visualización de una sola molécula y la cuantificación de objetivos. Esta tecnología allana el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de biomarcadores y el desarrollo de ácidos de diagnóstico identifiquen y validen cualquier biomarcador de ARN descubierto a través de estudios de macroraza o secuenciación de próxima generación. La mayoría de los científicos con experiencia previa en IHQ o en cada uno de ellos pueden aprender este método rápidamente.

Ahora te daré una demostración de todo el flujo de trabajo, destacando los pasos clave para ayudarte a dominar la técnica. Las muestras de tejido a ensayar mediante esta técnica de hibridación in situ de ARN son formales y fijas. Secciones incrustadas en parafina de cinco más o menos una micra de espesor montadas en portaobjetos una hora antes del ensayo.

Hornee los portaobjetos en un horno seco a 60 grados centígrados mientras se hornean. Prepara el horno de hibridación. Lleve la temperatura a 40 grados centígrados y coloque un papel humidificador en la bandeja de control de humedad.

Añade 50 mililitros de agua destilada al papel humidificador para humedecerlo por completo. Inserte la bandeja tapada en el horno para precalentarla durante al menos 30 minutos antes de usarla. Prepare 700 mililitros de una solución de pretratamiento diluyendo 10 soluciones de pretratamiento en agua destilada.

Calentar la solución de uno x pretratar dos hasta que hierva y mantener la temperatura entre 100 y 104 grados centígrados. Al mismo tiempo que evita que hierva demasiado. Haga tres litros de un tampón de lavado diluyendo 50 tampones de lavado precalentados en agua destilada debajo de una campana extractora.

Prepare los xilenos, 70%etanol y 100%etanol para la finalización y deshidratación. Prepare una solución de tinción con hematina al 50 % y agua con amoníaco al 0,01 % o reactivo azulado para la tinción posterior. Precaliente las sondas objetivo a 40 grados centígrados durante 10 minutos.

Lleve todos los reactivos del kit de detección de RTU, excepto el cromógeno DAB, marrón A y marrón B, a temperatura ambiente. Para comenzar este ensayo, prepare las secciones de tejido horneado en xileno dos veces durante cinco minutos, cada vez con agitación frecuente. Deshidratar en etanol al 100% dos veces durante tres minutos cada una con agitación frecuente.

Seque al aire durante cinco minutos y luego dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la sección de tejido con el lápiz de barrera hidrofóbica. Inicie el pretratamiento de las secciones de tejido incubándolas con una solución de pretratamiento durante 10 minutos a temperatura ambiente. Esto apagará la actividad de la peroxidasa endógena.

Enjuague con agua destilada. A continuación, recupere el ARN incubando las secciones de tejido durante 15 minutos con pretratamiento, dos soluciones mantenidas a temperatura de ebullición después de 15 minutos, enjuague dos veces en agua destilada para la digestión de proteínas. Tratar las secciones de tejido con una solución pre-treat three e incubar en el horno de hibridación a 40 grados centígrados durante 30 minutos.

Cuando termine la incubación de 30 minutos, enjuague las secciones de tejido dos veces en agua destilada. El siguiente paso es la hibridación de la sonda diana utilizando un conjunto de sondas que detectan el ARNm E six E seven de siete genotipos de VPH de alto riesgo HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 y 58. Agregue las sondas de HPV, la sonda de ubiquitina C y la sonda del gen bacteriano DAP B por separado en tres secciones de tejido adyacentes.

Hibridar a 40 grados centígrados en el horno durante dos horas al final de las dos horas de incubación. Enjuague las secciones de tejido en el tampón de lavado dos veces durante dos minutos, cada vez a temperatura ambiente para amplificar la señal. Comience incubando secciones de tejido con el preamplificador AMP one durante 30 minutos a 40 grados centígrados en el horno de hibridación.

Enjuague dos veces en tampón de lavado durante dos minutos cada vez a temperatura ambiente. Los pasos posteriores para la amplificación de la señal implican la incubación de las secciones de tejido con los siguientes reactivos a 40 grados Celsius durante el tiempo indicado con dos enjuagues en tampón de lavado a temperatura ambiente. Después de cada incubación, amplíe dos reductores de fondo durante 15 minutos.

Amplificador AMP tres durante 30 minutos y sonda etiquetada AMP cuatro durante 15 minutos. A continuación, incube las secciones de tejido con amp five durante 30 minutos a temperatura ambiente después de los dos enjuagues en tampón de lavado, incube con amp six durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos enjuagues más en tampón de lavado. Para la detección de señales, haga una mezcla de DAB uno a uno mezclando volúmenes iguales de marrón A y marrón B. Agregue la solución a los portaobjetos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Enjuague dos veces con agua destilada. Teña las secciones de tejido con una solución de toína al 50% de hemat durante dos minutos a temperatura ambiente y luego enjuaga con agua destilada hasta que los portaobjetos estén transparentes y queden los tejidos. La inmersión púrpura se desliza en agua con amoníaco al 0,01% cinco veces, seguida de cinco inmersiones, y el agua destilada deshidrata las secciones de tejido incubándolas durante dos minutos cada una en etanol al 70%, etanol al 100% y etanol al 100%, seguidas de xileno durante cinco minutos.

Por último, monte los portaobjetos con medios de montaje a base de xileno que se muestran a continuación: aquí hay imágenes de ejemplo de secciones incrustadas en parafina, formales y fijas teñidas de Sonoma de células escamosas de cabeza y cuello. En el caso positivo para el VPH, las sondas HR HPV detectaron fuertes señales punteadas específicamente en las células tumorales. Esto se visualiza claramente en el recuadro con un aumento de 40x.

La sonda UBC de control positivo detectó numerosas señales citoplasmáticas punteadas tanto en las células tumorales como en las células estromales. Mientras que la sonda DAP B de control negativo demostró un fondo limpio en el caso negativo del VPH, tanto la sonda HR HPV como la sonda DAP B no detectaron señales, la sonda UBC detectó señales fuertes. La puntuación para la determinación del estado del VPH implica examinar las tres láminas de cada caso.

Se utiliza el nivel de tinción en el portaobjetos de DAP B de control negativo, ya que la positividad del VPH de corte se define por la presencia de tinción punteada, citoplasmática y/o nuclear por encima de la señal en el portaobjetos DAP B. El ensayo de alcance de ARN se puede completar en ocho horas si se realiza correctamente mientras se realiza el ensayo. Es fundamental agregar una cantidad suficiente de solución para cubrir toda el área de tejido en cada paso.

También es importante eliminar cualquier tampón residual moviendo las diapositivas entre pasos, pero manteniendo las diapositivas blancas. La tecnología de retelescopio se puede aplicar para la detección de prácticamente cualquier biomarcador de ARN en cualquier célula o tejido de cualquier especie.