Name: Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a realizar grabaciones yuxtacelulares en ratas alertas para estudiar la actividad neuronal en estructuras subcorticales. Este método permite aislar unidades individuales y localizarlas anatómicamente con precisión.

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Estamos agradecidos a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención MT-5877), a los Institutos Nacionales de Salud (subvención NS058668 y NS066664), y a la Fundación Binacional Israelí-EE.UU. (subvención 2003222) por financiar estos estudios.

Los protocolos experimentales se realizaron en ratas Long Evans hembras (250-350 g) de acuerdo con las directrices de cuidado y uso de animales prescritos por el gobierno federal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Diego. 1. Acclimating la Rata a cuerpo de sujeción NOTA: Coloque la rata en una dieta restringida. Alimentar a la rata una vez al día inmediatamente después de cada sesión de manejo diario para aclimatarse a la rata para el sistema de retención (descrito a continuación). Proporcionar suficiente de alimentación para mantener al animal en 80% de su peso inicial. Esta cantidad es de aproximadamente 6 gramos de alimento por día para un 250 g mujeres de largo Evans rata. <ol><li> Aclimatarse a la rata a ser manipulado por los seres humanos. Frenar suavemente la rata a mano por períodos de aproximadamente 5 segundos cada 30 segundos. Haga esto durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos. Monitorear las ratas diariamente para detectar signos de estrés durante el período de formación. Los signos incluyen luchando in respuesta a la moderación, la vocalización, y diente-parloteo. </li><li> En el día 3 rd, coloque la rata en un cuerpo que restringe su calcetín de tela (Figura 1) durante 15 minutos al día durante dos días consecutivos. </li><li> En el 5º día, coloque la rata dentro del calcetín, y colocar el calcetín dentro de un tubo rígido en la plantilla experimental (Figura 4). Deja la rata en el tubo durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos. </li><li> Alimentar a la rata inmediatamente después de cada sesión de entrenamiento. Al final de la última sesión (día 6) dar acceso sin restricciones a los alimentos. Seleccione para su implantación sólo aquellas ratas que no muestran signos de estrés excesivo en el último día de entrenamiento. NOTA: Aunque la selección de las ratas para la implantación es subjetiva, en nuestras manos más del 90% de las ratas se encontró que ser sensible a la habituación y capaz de someterse a la implantación. </li></ol> 2. Implantación del Mecanismo de Cámara Grabación y reposacabezas <ol><li> Hacer una realambre Conferencia soldando alambre de acero inoxidable desnudo a un conector pin. Corte el cable de manera que 5.3 mm restos descubiertos por el pasador. Autoclave el cable de referencia, junto con todas las herramientas quirúrgicas. </li><li> Administrar ketamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de ketamina se mezcla con 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal. La dosis inicial tiene una duración de 1 ½ a 2 horas. Complementar la anestesia cada 30-45 min a partir de entonces, según sea necesario. Lubricar los ojos del animal con una pomada oftálmica. </li><li> Compruebe el reflejo de retirada del dedo del pie para determinar el plano de la anestesia, y mantener la anestesia según sea necesario. </li><li> Coloque la rata en un marco de soporte estereotáxica con barras de oído (Figura 3A). Afeitarse el pelo en la cabeza y la desinfección de la zona de la herida con povidona-yodo (solución al 10%). Tenga cuidado de insertar las barras de oído adecuadamente de modo que no dañen el tímpano. Barras de oído con puntas romas son preferibles. </li><li> Hacer una incisión con un bisturí aproxidamente a lo largo de la línea media del cráneo desde el nivel rostro-caudal de los ojos a la parte posterior de las orejas. Utilice unas tijeras para cortar y retirar una tira de 2-3 mm de piel en cada lado de la incisión. </li><li> Raspe el periostio para exponer la superficie del cráneo a los rebordes laterales. Cubra el cráneo expuesta con fina capa de pegamento. </li><li> Perforar un agujero pequeño, con un diámetro ligeramente menor que 0-80 tornillos, usando un taladro rebabas ½ mm de diámetro (véase la sección de Materiales). Perforar el agujero inmediatamente posterior a bregma, donde la sutura se encuentra con el canto lateral, y en un ángulo de 30-45 ° en el cráneo, de modo que el tornillo puede entrar con la parte superior más lateral de la parte inferior. </li><li> Enrosque un tornillo 0-80 máquina de fondo plano al agujero (aproximadamente 3 vueltas), en 30 a 45 ° de ángulo. Tenga cuidado de no enroscar demasiado profundamente para evitar dañar el tejido cerebral subyacente. </li><li> Repita este procedimiento para 6 tornillos adicionales en la configuración que se muestran <strong&gt; (Figura 3B). Aplicar pegamento a la base de todos los tornillos. </li><li> Coloque una aguja de la jeringa en el manipulador stereotax. Mida desde la sutura bregma, y ​​hacer un hueco en el cráneo con la aguja cerca, pero fuera de la ubicación craneotomía deseada, como una marca de referencia. NOTA: En esta demostración, las coordenadas estereotáxica de la marca son 3 mm posterior y 1 mm lateral a la sutura bregma. </li><li> Marque la abolladura con un marcador permanente. Tenga en cuenta las coordenadas estereotáxica de la marca, ya que servirá como punto de referencia estereotáxica (Figura 3B). </li><li> Hacer una craneotomía centrado en las coordenadas deseadas (3 mm posterior y 3 mm lateral al bregma en este ejemplo). Deje la duramadre intacta. Cubrir la craneotomía con líquido cefalorraquídeo artificial modificada (NaCl 125 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM de MgCl 2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Cortar un tubo de 0,2 ml centrífuga para 4 - 5 mm de longitud, y le cortó la tapa. Se coloca el tubo en el cráneo y centrarlo sobre la craneotomía. </li><li> Aplique el cemento dental alrededor de la parte inferior del tubo para sellar la base del tubo en el cráneo. Tenga cuidado de no tener fugas de cemento en la craneotomía expuesto (Figura 3D). </li><li> Perforar otro agujero pequeño (alrededor de ½ mm de diámetro) en la placa craneal contralateral e inserte con cuidado el cable de referencia. Construir el cable de referencia por la soldadura de un pasador que se conecta con el amplificador de grabación para el extremo del alambre (ver sección Equipment). No mueva el cable de referencia una vez que está en el cerebro, ya que esto puede causar daños. </li><li> Aplicar pegamento en el agujero en el que se insertó el alambre. Esto sellará el pasador y el cable en su lugar temporalmente. </li><li> Mezclar las dos partes del kit de gel de silicona (véase la sección de Materiales) en porciones aproximadamente iguales. Espere dos minutos para mezclar y fill el tubo de centrífuga aproximadamente ⅓ completo con gel. </li><li> Acople una abrazadera posterior ángulo recto (véase la sección de Materiales) de la barra de reposacabezas. Coloque la placa de cabeza (Figura 2A) a la barra de retención (Figura 2B) en un ángulo de 45 ° de tono de modo que la parte inferior de la placa es hacia la nariz del animal. Es útil usar un inclinómetro para ajustar el ángulo de paso para que coincida con la de la plantilla experimental (Figura 4). </li><li> Coloque la barra de sujeción al brazo manipulador stereotax para que la barra es paralela a las barras de oído. Bajar la barra y la placa de modo que la placa es posterior de la sutura lambda y anterior a la caudal más-tornillo. </li><li> Sujete la cabeza del perno delantero (un perno o tornillo 8-32, véase la sección de Materiales) a unos 45 ° ángulo con un brazo manos ayudar y abrazadera, de manera que la cabeza del tornillo quede hacia abajo y hacia la cola del animal. Baje el tornillo de modo que toque la hormigaerior 0-80 tornillos (Figura 3F, G). </li><li> Asegure el perno y la placa en su lugar con acrílico dental. Aplicar acrílico dental alrededor de las cabezas de los tornillos de hueso, el pasador de referencia, y alrededor de los lados del tubo de centrífuga. Espere aproximadamente 10 min para el acrílico dental se seque (Figura 3H). </li><li> Aplicar una capa de cemento dental alrededor de los bordes del acrílico dental, consolidando la piel para el implante. Espere a que el cemento se seque. </li><li> Meter varios agujeros en la tapa del tubo de centrífuga, y colocar el tapón en el tubo. </li><li> Retire la abrazadera manos ayudando. A continuación, retire con cuidado la barra de la cabeza de retención de la stereotax, y luego retire la placa de la cabeza de la barra (Figura 3I). </li><li> Quite el animal del stereotax y administrar cuidados postoperatorios y de seguimiento de conformidad con todas las reglas, reglamentos y leyes (por ejemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, cada 8 a 12 horas durante un mínimo de 24hr). Si la inflamación se desarrolla alrededor de los bordes del implante, aplicar una capa fina de pomada antibiótica al sitio afectado diariamente hasta que se resuelva. </li></ol> 3. Monitoreo Juxtacellular de unidades neuronales <ol><li> Tire tubo capilar de cuarzo en una micropipeta láser de dióxido de carbono extractor (ver sección Equipment) con diámetros de punta de menos de 1 m (Figura 5A). Nota: Los parámetros de calentamiento variarán de acuerdo con el instrumento en particular, y que el diámetro del cuello requerida variará dependiendo de la estructura del cerebro de interés. Para grabaciones en el tálamo de ratas, micropipetas tienen cuellos que van de 5-7 mm. </li><li> Asegure la pipeta en el lugar bajo un contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopio equipado con objetivos de larga distancia de trabajo. Use plastilina para sostener la pipeta en su lugar en el escenario del microscopio. </li><li> Lentamente mueva un bloque de vidrio (0,5 a 1 cm de espesor; un pedazo de vidrio utilizado para making cuchillos ultra-micrótomo es conveniente) en el campo de visión con la punta de pipeta. Utilizando el micromanipulador etapa, toque suavemente la punta de la pipeta para el cristal, haciendo que se rompa. Repita según sea necesario hasta que el diámetro exterior de la punta de pipeta está entre 1-3 micras (Figura 5B, C). Asegúrese de que estas micropipetas tienen impedancias entre aproximadamente 5-15 MΩ. </li><li> Preparar solución salina extracelular (NaCl 135 mM, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) 8 y añadir 2% (w / v) Chicago Sky Azul. Usando una jeringa con una aguja de 30 G o menor, llenar el extremo posterior de la pipeta con la solución. Alternativamente, para el etiquetado juxtacellular sola célula añadir 2% (w / v) Neurobiotin o amina dextrano biotinilado (BDA-3000 o BDA-10000) a la solución salina en lugar de Chicago Sky Azul. </li><li> Coloque la rata dentro del calcetín de tela en el interior del tubo rígido en una plantilla experimental apropiado ( <strong&gt; Figura 4) .Wait un mínimo de 72 horas después de la cirugía antes de colocar el animal en el montaje de reposacabezas. Apretar el cordón alrededor de la parte superior del esternón, en lugar del cuello, para evitar la obstrucción de la vía aérea. Si la respiración parece ser dificultosa u obstruida, afloje el cordón o moverlo posterior. Llevar a cabo este procedimiento mientras la rata está alerta. </li><li> Fije la placa frontal de restricción en la rata a la pieza correspondiente en la plantilla. Para ello, en primer pin de la placa reposacabezas en su lugar y, a continuación, fijarlo con un tornillo 4-40. Asegúrese de esperar hasta que el animal está tranquilo con el fin de evitar la aplicación de un par excesivo a la cabeza. Luego, coloque una tuerca de 8-32 en el perno de cabeza de restricción que se implanta en la rata. Luego atornille en una varilla de acero inoxidable roscado al perno en la cabeza. Colocar la varilla a la plantilla experimental de tal manera (Figura 4) que se puede apretar en su lugar. NOTA: Asegurar el animal con la cabeza del perno, así como el reposacabezas placa minducir al mínimo la flexión del aparato y mejora la estabilidad de la grabación. En la mayoría de los casos la grabación puede comenzar en el primer día del animal es el jefe-restringido. Sin embargo, si el animal se mueve nerviosamente en exceso o vocaliza, proporcionar un día de entrenamiento habituación reposacabezas antes de comenzar las grabaciones. En este caso, dejar al animal en la plantilla durante 15 minutos y luego se coloca de nuevo en su jaula. Repita este paso el día siguiente y continuar con el protocolo. </li><li> Abra la cámara de grabación y quitar el gel de silicona. Limpie la craneotomía utilizando unas pinzas finas si el tejido ha vuelto a crecer en la craneotomía. </li><li> Coloque la pipeta para el micromanipulador motorizado, y conecte el preamplificador cabezal de la platina. NOTA: En el presente manifestación, un circuito de relé pequeño en el cabezal de la platina se utiliza para cambiar entre los hilos conductores del amplificador y una fuente de corriente externa con alto cumplimiento (Figura 6A-C). Tenga en cuenta que algunos amplificadores tienen un adecuado incorporado fuente de alto cumplimiento(Ver Discusión y Materiales secciones). </li><li> Utilice el micromanipulador motorizado para mover la punta de la pipeta a la marca estereotáxicamente identificado en la cámara de grabación. Tenga en cuenta las coordenadas de la ubicación. Tenga cuidado de no romper la punta de la pipeta sobre el cráneo. </li><li> Mueva la pipeta a la ubicación de grabación que desee en los ejes antero-posterior y medio-lateral. Entonces avanzar la pipeta ventralmente a través de la dura hasta que es de aproximadamente 500 micras dorsal a la ubicación de grabación. </li><li> Avance lentamente la pipeta mientras escucha para clavar eventos en un monitor de audio de la tensión amplificada registrado entre la punta de la pipeta y el cable de referencia. Una vez identificados los eventos Rematar, continúan moviendo la pipeta 0-100 micras hasta deflexiones positivas tensión va mayores que se observan alrededor de 500 mV. NOTA: La resistencia del electrodo se incrementará en un factor de aproximadamente 1,5-10 when esta se produce. </li><li> Comienza la grabación una vez una unidad ha sido aislado como de acuerdo al paso 3.11, junto con todas las demás medidas conductuales y fisiológicos de interés. En la presente manifestación, movimientos Vibrisas autogenerados son monitoreados con la videografía de alta velocidad (véase la sección de Materiales). </li><li> Para etiquetar el sitio de registro, cambiar el electrodo lleva a conectarse a la fuente de corriente. Hay varias maneras de hacer esto, ya sea utilizando un circuito de relé (Figura 6 A - C), un sistema incorporado en la fuente de corriente en el amplificador, o manualmente (Figura 6D, consulte el paso 3.8 y Discusión). Pase -4 mu con 2 pulsos por segundo bajo ciclo de trabajo del 50% durante 4 minutos para inyectar iontoforéticamente Chicago Sky azul a través de la pipeta. </li><li> Matar y perfundir el animal después de varios procedimientos de etiquetado según la práctica estándar. Sección del cerebro y de contraste si es necesario para identificar la localización anatómica de la grabación sentarsee. Contratinción el tejido para la reactividad citocromo oxidasa como por 14. Por otra parte, identificar los depósitos de Chicago Sky azul usando microscopía de fluorescencia. NOTA: Para diferenciar con precisión entre diferentes unidades marcadas es importante que todas las etiquetas están fabricadas con la misma pipeta en el mismo día, sin el desamarre la pipeta entre las etiquetas. En este caso, los sitios de grabación pueden ser diferenciados por su ubicación relativa en la histología post-hoc junto con las coordenadas del manipulador notables de cada sitio (véase el paso 3.9). Para la identificación inequívoca, marque las etiquetas de al menos 200 micras separados unos de otros, y no más de 3-5 etiquetas por región del cerebro. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Construcción de la plantilla experimental La descripción de las partes mecánicas utilizadas para construir la plantilla experimental (Figura 4) se omite en el protocolo, ya que se puede construir en una variedad de maneras. En esta norma demostración se utilizan optomecánico partes y las abrazaderas de soporte para montar la barra de reposacabezas y el tubo de sujeción del cuerpo (véase la sección de Materiales). Partes opto-me...

Supervisión de la actividad neuronal en un animal de alerta participando activamente en una tarea de comportamiento es crítica para la comprensión de la función y la organización del sistema nervioso. Registro extracelular de la actividad eléctrica de las unidades neuronales individuales ha sido durante mucho tiempo una herramienta básica de la neurociencia de sistemas y es todavía ampliamente en uso en la actualidad. Una variedad de tipos de electrodos y configuraciones están disponibles en función de las exigencias científicas y técnicas de un experimento particular. Crónicamente implantados microdrives o conjuntos de electrodos se utilizan a menudo en animales con libertad de movimientos, incluyendo aves, roedores y primates no humanos 1.4. Alternativamente, las penetraciones agudos con microelectrodos de metal o de vidrio a través de un micromanipulador externa se utilizan a menudo para grabar a partir de animales anestesiados o cabeza-restringido. Electrodos de micropipeta de vidrio tienen la ventaja de que pueden ser utilizados en el juxtacellular o &quot;célula unidos&quot; configuración para aislar de manera inequívoca laactividad de las neuronas individuales sin las complicaciones de pico post-hoc de clasificación 5. Estos electrodos permitan, además, la grabación a partir de células o lugares anatómicamente identificadas, ya que pueden ser utilizados para inyectar pequeños depósitos de tinte o neuroanatómicas trazadores, o incluso para llenar el individuo célula registrada. Esta configuración se ha aplicado con éxito en ratas, ratones y aves 10.6. La técnica descrita actualmente centra en el seguimiento juxtacellular y los depósitos de tinte extracelular en alerta, ratas cabeza-restringido. Tenga en cuenta que una sola célula a diferencia de juxtacellular llena, estos depósitos de tinte no proporcionan información sobre la morfología celular o proyecciones axonales 11, pero permitirá la localización anatómica exacta a aproximadamente 50 micras y, críticamente, tienen un rendimiento significativamente mayor en los animales de alerta. La información relativa a una sola célula juxtacellular llena, sin embargo, se proporciona como una estrategia alternativa para el etiquetado anatómica. En resumen, elprotocolo consta de tres fases principales. En la primera fase, la rata se aclimataron a la restricción del cuerpo en un calcetín de tela (Figura 1) durante un período de 6 días. En la segunda fase, un aparato de apoyacabezas (Figura 2) y la cámara de grabación se implantan quirúrgicamente de tal manera que la rata se puede mantener en el plano estereotáxico durante múltiples sesiones de grabación posteriores (Figura 3); este procedimiento permite al experimentador de centrarse en las regiones subcorticales del cerebro para el estudio electrofisiológico basado en referencia estándar coordina 12. La tercera fase consiste en la colocación de la rata en una plantilla adecuada para la realización de los experimentos de comportamiento y electrofisiológicos (Figura 4), ​​la construcción del electrodo de un tubo capilar de cuarzo (Figura 5), por lo que las grabaciones neuronales juxtacellular que sin ambigüedades aíslan unidades individuales 6-9, y marcando los locati anatómicasen el sitio de la grabación con Chicago Sky colorante azul (Figuras 6 y 7). Las grabaciones se realizaron con monitorización simultánea de comportamiento; sin embargo, los detalles técnicos de la conducta dependerán de los objetivos científicos de cada experimento y por lo tanto más allá del alcance de un solo protocolo. Después de la terminación del procedimiento experimental, que se puede repetir en varios días, el animal es sacrificado. El cerebro se extrae y se procesa de acuerdo con las técnicas neuroanatómicas estándar utilizando cualquiera de campo claro o microscopía de fluorescencia.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamina HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (solución de xilacina)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidona Yodada)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cianoacrilato</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Cemento de agarre polvo</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Para la base de la cámara de grabación Líquido de</td></tr><tr><td>cemento de agarre</td><td>Dentsply Intl 675572</td><td></td><td>Para la base de la cámara de grabación</td></tr><tr><td>Gel de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet polvo acrílico de reparación de dentaduras postizas</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Para asegurar el aparato de reposacabezas al cráneo</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Resina acrílica ortodóntica de curado rápido líquido</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Para la fijación del aparato de reposacabezas al cráneo</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Para la perfusión y la fijación de tejidos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Para perfusión y fijación de tejidos</td></tr><tr><td>Citocromo C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Para la tinción de citocromo-oxidasa, <fuerte>Figura 7</fuerte></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Para la tinción de citocromo-oxidasa, <fuerte>Figura 7</calcetín > rata fuerte</td></tr> <tr><td></td><td>Cosido elegante (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, <fuerte>Figuras 1, 4</fuerte></td></tr><tr><td>tubo de PVC 2 y frac12; "</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>Figura 4</td></tr><tr><td>Subminiatura D pines y enchufes</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figure 3Alambre musical de</td></tr> <tr><td>acero inoxidable de 0,010" de diámetro</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic holding</td><td>frame Kopf Instruments</td><td>modelo 900</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic</td><td>ears bars Kopf Instruments</td><td>modelo 957</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Manipulador estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>modelo 960</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>y frac12; fresa mm</td> Henry <td>Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Quiet-Air fresa dental</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable 0-80 & frac18; &rdquo; tornillo</td><td>Sujetador superstore</td><td>247438</td><td>Figura 3</fuerte></td></tr><tr><td>0,2 ml tubo de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figura 3</fuerte></td></tr><tr><td>Barra de sujeción de cabeza personalizada</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, <fuerte>Figuras 2 - 4</fuerte></td></tr><tr><td>Placa de sujeción de cabeza personalizada</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, <fuerte>Figuras 2 - 4</fuerte></td></tr> <tr><td>post-abrazadera de ángulo recto</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td><fuerte>Figuras 3, 4</fuerte>; Las piezas optomecánicas estándar para la plantilla experimental (<fuerte>Figura 4</fuerte>) también son de Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 y frac34; &rdquo; tornillo</td><td>Sujetador Superstore 240181</td><td></td><td>Para reposacabezas, <fuerte>Figura 3</fuerte></td></tr><tr><td>4-40 y frac14; &rdquo; tornillo</td><td>Sujetador Superstore 239958</td><td></td><td>Para reposacabezas, <fuerte>Figuras 3, 4</fuerte></td></tr><tr><td>Tubo capilar de cuarzo</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td><fuerte>Figura 5</fuerte></td></tr><tr><td>Extractor láser de dióxido de carbono</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de microelectrodos</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Etapa de cabeza del amplificador de microelectrodos</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Estimulador de impulsos aislado</td><td>A-M Systems</td><td>Modelo 2100</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Monitor de audio</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Partes alternativas: ver Discussion, Figura 6A</fuerte></td></tr><tr><td>Cable conductor del electrodo</td><td>Alambre Cooner</td><td>NEF34-1646</td> <td>(opcional), <fuerte>Figura 6D</fuerte></td></tr><tr><td>Relé para la etapa de cabeza del amplificador</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(Opcional) Se utiliza con una placa de circuito impreso hecha a medida (UCSD Physics Electronics Shop), <fuerte>Figura 6A-C</fuerte></td></tr><tr><td>cámara de video digital</td><td>Basler</td><td>A602fm</td><td>(opcional) Para el monitoreo del comportamiento, <fuerte>Figura 7</fuerte></td></tr><tr><td>ungüento veterinario Puralube</td><td>Amazon.com, Inc NC0138063</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de alerta, ratas head-restringido

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Existe una variedad de técnicas para monitorear la actividad extracelular de unidades neuronales individuales. Sin embargo, el seguimiento de esta actividad desde las estructuras cerebrales profundas de los animales que se comportan sigue siendo un reto técnico, especialmente si las estructuras deben dirigirse estereotáxicamente. Este protocolo describe técnicas quirúrgicas y electrofisiológicas convenientes que mantienen la cabeza del animal en el plano estereotáxico y aíslan sin ambigüedades la actividad de pico de neuronas individuales. El protocolo combina la sujeción de la cabeza de los roedores en alerta, la monitorización yuxtacelular con electrodos de micropipeta y la inyección de colorante iontoforético para identificar la ubicación de las neuronas en la histología post-hoc. Si bien cada una de estas técnicas está bien establecida en sí misma, el protocolo se centra en los detalles de su uso combinado en un solo experimento. Estas técnicas neurofisiológicas y neuroanatómicas se combinan con la monitorización conductual. En el presente ejemplo, las técnicas combinadas se utilizan para determinar cómo los movimientos de vibrisa autogenerados se codifican en la actividad de las neuronas dentro del tálamo somatosensorial. En términos más generales, es sencillo adaptar este protocolo para monitorear la actividad neuronal junto con una variedad de tareas conductuales en ratas, ratones y otros animales. De manera crítica, la combinación de estos métodos permite al experimentador relacionar directamente las señales neurofisiológicas identificadas anatómicamente con el comportamiento.

<html> Unidades neuronal en ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar la fase de movimiento Vibrisas durante auto-generado batiendo 15,16. La Figura 7A muestra la actividad de la muestra spiking de una unidad de talámico VPM como una rata se batiendo activamente. La Figura 7B muestra un histograma de la espiga veces alineados a la fase instantánea de movimiento Vibrisas 17. Hay más espigas durante la fase de retracción de batir. Después de la grabación, la ubi...

Este protocolo describe el diseño y la implantación quirúrgica de un mecanismo de restricción de la cabeza para monitorear la actividad neuronal en las estructuras cerebrales subcorticales en ratas alerta. Delinea procedimientos para aislar neuronas individuales en la configuración yuxtacelular e identificar eficientemente sus ubicaciones anatómicas.

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear y localizar la actividad de neuronas individuales dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de ratas despiertas con la cabeza inmovilizada. Esto se logra primero acostumbrando a la rata a la restricción corporal dentro de una media de tela. El segundo paso consiste en implantar quirúrgicamente un dispositivo de fijación craneal y una cámara de registro, de manera que la rata pueda mantenerse en el plano estereotáxico durante múltiples sesiones de registro posteriores.A continuación, se coloca la rata en un dispositivo adecuado para realizar los experimentos conductuales y electrofisiológicos, y se llevan a cabo grabaciones neuronales juxtacelulares. Este proceso permite el aislamiento inequívoco de unidades individuales. El paso final consiste en marcar la ubicación anatómica del sitio de grabación con el colorante Chicago Sky blue para que pueda visualizarse en la histología post hoc.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos comúnmente utilizados, como el registro extracelular con microelectrodos metálicos, es que los potenciales de acción de unidades individuales pueden aislarse sin ambigüedad y que el sitio de registro puede revelarse mediante histología post hoc. Para comenzar este procedimiento, anestesie al animal mediante una inyección de ketamina y xilacina. Verifique el reflejo de retirada del dedo del pie para determinar el nivel de anestesia y mantenga la anestesia mediante administraciones adicionales de anestésico.Si es necesario, afeite la cabeza y desinfecte el sitio quirúrgico con yodo de povidona. A continuación, coloque la rata en un marco estereotáxico y asegure su cabeza con barras auriculares. Haga una incisión con un bisturí a lo largo de la línea media del cráneo, desde el punto medio entre los ojos hasta la parte posterior de las orejas.Luego, retire una tira de piel de dos a tres milímetros de ambos lados de la incisión. Raspe el periostio para exponer el cráneo hasta las crestas laterales. Posteriormente, cubra el cráneo expuesto con una capa delgada de pegamento instantáneo.A continuación, taladre un pequeño orificio inmediatamente posterior al punto donde la sutura bgma se encuentra con la cresta lateral, con un ángulo de 30 a 45 grados hacia el cráneo. Luego, enrosque un tornillo máquina de fondo plano cero 80. Enrosque el tornillo en el orificio con un ángulo de 30 a 45 grados, y tenga cuidado de no enroscarlo demasiado profundamente para evitar dañar el tejido cerebral subyacente.Repita este procedimiento para otros seis tornillos en esta configuración. Después de eso, aplique pegamento instantáneo en la base de todos los tornillos. Ahora coloque la aguja de la jeringa en el manipulador estéreo táctil.Realice una pequeña depresión en el cráneo con la aguja para marcar una ubicación de referencia adecuada. Luego marque la depresión con un rotulador permanente. Posteriormente, realice una craneotomía centrada en la coordenada deseada y deje intacta la duramadre.Cubra la craneotomía con líquido cefalorraquídeo artificial modificado. A continuación, corte un tubo centrífugo de 0,2 mililitros en un segmento de cuatro a cinco milímetros de longitud y corte la tapa. Coloque el tubo sobre el cráneo y colóquelo centrado sobre la craneotomía.Luego, aplique cemento dental alrededor de la base del tubo para sellar su extremo inferior al cráneo. Tenga cuidado de no derramar cemento dentro de la craneotomía expuesta. Ahora, perfore otro orificio pequeño en la placa craneal contralateral.Inserte cuidadosamente el alambre de referencia que ha sido soldado a un conector de pasador. A continuación, aplique pegamento instantáneo en el orificio en el que se insertó el alambre para mantener fijos el pasador y el alambre. Luego mezcle las dos partes del kit de gel de silicona en porciones iguales.Espere dos minutos y llene el tubo de centrífuga con gel. Cuando esté aproximadamente hasta un tercio de su capacidad, fije la placa superior a la barra de sujeción del cabezal. En este caso, la barra se ha fijado a una pinza de poste en ángulo recto con un ángulo de inclinación de 45 grados.Posteriormente, sujete la barra de sujeción al brazo del manipulador estéreo tax usando la abrazadera de poste de manera que la barra quede paralela a las barras auriculares; baje la barra y la placa para que esta última quede posterior a la sutura lambda y anterior al tornillo coddle mos. A continuación, sujete el perno frontal de la cabeza con una abrazadera formando aproximadamente un ángulo de 45 grados, de modo que la cabeza del tornillo quede orientada hacia abajo y en dirección a la cola del animal. Después, baje el tornillo hasta que haga contacto con el cráneo.A continuación, sujete el tornillo y la placa en su lugar con acrílico dental. Aplique una capa de cemento dental alrededor de los bordes del acrílico dental para fijar la piel al implante. Una vez que el cemento se haya secado, haga varios orificios en la tapa del tubo centrífugo y coloque la tapa sobre el tubo.Ahora retire la abrazadera. Retire cuidadosamente la barra de sujeción del estereotáctico. Luego retire la placa craneal de la barra.Al final, retire al animal del estereotáctico y administre cuidados y monitoreo postoperatorios. En este procedimiento, use una pipeta polo con tubo capilar de cuarzo sobre un láser de dióxido de carbono para la elaboración de micropipetas. A continuación, asegure la pipeta en su lugar bajo un microscopio de contraste por interferencia diferencial equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo.Mueva lentamente un bloque de vidrio al campo de visión con la punta de una pipeta. Utilizando el micromanipulador del portaobjetos, rompa la punta de la pipeta tocándola suavemente con el vidrio. Repita el procedimiento hasta la punta de la pipeta.El diámetro externo está entre uno y tres micrómetros. A continuación, prepare la salina extracelular y agregue 2% de Chicago sky blue. Utilizando una jeringa con una aguja de calibre 30, llene el extremo posterior de la pipeta con una solución.Luego coloque la rata en el calcetín de tela y transfiera el calcetín de tela a un tubo rígido en un soporte experimental adecuado. Sujete la placa de inmovilización de la cabeza de la rata a la pieza correspondiente del soporte. A continuación, coloque una tuerca de 8 32 en el perno de inmovilización de la cabeza que está implantado en la rata.Posteriormente, enrosque una varilla roscada de acero inoxidable al perno de cabeza. Después, abra la cámara de registro y retire el gel de silicona. Limpie la craneotomía utilizando pinzas finas.Si el tejido ha vuelto a crecer en la craneotomía, utilice anestesia con isoflurano durante este proceso si es necesario. A continuación, fije la pipeta al micromanipulador motorizado. Desplace la pipeta hasta la ubicación deseada para la grabación en los ejes anterior, posterior y medial lateral.Luego, avance el pipeta ventralmente a través de la dura hasta que se encuentre aproximadamente a 500 micrómetros dorsal de la ubicación prevista para la grabación. Avance lentamente la pipeta mientras escucha eventos de potenciales de acción en un monitor de audio del voltaje amplificado registrado. Una vez identificados los eventos de potenciales de acción, continúe moviendo la pipeta entre cero y 100 micrómetros hasta que las desviaciones de voltaje positivas sean mayores de aproximadamente 500 microvoltios.Para etiquetar el sitio de grabación, ajuste la fuente de corriente a cuatro microamperios negativos con pulsos de dos segundos al 50 % de ciclo de trabajo y aplique la corriente durante cuatro minutos para iontoforesis, inyectando azul Chicago sky a través de la pipeta. Después del experimento, realice la perfusión del animal según la práctica estándar. Luego seccione el cerebro y contratiña según sea necesario para identificar la ubicación anatómica del sitio de grabación mostrado.Aquí se muestra la actividad de disparo de una unidad talámica VPM mientras una rata está moviendo activamente sus vibrisas. Aquí hay un histograma de los tiempos de disparo alineados con la fase instantánea del movimiento de vibración. Hay más disparos durante la fase de retracción del movimiento de las vibrisas.Después de la grabación, la ubicación de esta unidad se marcó mediante aforésis del colorante Chicago sky blue. Como se muestra aquí, el tejido se contratiñó para revelar la actividad de citocromo oxidasa y evidenciar los límites neuroanatómicos del tálamo VPM. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar técnicas quirúrgicas y electrofisiológicas que mantengan la cabeza del animal en el plano estereotáxico y que aíslen sin ambigüedades la actividad de disparo de neuronas individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El seguimiento de los niveles de neurotransmisores extracelular en las regiones cerebrales distintas de animales libres de movimiento además de informaciones sobre el vínculo entre la liberación de neurotransmisores y la conducta. Microdiálisis in vivo, junto con detección electroquímica ofrece anatómica excelente y la resolución de químicos, así como información sobre cómo la neurotransmisión basal se ve alterada por las manipulaciones farmacológicas o fisiológicas.

La cirugía estereotáxica de supervivencia en los roedores

Grabaciones extracelular de la actividad neuronal mediante sondas de silicio en la rata anestesiada se describen. Esta técnica permite obtener información a través de múltiples áreas cerebrales de más de 100 neuronas simultáneamente. Proporciona información con una resolución única célula sobre la dinámica de conjuntos neuronales en varios circuitos locales.

Grabación a gran escala conjuntos neuronales con sondas de silicona en la rata anestesiada

Este video muestra el procedimiento detallado para preparar a una rata anestesiada para registros electrofisiológicos de la actividad cerebral desde múltiples sitios. Se disecciona el cuero cabelludo para acceder al cráneo y se perforan agujeros en lugares precisos para instalar y asegurar los electrodos. A continuación, se insertan electrodos de microhilo de tungsteno en la ubicación objetivo para registrar los datos.

Registros electrofisiológicos in vivo de actividades cerebrales de múltiples sitios en ratas

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Fuente: Moore, J. D., et al. Monitoreo yuxtacelular y localización de neuronas individuales dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de ratas alertas, con la cabeza restringida. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra el método de registro y tinción yuxtacelular en una rata despierta y restringida. El procedimiento consiste en registrar las señales de las neuronas e inyectar un tinte para localizar con precisión el sitio de grabación. Esta técnica permite un mapeo preciso de la...

Registro yuxtacelular y tinción para un mapeo preciso de la actividad neuronal en una rata despierta 

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La...

Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Para entender la estructura de las redes neuronales, la caracterización morfológica y funcional de las neuronas individuales es una necesidad. Aquí, nos demuestran etiquetado juxtasomal biocitina, la cual permite que los registros electrofisiológicos en la configuración extracelular, aún mantiene la capacidad de etiquetar de forma intracelular de la neurona para la reconstrucción post hoc de dendríticas y la arquitectura axonal.

Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

Este método crea un entorno tangible, familiar para el ratón para navegar y explorar durante microscópicas de imágenes o una sola célula de registros electrofisiológicos, los cuales requieren una fijación firme de la cabeza del animal.

Plataforma levantado-Air-plana con piso: un nuevo método para combinar Comportamiento con Microscopía o Electrofisiología en Awake moviéndose libremente Roedores

En este estudio, se presenta la metodología sobre cómo realizar registros electrofisiológicos in vivo en múltiples sitios a partir de la vía hiperdirecta bajo anestesia con uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Las áreas sensoriales primarias en el neocórtex exhiben actividades espontáneas únicas durante el desarrollo. Este artículo describe cómo visualizar las actividades neuronales individuales y las áreas sensoriales primarias para analizar las actividades sincrónicas específicas del área en ratones neonatos in vivo.

Visualización in vivo de la actividad espontánea en la corteza sensorial del ratón neonatal con una resolución de una sola neurona

Aprende a realizar grabaciones yuxtacelulares en ratas alertas para estudiar la actividad neuronal en estructuras subcorticales. Este método permite aislar unidades individuales y localizarlas anatómicamente con precisión.

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido (Video) | JoVE Journal

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido

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