Name: Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: Aprende a utilizar una plataforma de estiramiento anisotrópico para estudiar respuestas celulares a deformaciones mecánicas complejas en células C2C12 y tejidos aórticos de ratón. Esta técnica avanza la comprensión de la biomecánica celular y tisular.

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DT fue apoyado por una beca postdoctoral del Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Tecnologías (FQRNT) y un Elevate Estratégico Fellowship MITACS. CMC fue apoyado por una beca postdoctoral de Le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) y el Ernest y Margaret Ford cardiología dotado beca de investigación de la Universidad de Ottawa Heart Institute. EOB fue apoyada por subvenciones de funcionamiento MOP80204 del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) y T6335 de la Heart and Stroke Foundation de Ontario. El CIHR y Medtronic proporcionan colectivamente EOB con una Cátedra de investigación revisada por pares (URC # 57093). AEP es financiada por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) Descubrimiento Grant, un Suplemento NSERC Discovery Accelerator y agradecidamente reconoce el apoyo de las Cátedras de Investigación de Canadá programa (CRC) y el Premio Investigador Temprana de la Provincia de Ontario.

1. Deformación mecánica de las células individuales <ol><li> La fabricación de un sustrato PDMS con bolas fluorescentes incrustados Antes de la fabricación del sustrato, microesferas fluorescentes en solución de agua se vuelven a suspender en isopropanol para mejorar la mezcla del grano en el PDMS debido a su naturaleza hidrofóbica. <ol><li> Pipetear 500 l de microesferas fluorescentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.200 xg durante 10 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y añadir 500 l de isopropanol siguieron con 5 min de vórtice. Ponga el vial a un lado toda la noche en la oscuridad con el fin de permitir que cualquier partícula grande de agregados al sedimento. </li><li> A la mañana siguiente, retire con cuidado el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio. Esta solución de bolas se puede utilizar para fabricar más de 5 sustratos. NOTA: La solución del grano seguirá sedimentar durante los próximos 3 días. Tenga cuidado de evitar resuspensión del sedimento. </li><li> Vierta 0,5 g del agente de curado proporcionadocon el kit de PDMS en un vial de microcentrífuga de 1,5 ml usando un equilibrio científica. Por etapas sucesivas, añadir un total de 90 l de bolas (seis en 15 mu l adiciones), vortex durante 1 min entre cada adición. Ponga a un lado. </li><li> Pesar 10 g de PDMS y se mezcla durante al menos 12 min con la 0,5 g del agente de curado suplementado con perlas fluorescentes. </li><li> Fabrique un molde en forma de cruz SU-8 2050 usando técnicas de fotolitografía estándar siguiendo las instrucciones del fabricante. El molde utilizado tiene una altura de 320 micras y un área de 13,4 cm 2 (Figura 3). El molde puede contener 428 l ó 440 mg de PDMS. </li><li> Vierta 400 mg de los PDMS con cuentas en el molde en forma de cruz con una pipeta de transferencia y curar durante 2 horas a 80 ° C. Después del curado, retire el sustrato del molde (Figura 5). El sustrato se puede mantener en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 2 semanas sin mostrar cambios significativos en sus propiedades mecánicas. </li&gt; <li> Vierta gotitas de PDMS (agente de curado: PDMS con una relación de 01:20) en una placa de Petri con un tamaño final de aproximadamente 4 mm de diámetro y curar boca abajo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de anclaje se pueden mantener en una placa de Petri para la semana. NOTA: Mantener el plato boca abajo para evitar que las gotas de aplanamiento durante el proceso de curado. </li><li> Tratamiento de aire de plasma (30 seg a 30 W) el sustrato y 8 funciones de anclaje. Enlazar las características en cada extremo del sustrato a una distancia de 4 mm del guión de forma cuadrada presentes en el sustrato (Figura 5C). </li></ol></li><li> Montaje de la membrana de las abrazaderas <ol><li> Envuelva cada extremo del sustrato alrededor de la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas y seguro en su lugar con los tornillos de fijación 2 de la parte superior (Figura 2B y las figuras 5D-E). </li><li> Atornille las 4 abrazaderas en el soporte de sujeción y vierta PDMS (relación 01:20) usando un t desechableRANSFERENCIA pipeta en la interfase entre el sustrato y la parte cilíndrica ranurada de las abrazaderas. Corre el PDMS sin curar alrededor de la parte cilíndrica ranurada utilizando una llave hexagonal de 1,5 mm. </li><li> Vierta PDMS (1:20) en las ranuras hasta que esté completamente llena por acción capilar y curar el conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F). </li></ol></li><li> La siembra de células en la membrana <ol><li> Tratamiento de aire-plasma (30 segundos a 30 W) todo el conjunto para esterilizar y funcionalizar el sustrato para permitir que para el revestimiento de colágeno. </li><li> Funcionalizar el área del sustrato donde las células se sembraron con 1 ml de ácido acético 0,02 M suplementado con 16 g / ml de colágeno de cola de rata a temperatura ambiente durante 1 h. La densidad de colágeno final deseado es 5 g / cm 2. </li><li> Enjuagar el sustrato 3x con tampón fosfato y dejar secar a temperatura ambiente por lo menos durante 10 minutos. </li><li> Añadir 40 l de medio de cultivo suplementado con 10% Seru bovino fetalm y 1% de penicilina-estreptomicina que contenía 2000 células en la porción central del sustrato para cubrir un área de 1 cm 2 (densidad de células: 20 células / mm 2). La densidad celular puede ser alterado de acuerdo con los requisitos experimentales. </li><li> Ponga todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular estándar con el sustrato hacia arriba con la gota de medio de cultivo que contiene las células en ella. NOTA: El montaje se debe mantener con el sustrato hacia arriba durante al menos 3 horas para permitir que las células se unan firmemente ella. Para evitar la evaporación, 30 l de medio de cultivo caliente se añade en la gota sobre el sustrato cada 45 min durante 3 horas. </li><li> Después de 3 h, dar la vuelta todo el conjunto en una placa de Petri llena de medio de cultivo fresco para sumergir el sustrato y se incuba durante la noche para permitir que las células proliferen. </li><li> El día siguiente, preparar la solución salina tamponada con HEPES (HBSS; 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, 1,8 mM de CaCl2, y 11,1 mM de dextrose). Ajustar el pH a 7,4. NOTA: La solución HBSS tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener las células en la platina del microscopio mediante la imitación de las condiciones del tejido / normal de la sangre. </li><li> Monte la puesta a punto de contraste de fase invertida o un microscopio fluorescente Monte el conjunto de la abrazadera del sustrato en la plataforma y motores BAXS. Llene la caja de Petri en el interior del calentador de placa de Petri con tampón HEPES (Figura 2D). </li></ol></li></ol> 2. Rigidez medición de los buques de pequeño calibre <ol><li> Preparación <ol><li> Krebs solución fisiológica: Prepare una solución de NaCl 118,1 mM, 11,1 mM D-glucosa, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 y 2,5 mM CaCl 2. Ajustar el pH a 7,4 y oxigenar la solución con gas médico carbógeno (95% O 2/5% CO 2) durante 30 min. NOTA: El soluti Krebsel tiene que estar preparado todos los días y se mantiene a 37 ° C durante los experimentos. Esta solución fisiológica se utiliza para mantener los tejidos vivos al imitar las condiciones del tejido / sangre normal. </li><li> Reúna la instrumentación para la disección y la evaluación mecánica de los vasos aórticos: tijeras quirúrgicas, pinzas dobladas, micro-tijeras, microscopio de disección quirúrgica, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno y 10 ml pipetas serológicas. El procedimiento quirúrgico y el experimento no requiere condiciones estériles. Montar las abrazaderas de la plataforma BAXS junto con la célula de carga de antemano. </li></ol></li><li> Aislamiento de tejido y disección Todos los procedimientos experimentales con animales de laboratorio tienen que ser aprobados por el Comité de los usuarios de Cuidado de Animales y Uso &#39;institución, que cumple con la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los usuarios&#39; país. <ol><li> Lleve a cabo la eutanasia de ratón con la inhalación de 99% de CO 2 (7 psi)en una cámara de Plexiglas (Figura 6A). </li><li> Abdomen abierto ratón y cortar la aorta torácica a sangrar el ratón. </li><li> Retire el diafragma, la caja torácica y los lóbulos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para reducir al mínimo el riesgo de dañar el tejido, mantener el corazón conectado a la aorta y evitar tocar el recipiente directamente, sino manipularla usando el corazón. </li><li> Quite el corazón, la raíz aórtica y de la aorta torácica cortando suavemente entre el buque y la columna vertebral. NOTA: No provocar ningún alargamiento en el recipiente durante la escisión de mantener la estructura interna del tejido intacto (Figura 6C). </li><li> Inmediatamente sumerja y mantener el corazón y la aorta en solución de Krebs. </li><li> Cortar y lavar cuidadosamente la aorta en solución de Krebs para eliminar cualquier coágulo de sangre. Quitar el tejido conectivo usando micro-tijeras, pinzas y microscopio de disección quirúrgica (Figura 6D-E). NOTA: Mantenga toda la eslora del buque y el uso de la aorraíz de tic para determinar la orientación del vaso. </li></ol></li><li> Vessel Determinación de dimensiones y montaje Para determinar la rigidez del recipiente, se requiere que las dimensiones de la embarcación sin carga y se pueden determinar con un microscopio calibrado. <ol><li> Cortar un anillo aórtico de aproximadamente 2 mm de longitud y medir con precisión su longitud utilizando un ajuste (Figuras 6F-G) microscopio calibrado. Ponga a un lado este segmento en solución de Krebs. </li><li> Corte otro anillo aórtico tan pequeño como sea posible entre cada uno de los segmentos 2 mm (Figura 6F). Añadir este pequeño segmento en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el lumen hacia arriba y medir el espesor de la pared usando un ajuste de microscopio calibrado (Figura 6H). </li><li> Llene la caja de Petri en la plataforma BAXS con solución Krebs e inserte el segmento de anillo aorta 2 mm en los pernos de tracción (recuadro en la Figura 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Fabricación sustrato de PDMS y de montaje. A) Después del curado, el sustrato es cuidadosamente pelado fuera de la 2050 molde SU-8 y dejar de lado en una placa de Petri. B) Anclaje características hechas de PDMS y ayudan a asegurar el sustrato en la abrazaderas. C) sustrato con características de anclaje listo para el montaje. D) El sustrato se monta en las abrazaderas 4, que se montan entonces en el soporte de la abrazadera (véase el recuadro). E) Imagen detallada del sustrato montado en las abrazaderas 4. F ) Procedimiento de colada de PDMS en la ranura debajo de la del sustrato. La flecha muestra el PDMS de llenado lentamente la ranura por capilaridad. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6. Preparación y aislamiento de la aorta torácica. A) preparar instrumentos quirúrgicos y el ratón sacrificado. B) A través de una incisión abdominal longitudinal, se retiran de la jaula torácica y globos de pulmón. C) La aorta se retira cuidadosamente usando el corazón para manipular el tejido. D) El corazón y la aorta se ponen en solución fisiológica de Krebs. La aorta se limpia mediante la eliminación de todos los tejidos conectivos. E) imagen detallada que muestra el. F) segmento de la aorta del corazón y la aorta utilizado para la evaluación de rigidez a lo largo con pequeños segmentos utilizados para la medición de espesor. GH) La longitud precisa (G) y el espesor (H) de cada uno de los segmentos de buques se evalúan usando un microscopio inverso y un programa de análisis.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La plataforma BAXS presentado aquí facilita numerosos experimentos en el estudio de mecanobiología, de las investigaciones de las células individuales a los tejidos enteros. Además, la plataforma es altamente flexible y configurable, permitiendo numerosos experimentos de estimulación mecánicas y de ensayo de tracción multiaxial. La plataforma también permite el mantenimiento de células y tejidos en condiciones fisiológicas y permite para microscopía simultánea durante los experimentos de estiramiento. Los dos experiment...

El microambiente mecánica juega un papel importante en muchas funciones celulares tales como proliferación, migración, y diferenciación, que tienen un impacto profundo en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos y también en enfermedades 1-6. A través de los años, una multitud de herramientas experimentales se han utilizado para estimular mecánicamente las células o tejidos y medir las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos con el objetivo de aumentar la comprensión de mecanobiología básica y el estudio de la aparición y progresión de enfermedades de 6-17. Sin embargo, hay que a menudo se basan en varios dispositivos experimentales diferentes con el fin de lograr los objetivos de un estudio en particular. En este artículo se presenta un solo biaxial plataforma, multi-funcional, que se extiende (BAXS) que permite que los estudios que investigan el papel que las propiedades mecánicas y las fuerzas mecánicas juegan en biología en la sub-celular a escalas de longitud tejido enteros. La plataforma BAXS no sólo permite la quantification de las propiedades mecánicas de los tejidos aislados, sino que también facilita la capacidad de aplicar campos de deformación simples, complejos, y dinámicas a las células vivas a fin de comprender sus respuestas al estiramiento que se produce in vivo. La plataforma BAXS también mantiene la capacidad de realizar la microscopía de células vivas durante las pruebas mecánicas y perturbaciones en las células y tejidos. La plataforma BAXS es un aparato construido a la medida que se puede utilizar para investigar el efecto de la deformación del sustrato a nivel celular y realizar ensayos de tracción sobre los tejidos biológicos (Figura 1A). Un calentador de aluminio se fabricó para dar cabida a un plato estándar de 10 cm de Petri y mantener las soluciones fisiológicas a 37 ° C usando un controlador de temperatura y calentadores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS se puede integrar en un contraste de fase invertida y / o un microscopio de fluorescencia y permite la formación de imágenes simultánea (Figura 1C).En breve, la plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz lineales de los cuales las partes móviles están montados en miniatura de bolas de movimiento lineal diapositivas del rodamiento orientadas a lo largo de dos ejes perpendiculares (Figura 1D). Una etapa de posicionamiento lineal está montado en cada uno de los cuatro motores para permitir el movimiento vertical del sistema de sujeción que se utilizará (Figura 1E). La posición de cada motor se controla mediante un codificador óptico con una resolución de 500 nm (Figura 1F). Los cuatro motores son controlados de manera independiente con un controlador de movimiento que emplea realimentación del codificador óptico para comandos de movimiento (Figura 1G) de ejecutar. Una interfaz de LabVIEW proporciona un control total sobre la magnitud de desplazamiento, velocidad y aceleración de cada motor con el fin de generar la deformación completamente personalizable, estático y dinámico, de las células o muestras de tejido. La técnica utilizada para inducir una deformación en las células se consigue simplemente allowing de células se adhieran firmemente a un sustrato flexible y transparente y luego se extiende este sustrato utilizando los cuatro motores de la plataforma BAXS. La plataforma BAXS permite el montaje de cualquier conjunto de diseño personalizado de pinzas para sujetar el sustrato en los motores de bobina de voz. Para este fin, se diseñó un conjunto de abrazaderas a la que un sustrato flexible y transparente, hecha de polidimetilsiloxano (PDMS), puede ser conectado al mismo (Figuras 2A-C y la Figura 3). Como las abrazaderas estarán expuestos a soluciones fisiológicas, todas las partes se mecanizan a partir de acero inoxidable para permitir la esterilización. Estas abrazaderas han sido cuidadosamente diseñados para llevar el sustrato lo más cerca posible al objetivo del microscopio para mejorar la calidad de imagen al tiempo que minimiza la presión sobre el sustrato durante el estiramiento (Figura 2D). La misma plataforma BAXS también se puede utilizar para cuantificar la rigidez de pequeñas muestras de tejido, utilizando un conjunto adecuado de abrazaderas con ADAPTed soportes para las muestras de tejido y una célula de carga para monitorizar fuerzas. Varios enfoques pueden ser tomados para montar un tejido a los motores de la plataforma BAXS; en este caso los minutiens de insectos de acero inoxidable pines pueden conectar a través de la apertura de los tejidos vasculares con el fin de realizar ensayos de tracción (Figuras 4A-B). Alternativamente, para tejidos gruesos sin una abertura natural, bordes de tejido puede ser celebrada en su posición con las abrazaderas unidas a los motores de bobina de voz o pegados a las pequeñas placas de vidrio con pegamento biológico y unidos a los motores con las abrazaderas. Con el fin de realizar las pruebas de tracción se requiere una célula de carga en miniatura y se puede incorporar fácilmente en los motores de la plataforma BAXS y se utiliza para medir la fuerza que actúa sobre el tejido durante un ciclo de estiramiento (Figura 4C). Como la plataforma BAXS se compone de cuatro motores, la introducción de una segunda célula de carga permite a uno realizar ensayos de tracción a lo largo de dos direcciones ortogonales. Esta capacidad permite a uno quantify la rigidez mecánica de un solo tejido a lo largo de dos direcciones perpendiculares durante el mismo experimento. Es importante destacar que, en todas las configuraciones, las células o muestras de tejido de interés se mantienen siempre en un baño de temperatura controlada que es accesible para el usuario. Esta capacidad permite la introducción de agentes farmacológicos durante el estiramiento de la muestra con el fin de examinar la respuesta temporal de la muestra. Además, como el eje óptico del microscopio invertido permanece sin obstrucciones, todas las formas de microscopía están todavía disponibles para el usuario. Por último, como todos los cuatro motores de la plataforma BAXS son independientes, es posible aplicar campos de deformación altamente configurables para la muestra de interés. In vivo células y tejidos están expuestos a complejo y anisotrópico de estiramiento que puede ser imitado más apropiadamente en esta plataforma en oposición al tradicional estirado uniaxial 7,13,15,18,19 plataforma. Además, las características físicasdel campo de deformación se puede cambiar sobre la marcha durante un experimento. Estas capacidades permiten al usuario examinar la respuesta celular y el nivel de tejido a una amplia serie de altamente complejo, anisotrópico, temporalmente, y campos de deformación espacialmente diferentes. En este artículo se describen las ventajas y limitaciones de la plataforma BAXS así como su diseño, principios de funcionamiento, y los detalles experimentales para una sola célula y los experimentos de todo el tejido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Visión general de la plataforma BAXS. A) Vista superior de la plataforma BAXS mostrando los cuatro motores de bobina de voz. B) Cuadro detallado del calentador de placa de Petri se utiliza para mantener las células y los tejidos a 37 º C. C) La plataforma se puede montar en un microscopio invertido para tocar en vivo- imágenes de células durante los experimentos de estiramiento.D) Cuadro detallado del motor de bobina de voz; la parte móvil de la plataforma. E) Cuadro detallado de la etapa de posicionamiento lineal que permite el desplazamiento vertical de los sistemas de sujeción. F) Cuadro detallado del codificador óptico que proporciona la posición en tiempo real del motor para el controlador de movimiento. G) Cuadro detallado del controlador de movimiento que muestra las cuatro entradas de encoder ópticos y salidas de potencia a los cuatro motores de bobina de voz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Sistema de sujeción para los experimentos de células de estiramiento. AB) imágenes que muestran los detalles de las abrazaderas utilizadas para unir el sustrato de PDMS a los motores de bobina de voz para el estiramiento. C) El sustrato se envuelve alrededor de la parte cilíndrica de la abrazadera con su Featur anclajees que se sienta en la ranura en la parte superior. A continuación, el sustrato se fija con los tornillos que empujan el sustrato / anclaje características en la ranura superior. D) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas que sostiene el sustrato en su lugar. El recuadro muestra una vista detallada del sustrato con las células unidas a él sentado justo por encima de una hoja de cubierta y el objetivo del microscopio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Lista de materiales de la membrana y su sistema de sujeción. Dibujos que muestran las dimensiones de las partes principales integrados a la plataforma de dos ejes para llevar a cabo experimentos de células de estiramiento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Explo de un sistema de sujeción para la evaluación de la rigidez de los vasos de pequeño calibre. AB) imágenes detalladas del sistema de sujeción se utiliza para inducir la deformación en un 1 mm de diámetro de la aorta del ratón. Pasadores de acero inoxidable fueron cuidadosamente en forma en triángulos abiertos para permitir que el buque se deslice en ambas clavijas. C) Ilustración de la plataforma BAXS con las abrazaderas de la celebración de la embarcación y una célula de carga conectada entre el motor fijo y la pinza izquierda. El recuadro muestra una vista superior detallada del buque montado en las patillas.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>La relación base/reticulante utilizada en este protocolo es de 20:1. Mezcle en una campana laminar para evitar que el polvo contamine su &nbsp;</td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Mantener alejado de la luz.</td></tr><tr><td>Bobina móvil lineal</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>El motro se presenta en dos piezas (imán y bobina). Tiene que estar montado en un sistema de rodamientos de bolas para que funcione.</td></tr><tr><td>Corredera de rodamiento de bolas</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Correderas de rodamiento de bolas de movimiento lineal pequeño y en miniatura</td></tr><tr><td>Etapa de posicionamiento lineal</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>Accionamiento central 1,25" Etapas de traslación lineal cuadradas</td></tr><tr><td>Codificador óptico</td><td>GSI sistemas microE</td><td>Mercury II 1600S -</td><td>Codificador incremental reflectante con resolución de</td> 0,5um.</tr><tr><td>Controlador de movimiento</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 con AMP-20440 Controlador de</td><td>4 ejes con amplificador de 4 ejes</td></tr><tr><td>Célula de carga</td><td>Honeywell</td><td>31</td><td>Célula de carga en miniatura baja con un rango de 0-150 g</td></tr><tr><td>Clavijas de insectos minutiens (0,20 mm)</td><td>Servicio de clavijas Austerlitz Clavijas de</td><td></td><td>insectos Clavijas de acero inoxidable que se doblan en forma de triángulo abierto</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Fotorresistencia permanente epoxi negativo. Mantener alejado del calor y la luz</td></tr><tr><td>Sistema de tratamiento de aire-plasma</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow Oxygen Plasma System</td></tr><tr><td>Colágeno cola de rata</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Colágeno I, cola de rata 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>Colorante fluorescente específico para el ADN. Conservar en la nevera.</td></tr><tr><td>Calentadores flexibles aislados Kapton (película de poliimida)</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>Calentadores flexibles de 28 V; se pueden suministrar con controladores de</td></tr> temperatura y proceso de 24 V <tr><td>1/16 DIN Autotune</td><td>omega.ca</td> controlador <td>de temperatura CN63200-R1-LV</td><td>; alimentación de 24 V.</td></tr><tr><td>Medio de cultivo DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco' s Modificado 30 Eagle Medium. Mantener en 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Hipona</td><td>de penicilina-estreptomicina</td><td>SV30010</td><td>Mantenga las existencias congeladas. Mantenga la solución de trabajo a 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>Mantener congelado.</td></tr><tr><td>Tripsina 0.05%</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.02</td><td>Mantener congelado. Digestión de proteínas de fijación celular para el subcultivo</td></tr><tr><td>Hepes Wisent</td><td>Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES-solución salina tamponada&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Solución salina tamponada HEPES / Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP366-500</td><td>Solución salina tamponada HEPES / Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>Solución salina tamponada HEPES / Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>Solución salina tamponada HEPES / Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Solución salina tamponada HEPES / Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Solución fisiológica Krebs</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs solución fisiológica</td></tr><tr><td>Carbógeno 95% O2/5% CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs oxigenación de la solución fisiológica</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Agente de despolimerización de microtúbulos</td></tr><tr><td>Citocalasina-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Agente de despolimerización de filamentos de actina</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;- SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Se utiliza para teñir y cuantificar el contenido de células musculares lisas</td></tr><tr><td>Picrosirius red</td><td>stain Fluka</td><td>43665</td><td>Se utiliza para teñir y cuantificar el contenido de colágeno</td></tr></tbody></table>

una plataforma novela estiramiento para aplicaciones en celular y tisular mecanobiología

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Las herramientas que permiten la aplicación de fuerzas mecánicas a las células y tejidos o que pueden cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos han contribuido de manera espectacular a la comprensión de mecanobiología básica. Estas técnicas se han utilizado ampliamente para demostrar cómo el inicio y la progresión de diversas enfermedades están muy influenciados por las señales mecánicas. Este artículo presenta un estiramiento biaxial (BAXS) plataforma multifuncional que puede estimular mecánicamente las células individuales o cuantificar la rigidez mecánica de los tejidos. La plataforma BAXS consta de cuatro motores de bobina de voz que pueden ser controlados de forma independiente. Única células pueden ser cultivadas en un sustrato flexible que se puede acoplar a los motores que permiten una para exponer las células a campos de tensiones complejas, dinámicas y espacialmente variables. Por el contrario, mediante la incorporación de una célula de carga de fuerza, se puede cuantificar también las propiedades mecánicas de los tejidos primarios como los que están expuestos a los ciclos de deformación.En ambos casos, un conjunto adecuado de abrazaderas debe ser diseñado y montado en los motores de la plataforma BAXS con el fin de sostener firmemente el sustrato flexible o el tejido de interés. La plataforma BAXS se puede montar en un microscopio invertido para llevar a cabo simultánea luz transmitida y / o imágenes de fluorescencia para examinar la respuesta estructural o bioquímica de la muestra durante los experimentos de estiramiento. Este artículo proporciona detalles experimentales del diseño y el uso de la plataforma BAXS y presenta los resultados de una sola célula y estudios de todo el tejido. La plataforma BAXS se utilizó para medir la deformación de los núcleos en células individuales de mioblastos de ratón en respuesta al sustrato cepa y para medir la rigidez de las aortas aisladas de ratón. La plataforma BAXS es ​​una herramienta versátil que se puede combinar con diversos microscopías óptica con el fin de proporcionar nuevos conocimientos mecanobiológicos en los niveles de tejido sub-celulares, celular y conjunto.

Celular Estiramiento La plataforma BAXS se utilizó para investigar la respuesta mecánica del núcleo en las células individuales de mioblastos de ratón (C2C12) expuesta a una deformación del sustrato de 25%. Células mioblastos se encuentran en el tejido muscular y están constantemente expuestos a estiramiento mecánico y de compresión in vivo. Las propiedades de forma y mecánicas del núcleo de la célula han demostrado que desempeñan un papel importante en la regulació...

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la novedad de una plataforma de estiramiento anisotrópico que puede utilizarse para investigar las respuestas de células individuales a deformaciones mecánicas complejas y para cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos. Esto se logra primero fabricando la membrana flexible y montando esta membrana sobre un conjunto de abrazaderas. El segundo paso consiste en cultivar células C two C 12 sobre la membrana durante la noche, y al día siguiente, montar las abrazaderas sobre la plataforma de estiramiento.A continuación, en un segundo grupo de experimentos, se extraen tejidos de la aorta torácica de un modelo murino y se limpian de cualquier tejido conectivo. Luego, el tejido aórt游戏副本O alternativamente, se integra un transductor de fuerza al dispositivo de estiramiento para medir la rigidez del tejido. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes, como el estiramiento uniaxial o biaxial de células, es que nos permite controlar de forma independiente la deformación en dos direcciones ortogonales sobre una membrana transparente a la que están adheridas las células, y por lo tanto permite la

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.

Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

Este estudio presenta un nuevo protocolo para aplicar directamente fuerza mecánica en el núcleo celular a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas.

Combinación de actuador de fuerza magnética 3D e imágenes de fluorescencia multifuncionales para estudiar la mecanobiología del núcleo

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Aquí, presentamos un dispositivo de estiramiento equibiaxial versátil que se acciona neumáticamente y es compatible con la microscopía de alta resolución.

Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Aquí presentamos un dispositivo novedoso que aplica formas de onda de deformación isotrópicas y uniaxiales a las células, al tiempo que apoya el cultivo en sustratos con rigidez sintonizable y matrices proteicas personalizables. Esta plataforma sencilla y económica permite a los investigadores investigar cómo las señales mecánicas regulan la función celular tanto en estudios fundamentales como en contextos relevantes para enfermedades.

Una plataforma novedosa para el estiramiento e imagen celular in vitro

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Aprende a utilizar una plataforma de estiramiento anisotrópico para estudiar respuestas celulares a deformaciones mecánicas complejas en células C2C12 y tejidos aórticos de ratón. Esta técnica avanza la comprensión de la biomecánica celular y tisular.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

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