Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la novedad de una plataforma de estiramiento isotrópica que se puede utilizar para investigar las respuestas de una sola célula a la deformación mecánica compleja y para cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos. Esto se logra fabricando primero la membrana flexible y montando esta membrana en un conjunto de abrazaderas. El segundo paso es cultivar dos células C 12 en la membrana durante la noche y, al día siguiente, montar las pinzas en la plataforma de estiramiento.

A continuación, en un segundo conjunto de experimentos, se rechazan los tejidos de la aorta torácica de un modelo de ratón y se limpian de cualquier tejido conectivo. A continuación, el tejido aórtico se monta en la plataforma de estiramiento utilizando un conjunto diferente de pinzas. En última instancia, la plataforma de estiramiento se utiliza para inducir una deformación en las células a lo largo de dos direcciones ortogonales que se pueden cuantificar utilizando un microscopio invertido.

O alternativamente, se integra un transductor de fuerza en el dispositivo de estiramiento para medir la rigidez del tejido. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes, como el estiramiento celular uni real o biaxial, es que nos permite controlar de forma independiente la deformación en dos direcciones ortogonales en una membrana transparente sobre la que se adhieren las células, y por lo tanto permitir la obtención de imágenes de células vivas. Microscopía también un diseño cuidadoso de un conjunto diferente de pinzas.

Con la integración de un usuario de cuatro cuerdas en la plataforma, nos permite realizar pruebas de 10 células en tejido biológico para la cuantificación de sus propiedades mecánicas. Este video presenta la plataforma de estiramiento biaxial, un aparato hecho a medida que se puede utilizar para investigar el efecto de la deformación del sustrato a nivel celular y realizar pruebas de tracción en tejidos biológicos. El diseño y las características de la plataforma de estiramiento biaxial se detallan en el manuscrito adjunto para investigar el efecto de la deformación mecánica de las células individuales, primero se debe fabricar un sustrato flexible y transparente sobre el que se pueden adherir las células.

Para comenzar este procedimiento, pipetee 500 microlitros de una solución de microesfera fluorescente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 16, 200 Gs Durante 10 minutos, deseche el supernat y agregue 500 microlitros de isopropanol, seguido de cinco minutos de vórtice. Deje el vial a un lado durante la noche en la oscuridad para permitir que los agregados de partículas grandes se sedimenten a la mañana siguiente, transfiera con cuidado el SNAT a un vial de microcentrífuga limpio. Esta solución de perlas se puede utilizar para fabricar más de cinco sustratos porque la solución de perlas continuará sedimentándose durante los próximos tres días.

Es importante evitar que Resus suspenda el pellet. Vierta 0,5 gramos del agente de curado provisto con el kit PDMS en un vial de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 15 microlitros de perlas fluorescentes y vórtice durante un minuto.

Repite esto cinco veces más para agregar un total de 90 microlitros de cuentas y reserva. Pesar 10 gramos de PDMS, añadir 0,5 gramos del agente de curado, complementado con perlas fluorescentes y mezclar durante al menos 12 minutos. A continuación, utilice la pipeta de transferencia para transferir cuatro miligramos de PDMS con perlas a un molde en forma de cruz SUH 2050 fabricado previamente mediante técnicas de fotolitografía estándar.

El molde tiene una altura de 320 micrómetros y un área de 13,4 centímetros cuadrados, y puede contener 428 microlitros o 440 miligramos de PDMS, cura el PDMS durante dos horas a 80 grados centígrados. Después del curado, despegue el sustrato del molde, el sustrato se puede mantener en una placa de Petri a temperatura ambiente durante dos semanas sin mostrar cambios significativos y sus propiedades mecánicas. Vierta gotas de PDMS en una placa de Petri con un tamaño final de aproximadamente cuatro milímetros de diámetro, cúrelas boca abajo durante dos horas a 80 grados centígrados, la placa debe mantenerse boca abajo para evitar que las gotas se aplanen durante el proceso de curado.

Estas características de anclaje se pueden mantener en una placa de Petri durante semanas. El plasma de aire trata el sustrato y las ocho características de anclaje, une las características en cada extremo del sustrato a una distancia de cuatro milímetros de la hendidura de forma cuadrada presente en el sustrato para montar la membrana en las abrazaderas. Envuelva cada extremo del sustrato alrededor de la parte cilíndrica de la ranura de las abrazaderas y asegúrelo en su lugar con los dos tornillos de fijación de la parte superior.

Atornille las cuatro abrazaderas en el soporte de la abrazadera. A continuación, vierta PDMS en la interfaz entre el sustrato y la parte ranurada de las abrazaderas. Extienda el PDMS sin curar alrededor de la pieza cilíndrica ranurada con una llave hexagonal de 1,5 milímetros.

Vierta PDMS en las ranuras hasta que esté completamente lleno por capilaridad y cure el conjunto a 80 grados centígrados durante dos horas antes de sembrar las células en la membrana. Plasma de aire. Trate todo el conjunto para esterilizar y funcionalizar el sustrato para permitir el recubrimiento de colágeno.

Funcionalice el área del sustrato donde se sembrarán las células con un mililitro de ácido acético 0,02 molar suplementado con 16 microgramos por mililitro de colágeno de cola de rata a temperatura ambiente durante una hora. La densidad final de colágeno deseada es de cinco microgramos por centímetro cuadrado Después de una hora, enjuague el sustrato tres veces con tampón de fosfato y déjelo secar a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Añadir 40 microlitros de medio de cultivo, suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina.

Estreptomicina que contiene 2000 células en la porción central del sustrato para cubrir un área de un centímetro cuadrado. En este ejemplo, la densidad de celdas es de 20 celdas por centímetro cuadrado. Sin embargo, la densidad celular puede ser alterada de acuerdo con los requisitos experimentales.

Coloque todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular estándar con el sustrato hacia arriba con la gota de medio de cultivo que contiene células sobre él. El conjunto debe mantenerse con el sustrato hacia arriba durante al menos tres horas para permitir que las células se adhieran firmemente a él y evitar la evaporación. Se añaden 30 microlitros de medio de cultivo tibio a la gota sobre el sustrato.

Cada 45 minutos después de tres horas, voltee todo el conjunto en una placa de Petri llena de medio de cultivo fresco para sumergir el sustrato e incubar durante la noche para permitir que las células proliferen al día siguiente. Monte la configuración en un microscopio fluorescente o de contraste de fase invertida. Monte el conjunto de sustrato de abrazadera en la plataforma de estiramiento biaxial y los motores llenarán la placa de Petri dentro del calentador de placa de Petri con una solución salina tamponada HEP recién preparada.

Esta solución fisiológica se utiliza para mantener las células en la etapa del microscopio imitando el entorno sanguíneo normal del tejido. La misma plataforma de estiramiento biaxial también se puede utilizar para cuantificar la rigidez de pequeñas muestras de tejido. En esta demostración se utilizarán aortas aisladas de ratón.

Retire el diafragma, la caja torácica y los lóbulos pulmonares del ratón sacrificado para minimizar el riesgo de dañar el tejido. Mantenga el corazón unido a la aorta y evite tocar el vaso directamente pero manipulado. Usando el corazón.

Extirpa el corazón, la raíz aórtica y la aorta torácica haciendo un corte suave entre el vaso y la columna vertebral para mantener intacta la estructura interna del tejido. Tenga cuidado de no inducir ningún alargamiento en el vaso durante la incisión. Sumerja inmediatamente y mantenga el corazón y la aorta en la solución de Krebs, que se prepara diariamente y se mantiene a 37 grados centígrados durante los experimentos.

Corte y lave cuidadosamente la aorta en la solución de Krebs para eliminar cualquier coágulo de sangre que funcione bajo un microscopio de disección quirúrgica. Retire el tejido conectivo con microtijeras y pinzas. Es importante mantener toda la longitud del vaso y utilizar la raíz aórtica para determinar la orientación del vaso.

Las dimensiones del recipiente descargado son necesarias para determinar la rigidez del recipiente. Corte un anillo aórtico de unos dos milímetros de longitud y mida con precisión su longitud utilizando un microscopio calibrado. Deja este segmento a un lado en la solución de Kreb.

A continuación, corte dos pequeños anillos aórticos de las secciones de la aorta que quedan después de la extracción del segmento de dos milímetros. Un anillo de la sección de la aorta antes del segmento de dos milímetros, y otro anillo de la sección de la aorta. Después del segmento de dos milímetros, coloque ambos anillos aórticos en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el lumen hacia arriba y mida el grosor de la pared con un ajuste de microscopio calibrado.

El grosor de la pared aórtica se mide y se promedia utilizando estos dos anillos. Llene la placa de Petri en la plataforma de estiramiento biaxial con la solución de Krebs e inserte el segmento del anillo de aorta de dos milímetros en los pasadores de tracción. En este protocolo, se utilizó la plataforma de estiramiento biaxial para investigar la respuesta mecánica del núcleo en células de mioblastos de ratón individuales expuestas a una deformación del sustrato del 25% de deformación por desplazamiento.

En estos resultados representativos se muestran las relaciones entre la realización de estiramientos axiales estándar y uniaxiales puros. Las perlas fluorescentes se seleccionan manualmente en el primer fotograma del vídeo y se rastrean de un fotograma a otro hasta que se alcanza el estiramiento máximo a lo largo de las direcciones horizontal y vertical. Un script de MATLAB calcula automáticamente los componentes del tensor de deformación verde para cada fotograma y genera una curva de calibración de la deformación con respecto al desplazamiento del motor.

En estos gráficos, las líneas azul y roja corresponden a la componente de la tensión verde a lo largo de las direcciones horizontal y vertical respectivamente. Estos resultados ilustran las capacidades de la plataforma de estiramiento biaxial para inducir una deformación en el sustrato a lo largo de dos direcciones ortogonales. Además de los campos de deformación uniaxiales estándar de EQU Biaxial, la plataforma de estiramiento biaxial puede inducir campos de deformación complejos en el sustrato.

El panel G muestra que estirar el mismo sustrato cuatro milímetros a lo largo del eje x y estirarse ligeramente a lo largo del eje Y 1,5 milímetros resaltados en rojo, produce un campo uniaxial puro sin deformación compresiva en el sustrato. Panel, H muestra que estirar el sustrato a lo largo del eje x en 3,5 milímetros produce una deformación del 25% y una deformación compresiva del 7% cuando los extremos del sustrato a lo largo del eje vertical están fijos, resaltados en rojo Con la capacidad de realizar imágenes de microscopía de células vivas durante el estiramiento, los núcleos se tiñeron con un tinte fluorescente de células vivas que se une al ADN y luego se estiraron en un 25% a lo largo de cada eje de estiramiento ortogonal como Como se ilustra aquí, entre cada fase del ciclo de estiramiento, se adquirieron imágenes de contraste e imágenes epifluorescentes del núcleo no formado y deformado. Las longitudes del eje nuclear mayor y menor a lo largo del estado no formado y cuando el núcleo se estiró secuencialmente a lo largo de su eje mayor y menor se determinaron utilizando un complemento de imagen J y se utilizaron para calcular el cambio relativo en la longitud.

A lo largo de cada eje de este gráfico de barras, el eje X o mayor se muestra en azul y el eje y o menor se muestra en rojo. La capacidad de deformación del núcleo exhibe una anisotropía mecánica, ya que muestra una capacidad de deformación significativamente mayor a lo largo de su eje menor en, en comparación con su eje mayor, el papel del citoesqueleto de actina y microtúbulos en la regulación de la capacidad de deformación nuclear se examinó mediante despolimerización, los filamentos de actina o microtúbulos selectivamente utilizando citoD y neol respectivamente despolimerización. Se encontró que los filamentos de actina o los microtúbulos inducen una pérdida de la deformabilidad anisotrópica del núcleo.

Estos resultados respaldan los hallazgos de que los componentes del citoesqueleto transmiten fuerzas al núcleo desde el sustrato y también son esenciales para preservar el comportamiento mecánico natural del núcleo. Durante la deformación, la plataforma de estiramiento biaxial también se utilizó para evaluar el efecto de la sobreexpresión crónica de la proteína de choque térmico 27 o HP 27 sobre la rigidez del vaso HSP sobre la expresión. En un modelo de ratón propenso a la aterosclerosis, un negativo homocigoto POE modifica la composición histológica de las lesiones de aterosclerosis al aumentar las células del músculo liso de la íntima y el contenido de colágeno.

Para determinar el impacto de esta remodelación histológica en las propiedades mecánicas de los vasos, se utilizó la plataforma de estiramiento para medir la rigidez aórtica. Este gráfico muestra una curva típica de deformación por esfuerzo obtenida al estirar un vaso aórtico, mientras que la rigidez se calcula al 30% de la deformación. La rigidez es la pendiente de la tangente indicada por la línea roja a la curva.

Se encontró que la rigidez de los segmentos aórticos de HSP 27 en ratones con sobreexpresión aumentó significativamente en un 41% en comparación con el modelo de ratón de control. En conjunto, la evaluación mecánica, combinada con la histología de los vasos y la placa, demostró que la sobreexpresión de HSP 27 se caracteriza por un aumento de la rigidez de los vasos y del contenido de células de colágeno del músculo liso. Estos resultados sugieren que HSP 27 podría aumentar potencialmente la estabilidad de las lesiones ateroscleróticas y, por lo tanto, disminuir el riesgo de rotura de la placa después de su desarrollo.

Esta técnica ofrece una nueva forma para que los investigadores en el campo de la bioingeniería exploren la respuesta celular a la deformación mecánica compleja e inotrópica para aplicaciones en biología mecánica, pero también para monitorear la mecánica de tejidos biológicos en enfermedades.