Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

El objetivo general del siguiente experimento es aislar el polisoma de los ribosomas traductores para estudiar los cambios en la actividad de traducción del ARNm en la célula. Esto se logra mediante la adición de ciclohexa al medio de crecimiento para congelar los ribosomas en el ARNm, evitando así la escorrentía de los ribosomas como segundo paso. Los ribosomas se extraen de las células y se separan en función de su densidad mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para cuantificar y aislar las subunidades ribosómicas libres 40 s y 60 s mono zonas a DS, y el polisoma de ribosomas traductorio.

A continuación, se pueden extraer ARN o proteínas de las fracciones de sacarosa para analizar Mr NA y la abundancia de proteínas, respectivamente, en fracciones pre y polisomales. Los resultados muestran cambios cuantitativos y cualitativos en la traducción del ARNm, que pueden examinarse a nivel de todo el genoma mediante micromatrices o secuenciación de ARN de próxima generación y analizarse mediante un algoritmo NoDa. El método de perfil de envenenamiento se puede utilizar para abordar cuestiones importantes en lo que respecta a la regulación de la expresión génica a niveles de posttranscripción, como el seguimiento de los cambios en el ARNm, la traducción a nivel de todo el genoma, así como la asociación de proteínas con ribosoma y polis.

Valentina Gand investigadora asociada en nuestro laboratorio demostrará esta técnica Para comenzar, prepare 100 mililitros de solución de sacarosa al 60% de peso por volumen en agua destilada desionizada, luego filtre la solución a través de un filtro de 0.22 micrómetros. A continuación, diluya la solución de sacarosa al 60% en un tampón de gradiente de sacarosa X para hacer 40 mililitros de soluciones de sacarosa al 5% y al 50%. Utilice el bloque marcador provisto con la unidad de gradiente para marcar la mitad del punto completo en seis tubos de ultracentrífuga poly aamer.

Luego use el dispositivo de capas para agregar una solución de sacarosa al 5% hasta el punto medio lleno. A continuación, agregue la solución de sacarosa al 50% en el fondo del tubo hasta que la interfaz de las dos soluciones llegue a los tubos de sellado de medio punto completo con tapas zonales de tasa y coloque los tubos de sellado en el soporte de tubos en el fabricante de gradientes. Ejecute el creador de degradados para obtener un gradiente lineal de 5% a 50%El creador de degradados gira los tubos en un ángulo de inclinación alto para formar seis gradientes lineales en unos pocos minutos.

El día del experimento, las células deben tener aproximadamente un 80% de confluentes. Trate las células con 100 microgramos por mililitro de ciclohexa en un medio de crecimiento e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono Lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS helado que contenga 100 microgramos por mililitro de ciclohexa. Luego agregue cinco mililitros adicionales de la solución helada de PBS.

Raspe las células y transfiera la suspensión celular a un 50 mililitros para centrifugar las celdas a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 425 microlitros de tampón de lisis hipotónica. A continuación, agregue cinco microlitros de 10 miligramos por mililitro de ciclohexa, un microlitro de un molar DTT y 100 unidades de inhibidor de ARN a la suspensión celular.

A continuación, vórtice la solución durante cinco segundos. Complemente la suspensión celular con 25 microlitros de 10% de tritton X 125 microlitros de 10% de coato de desoxi de sodio, luego vórtice durante cinco segundos adicionales. A continuación, centrifugar los lisados a 16.000 veces G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.

Transfiera la súper natina a un nuevo tubo preenfriado de 1,5 mililitros y guarde el 10% del lisado como control para medir los niveles de ARNm de MR en estado estacionario. Mida el OD a 260 nanómetros para cada muestra de lisado y luego ajuste el mismo OD en un tampón de lisis hipotónica con un volumen final de 500 microlitros. Retire 500 microlitros de la parte superior de los gradientes de sacarosa y cargue las muestras de lisado ajustadas en la parte superior de cada gradiente.

A continuación, pesa y equilibra cada tubo de gradiente. Coloque los tubos en un rotor SW 41 TI y ponga la ultracentrífuga en modo de pausa baja. A continuación, centrifugar las muestras a 222, 228 veces G durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Cuando finalice la ultracentrifugación, retire con cuidado los tubos de gradiente del rotor y colóquelos en hielo. Primero, llene el colector de fracciones con dos tubos de recolección de mililitros. Luego, encienda la bomba de la computadora, el detector UV y el colector de fracciones media hora antes de que se recolecten las fracciones.

Configure la bomba para que funcione a tres mililitros por minuto y luego llene el tubo con una solución de persecución para eliminar el aire del sistema. Pase la solución de persecución a través del tubo hasta que salga una gota de la aguja. Abra el software de análisis.

A continuación, ajuste la sensibilidad a más o menos 10 milivoltios de electrones y la base de tiempo a 100 segundos. Coloque el tubo de ultracentrífuga en el detector UV y asegúrese de que el tubo esté en la posición ortogonal. A continuación, gire la perilla debajo del soporte del tubo para perforar el tubo con la aguja.

Ajuste el caudal de la bomba a 1,5 mililitros por minuto y configure el colector de fracciones para que recoja fracciones cada 30 segundos, lo que equivale a 750 microlitros en cada fracción. Coloque la bomba en la posición remota. A continuación, encienda la bomba y el colector de fracciones y comience a grabar con el trazador DAQ al mismo tiempo.

Cuando la primera gota de solución de persecución caiga en un tubo de recolección, detenga la bomba y el trazador DAQ. Al mismo tiempo, agregue 750 microlitros de triol a cada fracción recolectada y flashee. Congelar las fracciones en nitrógeno líquido.

A continuación, siga las instrucciones del fabricante para aislar el ARN asociado y citosólico del polisoma de las muestras. Se utilizó el fraccionamiento de polisomas para evaluar la actividad traslacional de las células de cáncer de mama C siete tratadas con insulina. La proporción de polisomas aumentó con el tratamiento con insulina en comparación con las células de control y las tratadas con el inhibidor de mTOR, Torin one.

Este resultado indica que la insulina estimula las tasas globales de iniciación de la traducción en las células mc siete. Los resultados de cuatro ensayos independientes del experimento con insulina se utilizaron para evaluar la reproducibilidad de este método de fraccionamiento de polisomas. Las muestras de la misma condición de tratamiento y origen de ARN están muy cerca en este gráfico, lo que indica una alta reproducibilidad.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lisar células, preparar sacarosa, gradientes y, finalmente, recolectar ribosomas fraccionados. Este protocolo te permitirá analizar la expresión génica a nivel de posttranscripción.