Un método de bajo costo para el Análisis convulsiva actividad y movimiento en Drosophila

El objetivo general de este procedimiento es identificar alteraciones en las conductas locomotoras o convulsivas en la drosophila. Esto se logra separando primero las moscas en viales individuales con el uso de anestesia. A continuación, se utiliza una simple cámara web para grabar el movimiento de las moscas.

A continuación, los datos se importan a la imagen J para comenzar el análisis. Por último, se utiliza un software de análisis de moscas hecho a medida para determinar la distancia, la velocidad y la duración del movimiento durante el período de registro. En última instancia, este ensayo puede mostrar cambios en el comportamiento locomotor o convulsivo que se asocian con manipulaciones genéticas y farmacológicas.

Ahora bien, esta técnica de registro de bajo coste que vamos a describir se puede utilizar tanto para analizar el comportamiento de las convulsiones como la locomoción en las moscas de la fruta. En particular, lo hemos utilizado para identificar manipulaciones genéticas y farmacológicas que modifican el comportamiento convulsivo en esas moscas. Pero hoy, Chris Burner, un asistente de investigación de pregrado en mi laboratorio, demostrará esta técnica para comenzar a configurar la cámara web que grabará a las moscas durante los ensayos locomotores y de convulsiones.

Una vez que la cámara esté en su lugar, abra el práctico programa de software a VI. Para ajustar la configuración de grabación, seleccione la opción de imágenes de lapso de tiempo en la pestaña de captura y, cuando se abra la nueva ventana, seleccione la cámara web como dispositivo de captura. Para la mayoría de los experimentos, un tamaño de fotograma de vídeo de seis 40 por cuatro 80 es adecuado En la opción de compresión, seleccione el códec Intel IUV y establezca los segundos por fotograma de acuerdo con el ensayo.

En la pestaña avanzado, cree un archivo de imagen de mapa de bits para cada captura y seleccione una carpeta para que el programa almacene la pila de imágenes una vez grabada. A continuación, coloca una mosca muerta en una hoja de papel. Haga clic en el cuadro de configuración de video y, en la pestaña de configuración del dispositivo, ajuste la configuración hasta que el fondo blanco brillante esté en claro contraste con la mosca más oscura.

Haga clic en el botón de inicio para comenzar la grabación. Una vez finalizado el período de grabación, haga clic en el botón detener. La pila de imágenes debería estar ahora en la carpeta seleccionada para comenzar el ensayo de actividad locomotora.

Transfiera las moscas a viales individuales tapados con un tapón de algodón. Deje que las moscas se asienten sin ser molestadas durante 20 a 30 minutos antes de continuar. Pasado este tiempo, golpee suavemente la mosca que se va a analizar fuera del vial y debajo de la tapa de una placa de Petri.

La cubierta debe contener pequeñas ranuras para permitir el flujo de aire, colocando la mosca debajo de la cámara web configurada anteriormente. Cuando esté listo, presione inicio para comenzar a registrar la actividad locomotora. El primer paso del ensayo de convulsiones es alimentar a moscas sensibles a las convulsiones de dos días de edad, ya sea con medios estándar o con medios mezclados con el fármaco que se va a analizar.

Después de dos días de alimentación, transfiera las moscas golpeando suavemente los viales vacíos individuales y cubra los viales con un tapón de algodón. Deje que las moscas permanezcan tranquilas durante 20 minutos antes de observarlas. Cuando esté listo, haga un vórtice de un vial en un vórtice de laboratorio o use la configuración más alta durante 10 segundos.

Coloque inmediatamente la mosca inmovilizada en una hoja de papel blanca directamente debajo de la cámara web. Una vez en su lugar, comience a grabar. Esta actividad de moscas.

La mosca experimentará movimientos rápidos y descoordinados intercalados con períodos de parálisis. La grabación finaliza una vez que la mosca se ha enderezado. Para comenzar a analizar los datos, abra el software gratuito de procesamiento de imágenes image J una vez abierto.

Importe la pila de imágenes deseada haciendo clic primero en la pestaña de archivo y luego seleccionando importar. Y por último, la secuencia de imágenes. Seleccione la carpeta que contiene la pila de imágenes y abra una imagen.

Cuando se abra el cuadro de diálogo Opciones de secuencia, seleccione ordenar nombres numéricamente y, a continuación, seleccione. Bien. La pila de imágenes ahora se cargará en la imagen J.A continuación, seleccione la pestaña de imagen y establezca el tipo de valor en ocho bits. Haga clic en la pestaña de la imagen nuevamente y seleccione umbral en la opción de ajuste.

Esto establece el umbral en todas las imágenes para que cada una conste de un fondo blanco y la mosca se convierta en un punto negro. Esto también abre el cuadro de diálogo de umbral donde se pueden ajustar los puntos de corte. Escanee las imágenes para ver si alguna contiene puntos negros adicionales o si falta la mancha.

Si es necesario, ajuste el umbral para aliviar cualquier problema. Una vez realizados los ajustes, seleccione aplicar en el cuadro de diálogo del umbral. Cuando se abra el cuadro de diálogo Convertir en máscara, haga clic en Aceptar para establecer el umbral de la pila de imágenes.

Para medir el movimiento de la mosca en píxeles, seleccione el complemento de seguimiento múltiple en la pestaña de complementos. Cuando aparezca el cuadro de diálogo del rastreador de objetos, haga clic en las cuatro opciones dadas y seleccione. Bien. A continuación, el plugin multi tracker adjuntará coordenadas al negro.

en cada sector y enumere estos en la ventana de resultados, así como la longitud total en píxeles. La ventana de caminos ofrece la visualización gráfica del camino que tomó la mosca. Copie la lista de coordenadas X e Y de la ventana de resultados y pegue los datos en una hoja de cálculo de Excel.

Si alguna diapositiva de la pila no tiene un dibujo negro, el programa multi tracker se detendrá en esa diapositiva. Si esto ocurre, vuelva a umbral la pila para asegurarse de que la mosca se registre como negra.

en la diapositiva en cuestión. Para convertir las longitudes de ruta de píxeles a centímetros, tome una imagen de dos puntos espaciados a una distancia conocida en una hoja de papel blanco en blanco. Determine las coordenadas de píxeles XY para los dos puntos y utilice esta información para determinar el número de píxeles correspondientes a un centímetro para obtener resultados más precisos.

Elimine el ruido de las imágenes importando las coordenadas XY en un programa de análisis de moscas personalizado. Una vez abiertos, importe los datos de cada genotipo o tratamiento en hojas de cálculo separadas. A continuación, seleccione la pestaña de la hoja de resumen y haga clic en el botón haga clic en mí.

Seleccione un valor umbral de acuerdo con el tipo de análisis, haga clic en Aceptar y el programa calculará la velocidad, el tiempo y la distancia de movimiento. Estas trayectorias representativas muestran una actividad similar a la de las convulsiones en moscas mutantes con y sin tratamiento con metformina. La actividad convulsiva disminuyó con el tratamiento en los dos mutantes probados.

La metformina redujo significativamente tanto la distancia recorrida durante el ensayo de convulsiones como la duración total de la actividad similar a las convulsiones. Por el contrario, no hubo cambios en la velocidad media en estas trayectorias locomotoras individuales. El camino de la mosca CS de tipo salvaje muestra concentración alrededor de la periferia de la arena circular.

Mientras que la trayectoria de una mosca BSS mutante muestra la misma concentración, pero con menos movimiento en general. Cuando se probó la locomoción en un entorno nuevo, los mutantes BSS mostraron una reducción significativa en la longitud de la trayectoria en comparación con las moscas CS. El ensayo también detectó cambios en la velocidad de movimiento mientras la mosca CS exploraba durante el ensayo locomotor.

La mosca BSS permaneció relativamente inactiva durante todo el ensayo, excepto por algunos estallidos de actividad. Una de las cosas más importantes que hay que tener en cuenta al realizar cualquiera de estos ensayos de comportamiento con esta técnica es asegurarse de no anestesiar a las moscas antes de hacer las grabaciones. Resulta que la anestesia afectará tanto el comportamiento convulsivo como el comportamiento locomotor y puede alterar significativamente sus resultados.