Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

El objetivo general de este procedimiento es preparar una muestra para crioTEM mediante la extracción de una lámina de haz de iones enfocada de una muestra a granel congelada criogénicamente. Esto se logra mediante la primera inmersión, congelando la muestra en nitrógeno líquido y montándola dentro del haz de iones criofocalizado SEM. El segundo paso es cortar un delgado LA Melo con el haz de iones y transferirlo a una rejilla TEM por medio de un nano manipulador enfriado.

A continuación, la red TEM se transfiere del soporte SEM al soporte TEM en una estación de transferencia. El paso final es la transferencia del soporte de TEM al TEM criogénico para su posterior análisis. En última instancia, el crio-TEM se utiliza para mostrar imágenes de alta resolución, tomo Grahams o mapas de rayos X de la laminilla extraída.

Esta técnica nos permitirá analizar la materia blanda con máxima resolución en el microscopio electrónico de transmisión preseleccionando el lugar de análisis mediante otras microscopías como la microscopía óptica o la electromicroscopía de barrido. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la criomicrotomía Mac, es que se evitan los artefactos de preparación, como la compresión y la formación de def de la muestra. En primer lugar, monte dos rejillas TEM para muestras de haces de iones enfocados.

En el soporte de transferencia SEM, asegure las rejillas apretando los tornillos correspondientes con un destornillador y cierre los obturadores, monte un trozo de muestra apropiado para la muestra y agregue una parte de la muestra. Por ejemplo, use una pipeta para depositar gotas en un trozo plano. A continuación, monte el soporte de transferencia SEM en el dispositivo de transferencia de vacío o VTD.

Después de agregar nitrógeno líquido a la estación de fangizado y bombear hacia abajo, abra la estación y congele la bomba del soporte de transferencia SEM nuevamente hasta que se complete la ebullición y se obtenga nuevamente el aguanieve. A continuación, retraiga el soporte de transferencia SEM en la cámara de vacío del VTD y séllelo. Ventile la estación de fango y la cámara de preparación criogénica Airlock ventile la esclusa de aire exterior.

A continuación, haga coincidir el sello VTD con la esclusa de aire de la cámara de preparación criogénica y la bomba. Cuando se alcance un buen nivel de vacío, mida el pasador de la esclusa de aire para abrir el sello del VTD y la esclusa de aire exterior. A continuación, inserte el soporte de transferencia SEM.

A continuación, utilice un cuchillo frío para abrir las tapas protectoras de las ranuras de la rejilla TEM. Apague la alta tensión en el haz de iones enfocado SEM y abra la esclusa de aire interior. A continuación, utilice el VTD para transferir el soporte SEM a la cámara de muestras.

Una vez que el soporte SEM esté en la etapa fría, desacople el VTD empujando y girando. Retraiga la varilla VTD completamente dentro de la cámara de vacío VTD y cierre la esclusa de aire interior, la esclusa de aire exterior y el sello VTD. En este punto, caliente el gas precursor a 24 a 26 grados Celsius y coloque el sistema de inyección de gas o la aguja GIS a una altura de aproximadamente un milímetro por encima de la superficie de la muestra.

Mientras toma imágenes con el haz de electrones, abra la válvula de gas durante unos segundos. A continuación, cure el depósito en la región de interés, o ROI, utilizando un haz de iones de 1000 picos amperios a bajo aumento. Después del curado, incline la muestra a 52 grados para que la superficie quede perpendicular al haz de iones.

Moler lejos. Dos trincheras terroristas. A cada lado del ROI, incline la muestra hacia atrás a cero grados y use el haz de iones para cortar los lados y la parte inferior de la lámina, asegurándose de que las marcas de corte atraviesen toda la lámina.

Una vez introducida la aguja GIS, maniobrar el nano manipulador hasta que su punta esté en contacto físico con la lámina, preferiblemente en el lateral. Abra la válvula GIS durante unos segundos y controle la deposición criogénica mediante imágenes continuas con el haz de electrones. Cuando se haya depositado una capa adicional de platino de uno a dos micrómetros, cierre la válvula después de curar el platino solo en los pocos micrómetros alrededor del punto donde el nanomanipulador está en contacto con la lámina.

A continuación, utilice una corriente de haz de iones alta para cortar la lámina libremente. Maniobre con cuidado el nanomanipulador para extraer la lámina de las zanjas y muévala al menos 500 micrómetros por encima de la superficie de la muestra. Después de retraer la aguja, baje la etapa de muestra unos milímetros y muévala hasta que una de las rejillas TEM esté a la vista.

Mueva el área de fijación de la rejilla a la posición de trabajo e inserte la aguja GIS. A continuación, maniobre con cuidado el nano manipulador para que la lámina adjunta entre en contacto físico con el área de fijación en la rejilla TEM, abra la válvula de gas durante unos segundos y deposite criogénicamente una capa adicional de uno a dos micrómetros de platino para curar el platino solo en unos pocos micrómetros alrededor del punto de contacto entre la lámina y la rejilla TEM. A continuación, utilice una corriente de haz de iones alta para cortar la lámina y liberarla del nano manipulador.

Incline la muestra a 52 grados y use el haz de iones para diluirla hasta la transparencia de electrones. Después de enjuagar la estación de transferencia criogénica con gas nitrógeno seco, inserte el soporte TEM de transferencia criogénica en la ranura adecuada de la estación de transferencia criogénica y llénelo con nitrógeno líquido. A continuación, sumerja un destornillador, la herramienta de sujeción de muestras TEM y las pinzas en un recipiente criogénico lleno de nitrógeno líquido para enfriar sus puntas a la temperatura deseada.

Una vez que el VTD esté emparejado con la esclusa de aire exterior, lleve la etapa fría a la altura de transferencia de 16 milímetros. Después de apagar la alta tensión, abra el sello VTD, la esclusa de aire exterior y la esclusa de aire interior. A continuación, utilice la varilla VTD para bloquearla en el soporte de transferencia SEM empujando y girando en el sentido de las agujas del reloj.

En este punto, retraiga el soporte de transferencia SEM en la cámara de preparación criogénica. Utilice el cuchillo frío para cerrar las tapas protectoras de las rejillas TEM. A continuación, utilice la varilla VTD para mover la muestra a la cámara de vacío del cierre VTD y sellar la esclusa de aire.

A continuación, ventile la esclusa exterior y desconecte el VTD. Haga coincidir el VTD con el puerto SEM de la estación de transferencia criogénica. Mientras enjuaga con nitrógeno seco, use el pasador de la estación para abrir el sello del VTD y deslice el soporte de transferencia SEM en el hacedor de la estación de transferencia criogénica.

Con el destornillador enfriado, abra una de las tapas y afloje el tornillo correspondiente, manteniendo la rejilla TEM en su lugar. A continuación, recoge la rejilla TEM y colócala en el soporte TEM con las pinzas enfriadas. A continuación, fije la rejilla TEM en el soporte TEM.

Usando el anillo hexagonal enfriado, cierre el obturador del soporte TEM de transferencia criogénica y desconecte la estación de transferencia criogénica del sistema de bombeo. Transporte la estación y el controlador del calentador del soporte TEM cerca del TEM y vuelva a conectarlos. Ajuste la etapa de muestra TEM a una inclinación de menos 70 grados.

A continuación, configure el tiempo de bombeo más corto para la esclusa de aire con solo un ciclo de purga con gas nitrógeno seco. Retire el soporte TEM de la estación de transferencia criogénica e insértelo en la primera etapa del goniómetro inclinado, lo que iniciará el ciclo de bombeo. Una vez completado el ciclo, configure el goniómetro para que se incline hacia atrás a cero grados mientras sostiene el soporte TEM para que no gire con el goniómetro.

A continuación, inserte el soporte a través del goniómetro completamente dentro del TEM. Finalmente, rellene el soporte TEM de transferencia criogénica con nitrógeno líquido. En este método, las esporas de Aspergillus Niger se visualizan primero mediante SEM para identificar el sitio de extracción.

Una sección transversal de cualquier espora es suficiente, pero es posible posicionar el ROI para la extracción con una precisión submicrométrica para cortar una célula específica a una distancia específica de la membrana celular. Una vez que se ha identificado la característica de interés, se implementa el primer paso de la criodeposición: para proteger la muestra del daño del haz durante la molienda de iones, la muestra se inclina a 52 grados, seguido de la pulverización catódica de dos zanjas a ambos lados de la mella. A continuación, la muestra se inclina hacia atrás y se muele aún más, dejando sólo dos pequeños puentes que la conectan al bulto.

El nano manipulador enfriado se pone en contacto con la mella y otra criodeposición de platino los suelda. Los pequeños puentes de conexión se fresan y el nano manipulador mueve la lámina cerca del área de fijación de grado TEM, donde se suelda con una criodeposición final de platino. A continuación, el nanomanipulador se separa de la laminilla, que es delgada hasta la transparencia de los electrones.

Con el haz de iones, la lámina se transfiere al TEM, donde se pueden emplear espectroscopía de imágenes de alta resolución, tomografía y otras técnicas. Este método contribuirá a comprender las interfaces de la materia blanda del corazón en sistemas como las neurosondas o los implantes óseos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de cryo TM que son el artefacto tres y que se pueden extraer de una región específica de una muestra de insecto con una precisión submicrométrica.