Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la In vitro Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

El objetivo general de este procedimiento es incorporar genes gag derivados de individuos infectados del subtipo CHIV one en un plásmido VIH uno competente para la replicación. Con el fin de evaluar el efecto de los polimorfismos de la secuencia gag sobre la capacidad de replicación in vitro del VIH uno, esto se logra amplificando primero el gen gag del plasma del paciente. El segundo paso es clonar la secuencia gag derivada del paciente en el clon molecular infeccioso competente de replicación MJ 4.

A continuación, se transfecta el plásmido de quimera gag MJ four para generar stocks virales infecciosos y se valora para evaluar la infectividad en una línea celular indicadora. El paso final es medir la capacidad de replicación in vitro en la línea de células T G XR 25. En última instancia, se utiliza un ensayo de transcriptasa inversa marcado por radio para cuantificar la producción de viriones a lo largo del tiempo con el fin de visualizar la cinética de replicación viral.

El método que vamos a describir hoy puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH. Estos incluyen la definición de los determinantes de la aptitud replicativa del VIH y la comprensión de cómo la aptitud del VIH afecta la patogénesis a largo plazo. Los descritos de los métodos de hoy serán por Jessica Prince y Dan Klaban, dos de mis estudiantes de posgrado.

Para comenzar este procedimiento, transcriba inversamente CDNA a partir de ARN y amplifique los productos de ADN de primera ronda utilizando transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable en una RT PCR de un solo paso. A continuación, utilizando un microlitro de la amplificación de PCR de primera ronda como plantilla de ADN, realice una amplificación de PCR de segunda ronda anidada. A continuación, agregue tres microlitros de tinte de carga cinco veces a cinco microlitros del volumen de reacción de la segunda ronda.

Hágalo funcionar a 120 voltios en un gel TAE al 1% que contenga una tinción de ADN fluorescente UV hasta que se resuelvan las bandas. A continuación, visualice las bandas de 1,6 KB en un iluminador de luz azul. Después de eso, ejecute el volumen de reacción de 45 microlitros restante en un gel TAE al 1%aros que contenga la tinción de ADN.

Extirpe las bandas apropiadas con una hoja de afeitar limpia y combine tres reacciones positivas por individuo. Posteriormente, extraiga el ADN de la rodaja de gel utilizando un kit de purificación de gel y cúbralo en el agua libre de nucleasas. Congele el producto a menos 20 grados centígrados para usarlo más adelante en este procedimiento.

Después de amplificar el terminal largo, repita cinco regiones UTR principales del plásmido MJ cuatro. Visualice los productos de PCR de 1,3 KB en el iluminador, elimine los amplicones positivos y, a continuación, purifíquelos y congélelos como se ha descrito anteriormente. A continuación, cree los amplicones de mordaza MJ de cuatro LTR fusionados a través de PCR de extensión de superposición de empalme.

Visualice, extirpe, purifique y congele el amplicón de 3,2 kb de largo. Ahora digiera 1,5 microgramos de plásmido MJ cuatro y 1,5 microgramos de producto de PCR LTR purificado con endonucleasa de restricción BCL one durante 1,5 horas a 50 grados Celsius. Posteriormente, se añade un microlitro de NGOM cuatro a la reacción de digestión y se incuba a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de eso, agregue cinco veces el tinte de carga a las reacciones de digestión de restricción. Electroforesis lentamente el volumen total en un gel TAE al 1%aros que contiene una tinción de ADN A durante una o dos horas a 100 voltios. Visualizar, extirpar y purificar las bandas indicadas para la clonación como se ha descrito anteriormente.

A continuación, prepare las reacciones de ligadura con una mordaza LTR purificada. Inserte un ADN de cuatro vectores MJ en una proporción de inserción a vector de tres a uno. Incubar las reacciones de ligadura durante la noche a cuatro grados centígrados.

A continuación, transforme las bacterias JM 1 0 9 químicamente competentes con productos de ligadura esparcidos en placas de barrena LB con 100 microgramos por mililitro. La ampicilina hace crecer bacterias transformadas a 30 grados centígrados durante al menos 22 horas. Para confirmar la fidelidad de la clonación, corte el ADN de la mini preparación con las enzimas de restricción NGO M four y HPA one en una doble digestión a 37 grados centígrados durante dos horas.

Después, analízalo en un 1%aros. Gel TAE. Calcule el volumen de virus necesario de cada stock en función de la UI por título de microlitro de un ensayo de células TZM BL para infectar cinco veces 10 a la quinta G XR dos cinco células con una multiplicidad de infección de 0,05.

Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado para trabajar con el VIH competente para la replicación, que incluye una bata completa, una mascarilla y guantes dobles el día de la infección. Retire las existencias de virus del congelador a menos 80 grados centígrados y descongele. A continuación, diluya el virus en medios C-R-P-M-I hasta un volumen de 100 microlitros.

Con el fin de lograr un MOI de 0,05, agréguelo a la placa de 96 pocillos tratados con cultivo de tejido vbo, incluyendo un control positivo y otro negativo en cada conjunto de experimentos de replicación y configure la placa de manera que todas las demás columnas estén en blanco para limitar la contaminación cruzada entre pocillos. Después, cuente las dos cinco células GXR utilizando un contador de células automatizado y calcule el número de células necesarias en total para todas las infecciones. Alícuota el volumen requerido en un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga para peletizar las celdas.

A continuación, aspire el medio con cuidado y vuelva a suspender en C-R-P-M-I a una concentración de cinco veces 10 a la quinta célula por cada 100 microlitros, pipetee las células en un canal estéril y mezcle bien. A continuación, con una pipeta multicanal, añadir 100 microlitros de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene el virus diluido y mezclar bien. Después de eso, agregue dos microlitros de cinco miligramos por mililitro de solución de policerebro a cada pocillo y mezcle bien las células.

A continuación, incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos con 5%CO2 durante tres horas para lavar las células infectadas y centrifugarlas. La placa inferior en V de 96 pocillos para peletizar las células. Luego, retire con cuidado 150 microlitros del medio y reemplácelo con 150 microlitros nuevos de C-R-P-M-I sin alterar la pellet de celda.

Repita el procedimiento dos veces más para lavar suficientemente las células después de la última centrifugación y la adición de 150 microlitros de C-R-P-M-I resuspenda el pellet de células con una pipeta multicanal. Agregue la mezcla de cada pocillo a 800 microlitros de C-R-P-M-I en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos con un 5% de CO2 a 37 grados centígrados cada dos días.

Transfiera 100 microlitros de sobrenadante desde la superficie del pocillo de cultivo a un pocillo de una placa inferior de 96 pocillos y congele para su posterior análisis utilizando el ensayo RT, luego vuelva a suspender las células completamente y elimine la mitad del volumen restante para evitar el crecimiento excesivo de células. Después de eso, restaure el volumen original agregando 550 microlitros de C-R-P-M-I fresco a cada pocillo en este procedimiento, agregue uno a dos microlitros de 10 milicurios por mililitro de DTTP y cuatro microlitros de un molar DIO tres etol a cada alícuota de un mililitro de nuestra mezcla maestra. Mezcle cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de mezcla maestra RT DTT y DTTP con una pipeta de 1000 microlitros y transfiéralo a un canal estéril.

A continuación, dispense 25 microlitros de RT etiquetado. Mezcle en cada pocillo de una placa de PCR de pared delgada de 96 pocillos. Agregue cinco microlitros de cada sobrenadante a la placa de PCR que contiene la mezcla maestra RT. A continuación, selle la placa de PCR con una cubierta de papel de aluminio adhesivo e incube durante dos horas a 37 grados centígrados en un termociclador después de la incubación, haga pequeños agujeros en la cubierta de papel de aluminio con una pipeta multicanal de 200 microlitros.

Mezcle las muestras cinco veces. Transfiera cinco microlitros de cada muestra al papel DE 81 y deje que todas las muestras se sequen al aire durante 10 minutos. Coloque las manchas en recipientes de lavado separados.

A continuación, lave las manchas cinco veces con un XSSC. A continuación, dos veces con etanol al 90% durante cinco minutos por lavado antes de dejarlos secar al aire. Una vez seco, envuelva cuidadosamente la mancha en una envoltura de Saran y expóngala a la pantalla de fósforo en un casete herméticamente cerrado durante la noche a temperatura ambiente.

Una vez que esté listo, analice las pantallas de fosfo con un generador de imágenes de fosfoterapia y cuantifique las transcripciones radiactivas. Mostrado. Aquí están las imágenes de gel representativas que representan la separación electroforética de los diversos amplicones de PCR necesarios para generar un amplicón gag derivado del paciente capaz de clonarse en la columna vertebral del plásmido MJ cuatro. Esta imagen de gel representativa representa la separación electroforética de los digerentes de restricción para clonar genes gag del paciente en MJ four.

Y esta imagen de gel representativa representa la separación electroforética de la restricción, digiere un ADN de plásmido de cuatro quimeras MJ mordaza purificado. Este gráfico muestra la reproducibilidad del ensayo de replicación a lo largo del tiempo en la línea celular G XR two five. Se utilizaron cuatro virus quiméricos gag MJ para infectar G XR dos cinco células en dos experimentos independientes realizados con aproximadamente un año de diferencia.

Las puntuaciones de replicación se generaron calculando la pendiente de los valores de DLU transformados en tronalogías y normalizando esa pendiente al tipo salvaje MJ cuatro. Las dos mediciones independientes están fuertemente correlacionadas y ponen de manifiesto la reproducibilidad de los ensayos realizados en diferentes momentos y con células en diferentes pasajes. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH/SIDA exploraran los determinantes virales de la patogénesis.

En la infección aguda por el subtipo C, el subtipo más prevalente en todo el mundo. Trabajar con un VIH competente para la replicación puede ser extremadamente peligroso. Todos los pasos que involucren virus vivos deben realizarse en una instalación BSL two plus.

Todas las superficies deben descontaminarse regularmente y se deben usar guantes dobles en todo momento.