Name: Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la In vitro Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende a evaluar la capacidad de replicación del VIH-1 mediante clonación de genes gag derivados de pacientes en el plásmido MJ4. Este método permite cuantificar la producción de viriones y visualizar la cinética de replicación viral in vitro.

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Los investigadores agradecen a todos los voluntarios de Zambia que participaron en este estudio y a todo el personal del Proyecto de Investigación del VIH Zambia Emory en Lusaka que hizo posible este estudio. Los investigadores desean agradecer a Jon Allen, Smita Chavan y Mackenzie Hurlston por la asistencia técnica y la gestión de las muestras. También nos gustaría agradecer al Dr. Mark Brockman por sus discusiones y su generosa donación de las células GXR25.
Este estudio fue financiado por R01 AI64060 y R37 AI51231 (EH) y la Iniciativa Internacional para la Vacuna contra el SIDA. Este trabajo fue posible en parte gracias al generoso apoyo del pueblo estadounidense a través de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (USAID). Los contenidos son responsabilidad de los autores del estudio y no reflejan necesariamente las opiniones de USAID o del Gobierno de los Estados Unidos. Este trabajo también fue apoyado, en parte, por el Centro de Virología del Centro Emory para la Investigación del SIDA (Subvención P30 AI050409). DC y JP fueron apoyados en parte por Action Cycling Fellowships. Este trabajo fue financiado en parte por la beca base del Centro Nacional de Investigación de Primates de Yerkes (2P51RR000165-51). Este proyecto también fue financiado en parte por el Centro Nacional de Recursos de Investigación P51RR165 y actualmente cuenta con el apoyo de la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación/OD P51OD11132.

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a la longitud y el carácter técnico de este protocolo, hay varios pasos que son fundamentales tanto para la construcción exitosa de plásmidos Gag-MJ4 quiméricos, así como para la cuantificación de la capacidad de replicación viral. Aunque la estrategia de clonación basado enzima de restricción para la introducción de genes gag extranjera en MJ4 descrito en este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los métodos basados ​​en la recombinación utilizadas anteriormente, el protocolo puede ser técnicamente ...

Determinar el host y características virales que influyen en el VIH-1 patogénesis y progresión de la enfermedad es de suma importancia para el diseño racional de vacunas. La respuesta inmune celular es un componente clave de la respuesta inmune humana a la infección VIH-1. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son necesarios para el control inicial de la viremia aguda, y permiten al ordenador establecer un estado de equilibrio (set point) de la carga viral 1,2. Experimental agotamiento de estas células efectoras se traduce en la pérdida de control viral 3,4. A pesar de esto, escapan mutaciones surgen dentro del genoma viral que subvertir reconocimiento de CTL de las células infectadas viralmente 5-9. Ciertos alelos HLA se han asociado con cargas virales más bajas y más lenta progresión de la enfermedad, incluido el B * 57, B * 27 B * 81 y 10-15. Parte de los beneficios de protección de los alelos HLA de clase I se puede atribuir al hecho de que se tengan en regiones funcionalmente limitados del genoma, tales como Gagy seleccionar para mutaciones de escape que disminuyen la capacidad del virus para replicarse in vitro 16-21. Aunque escape del sistema inmune celular es beneficioso para el virus en el contexto de la selección de HLA de clase I alelo, el efecto de estas mutaciones puede tener consecuencias diferenciales para el huésped tras la transmisión a un individuo HLA no coincidentes 22,23. Por lo tanto, la comprensión de los efectos de la transmisión mutaciones de escape HLA-asociada a la capacidad de replicación viral será importante para mejorar nuestra comprensión de los principios de VIH-1 patogénesis. Si bien se ha avanzado mucho para identificar y caracterizar los defectos de la aptitud de mutaciones de escape individuales asociados a una clase de HLA I alelos 24-29, de origen natural aislados HIV-1 han huellas únicas y complejas de los polimorfismos asociados-HLA, probablemente derivado de la HLA presión inmune mediada de diferentes orígenes immunogenetic 30. En apanálisis de la mera existencia, Goepfert et al. mostró que una acumulación de mutaciones asociadas a HLA en las secuencias de la mordaza de transmisión derivados de 88 Zambianos infectadas de forma aguda se asoció con una reducción en la carga viral del punto de ajuste 31. Esto sugirió que la transmisión de mutaciones de escape nocivos, específicamente en Gag, a los destinatarios-HLA no coincidentes proporciona un beneficio clínico, y puede ser debido a la replicación viral atenuada. De cara al futuro, es imprescindible para estudiar cómo las combinaciones de los polimorfismos de la mordaza del complejo dentro de los aislamientos naturales trabajan en conjunto para definir las características del virus de transmisión, tales como la capacidad de replicación, y cómo la replicación temprana podría a su vez afectar el VIH-1 parámetros clínicos y de la última etapa patogénesis. Brockman et al. Demostró por primera vez un vínculo entre la capacidad de replicación de secuencias-gag pro aislado durante la infección etapa crónica y la carga viral tanto en el subtipo C y las infecciones B32-35. El enfoque experimental se presenta en estos estudios, aunque apropiado para examinar la capacidad de replicación in vitro de secuencias derivadas de individuos con infección crónica, tiene varias advertencias y limitaciones técnicas que hacen que estudian el VIH-1 capacidad replicativa en el subtipo C individuos infectados de forma aguda difícil. Este método se basa en la recombinación de secuencias basadas población amplificados por PCR en el subtipo B NL4-3 provirus, que se deriva en parte de LAV, un laboratorio adaptado stock de virus 36. Generación de virus se realizó por co-transfección de una línea de células T CEM basada en 37 con amplicones de PCR y se digirió ADN NL4-3 delta pro-gag. Este método requiere la consecuencia de virus durante un período de semanas a meses, potencialmente sesgar la naturaleza del stock de virus recuperado en relación con las cuasiespecies virales in vivo, y por lo tanto alterar la medición de la capacidad de replicación in vitro. Este método is más apropiado para el estudio de los individuos infectados crónicamente, donde se selecciona de manera efectiva para el virus de la más alta capacidad replicativa, y donde la clonación de numerosos diferentes variantes virales a partir de un gran número de individuos infectados crónicamente es bastante mano de obra intensiva y por lo tanto no es factible. Sin embargo, dentro de un individuo infectado de forma aguda, hay generalmente uno y cincuenta y nueve variantes presentes, y eliminando así el riesgo de sesgo de la naturaleza del stock de virus recuperado, a través de presiones de selección in vitro, permite una evaluación más precisa de la capacidad de replicación in vitro. En segundo lugar, este método requiere la recombinación de secuencias gag-pro subtipo C en una columna vertebral derivada subtipo B, y podría introducir sesgos de incompatibilidad columna vertebral en el análisis. Debido a estas limitaciones, un gran número de secuencias deben ser analizados con el fin de superar las posibles sesgos introducidos. Aquí describimos una apro experimental alternativoach apropiada para el estudio de secuencias derivadas del subtipo C individuos con infección aguda. Utilizamos una estrategia de clonación basada en la enzima de restricción para introducir el gen gag derivado de puntos de tiempo infección aguda de los individuos infectados por VIH-1 subtipo C en la cadena principal proviral subtipo C, MJ4. El uso de MJ4 como una red troncal común en el que para clonar genes gag es crucial para el análisis de subtipo C secuencias derivadas. MJ4 se deriva de un aislado primario 38, y por lo tanto sería menos probable que introducir un sesgo debido a la incompatibilidad subtipo entre la columna vertebral y el gen gag. Además, el enfoque de la utilización de la clonación restricción basada enzima permite la proviral construye a transfectar directamente en células 293T, y para la recuperación de un virus clonal de stock idéntica a la secuencia gag clonado. El método presentado a continuación es un método de alto rendimiento para evaluar la capacidad de replicación del subtipo C derivada Gag-MJ4virus quiméricos. La transfección en células 293T es sencillo y recuperación de virus toma sólo tres días. In vitro la capacidad de replicación se ensayó en la misma línea de células T basado CEM-CCR5 creado por Brockman et al. 37, pero utilizando importantes modificaciones de protocolo necesaria para la replicación exitosa del subtipo C MJ4 virus quiméricos. El uso de una línea de células T apropiada en lugar de PBMC permite un gran número de virus quimérico MJ4 subtipo C de la prueba con alta reproducibilidad del ensayo. Por último, utilizando un ensayo radiomarcado de la transcriptasa inversa para la cuantificación de virus en el sobrenadante es más rentable que el uso de kits de ELISA de p24 disponibles comercialmente. También le da un rango dinámico más alto, lo cual era importante para la detección de los virus de mal y altamente replican dentro del mismo ensayo y para detectar diferencias sutiles en la replicación entre los aislados. En conclusión, el método que aquí se presenta ha permitidoel estudio en profundidad de la capacidad de replicación de secuencias gag derivados de VIH-1 subtipo C infecta de forma aguda las personas de Zambia, y tal como está escrita, también podría ampliarse para estudiar otro subtipo C poblaciones infectadas. Se observó un alto grado de variación en las capacidades de replicación entre los diferentes aislados de la mordaza. Además, hemos sido capaces de demostrar una asociación estadística entre la capacidad de replicación del Gag transmitida y el punto de ajuste de la carga viral, así como con CD4 + descenso durante un período de tres años 39. Estos resultados destacan la importancia de estudiar las características virales cómo transmitidos, tales como la capacidad de replicación, interactúan con el sistema inmune del huésped para influir en la patogénesis durante la infección temprana y serán integrales para el desarrollo de intervenciones de vacunas eficaces, así como el tratamiento.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><reactivos >de PCRstrong></</td></tr><tr><td>strongGOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalinización estándar</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalar estándar</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTCTCCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt estándar</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Oligo personalizado</td><td>25 nmol, desalación estándar</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalinización estándar</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Fabricado por Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Tiras, Azul (Tapa Plana)</td><td>Sistema</td><td></td> de RT-PCR de un solo paso Daigger EF3647BX <td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II ADN polimerasa</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Mezcla</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, alta resistencia al gel</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb Escalera de ADN</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Fabricado por Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y Sistema de limpieza para PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Fabricado por Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Reactivos de clonación</agar fuerte></td></tr><tr><td>LB, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 100 x 15 mm placas de Petri de poliestireno</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>Endonucleasa de restricción NgoMIV</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasa de restricción de BclI</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasa de restricción HpaI</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>células competentes JM109, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield sistema de minipreparación de plásmido</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl limpiador/desinfectante</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Fabricado por Promega</td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Placas Costar, 6 pocillos, planas</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Placas Costar, 24 pocillos, planas</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Placas Costar, 96 pocillos, redondas</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 ml, tapón azul</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Fabricado por BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 15 ml, tapón azul</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Fabricado por BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Fabricado por Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS con magnesio y calcio, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin magnesio y calcio</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Sarstedt, colores variados</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de depósito para Multicanal, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextrano</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 pocillos transparente microplaca tratada con cultivo de tejidos con fondo en V</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Solución tampón</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Definido, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Fabricado por Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldehído, Grado II, 25% en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solución de cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído, para biología molecular, 36.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potasio hexacianoferrato (II) trihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potasio(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X15-R</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision microscopio invertido</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><reactivos > ensayo de cuantificación de transcriptasa inversa fuerte</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen 15568025</td><td></td><td>Debe ajustarse a pH 7.8 con KOH</td></tr><tr><td>2 M Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust a 1 M solución</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Ácido poliadenilico (Poly rA) sal de potasio&nbsp;</td><td>Reactivo de Midland Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) imprimación</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, Pantalla de Fósforo de Super Resolución, Pequeña</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell Modelo de placa de 96 pocillos (M) Policarbonato</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Cinta de sellado de aluminio de microplaca de 96 pocillos Corning, no estéril</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Fabricado por Corning Life</td></tr><tr><td>Papel de intercambio aniónico DE-81</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de autorradiografía</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Criba de almacenamiento ciclónico Packard</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; in vitro</em&gt; capacidad de replicación del vih-1 subtipo c gag-mj4 quiméricos virus

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

El efecto protector de muchos alelos HLA de clase I sobre la patogénesis del VIH-1 y la progresión de la enfermedad se atribuye, en parte, a su capacidad para dirigirse a partes conservadas del genoma del VIH-1 que escapan con dificultad. Los cambios en la secuencia atribuidos a la presión inmunitaria celular surgen en todo el genoma durante la infección y, si se encuentran dentro de regiones conservadas del genoma, como Gag, pueden afectar la capacidad del virus para replicarse in vitro. La transmisión de polimorfismos ligados a HLA en Gag a receptores no compatibles con HLA se ha asociado con cargas virales de punto de ajuste reducidas. Nuestra hipótesis puede deberse a una capacidad de replicación reducida del virus. Aquí presentamos un método novedoso para evaluar la replicación in vitro del VIH-1 influenciada por el gen gag aislado de puntos de tiempo agudos de zambianos infectados por el subtipo C. Este método utiliza la clonación basada en enzimas de restricción para insertar el gen gag en una columna vertebral proviral del VIH-1 de subtipo C común, MJ4. Esto lo hace más apropiado para el estudio de secuencias de subtipo C que los métodos anteriores basados en recombinación que han evaluado la replicación in vitro de secuencias gag-pro derivadas crónicamente. Sin embargo, el protocolo podría modificarse fácilmente para estudios de virus de otros subtipos. Además, este protocolo detalla un método robusto y reproducible para evaluar la capacidad de replicación de los virus quiméricos Gag-MJ4 en una línea de células T basada en CEM. Este método se utilizó para el estudio de los virus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente por el subtipo C, y ha permitido la identificación de residuos en Gag que afectan a la replicación. Más importante aún, la implementación de esta técnica ha facilitado una comprensión más profunda de cómo la replicación viral define los parámetros de la patogénesis temprana del VIH-1, como la carga viral de punto de ajuste y la disminución longitudinal de las células T CD4+.

Para ejecutar correctamente este protocolo, lo que crea un plásmido proviral capaz de ensamblar completamente funcionales, infecciosas quimeras Gag-MJ4, el gran cuidado se debe tomar para generar los amplicones PCR apropiados. Determinación de si la PCR ha generado el amplicón de la mordaza de tamaño adecuado es crucial. Los productos deben estar dentro de 100 pares de bases (pb) de la amplificación de aproximadamente 1700 pb se muestra en la Figura 1A. La longitud exacta de este fragmento vari...

La patogénesis del VIH-1 se define tanto por las características virales como por los factores genéticos del huésped. Aquí describimos un método robusto que permite mediciones reproducibles para evaluar el impacto de la variación de la secuencia del gen gag en la capacidad de replicación in vitro del virus.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

El objetivo general de este procedimiento es incorporar genes gag derivados de individuos infectados con el subtipo C del VIH-1 en un plásmido de VIH-1 con capacidad de replicación, con el fin de evaluar el efecto de los polimorfismos en la secuencia de gag sobre la capacidad de replicación del VIH-1 in vitro. Esto se logra primero amplificando el gen gag a partir del plasma del paciente. El segundo paso consiste en clonar la secuencia de gag derivada del paciente en el clon molecular infeccioso y con capacidad de replicación MJ-four. A continuación, el plásmido quimérico gag-MJ-four se transfecta para generar partículas virales infecciosas, las cuales se titulan para evaluar su infectividad en una línea celular indicadora. El paso final consiste en medir la capacidad de replicación in vitro en la línea celular T GXR-25. En última instancia, se utiliza un ensayo de transcriptasa inversa marcada con radioisótopos para cuantificar la producción de viriones a lo largo del tiempo y así visualizar la cinética de replicación viral.El método que vamos a describir hoy puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH. Estas incluyen definir los determinantes del fitness replicativo del VIH y comprender cómo el fitness del VIH afecta la patogénesis a largo plazo. Describiendo los métodos hoy estarán Jessica Prince y Dan Claiborne, dos de mis estudiantes de posgrado.Para comenzar este procedimiento, transcriba a la inversa el ADNc a partir de ARN y amplifique los productos de ADN de la primera ronda utilizando transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable en una RT-PCR en un solo paso. Luego, utilizando un microlitro de la amplificación por PCR de la primera ronda como molde de ADN, realice una amplificación por PCR anidada de segunda ronda. A continuación, agregue tres microlitros de colorante de carga 5X a cinco microlitros del volumen de reacción de la segunda ronda.Correrlo a 120 voltios en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga un colorante fluorescente para ADN sensible a UV hasta que las bandas se separen. Luego, visualizar las bandas de 1,6 kb en un iluminador de luz azul. A continuación, correr el volumen restante de la reacción, de 45 microlitros, en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga el colorante para ADN. Recortar las bandas apropiadas con una cuchilla limpia y combinar tres reacciones positivas por individuo. Posteriormente, extraer el ADN del trozo de gel utilizando un kit de purificación de geles y eluirlo en agua libre de nucleasas. Congelar el producto a menos 20 grados Celsius para su uso posterior. 0:15:56 En este procedimiento, tras amplificar la región del extremo repetido largo (LTR) del extremo 5’ UTR del plásmido MJ-four, visualizar los productos de PCR de 1,3 kb en el iluminador. Recortar los amplicones positivos, luego purificarlos y congelarlos como se describió anteriormente. A continuación, crear los amplicones fusionados LTR-gag del MJ-four mediante PCR de extensión por traslape (SOE-PCR). Visualizar, recortar, purificar y congelar el amplicón largo de 3,2 kb. Ahora digerir 1,5 microgramos del plásmido MJ-four y 1,5 microgramos del producto de PCR purificado LTR-gag con la endonucleasa de restricción BCL-one durante 1,5 horas a 50 grados Celsius. Posteriormente, añadir un microlitro de NGOM-four a la reacción de digestión e incubarla a 37 grados Celsius durante una hora. Después, añadir colorante de carga 5x a las reacciones de digestión con enzimas de restricción. Realizar lentamente la electroforesis del volumen total en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE que contenga un colorante para ADN, durante una a dos horas a 100 voltios. Visualizar, recortar y purificar las bandas indicadas para clonación como se describió previamente.A continuación, prepare las reacciones de ligación utilizando el inserto purificado de LTR-gag y ADN del vector MJ-four en una proporción de tres a uno de inserto respecto al vector. Incube las reacciones de ligación durante la noche a cuatro grados Celsius.Luego, transforme bacterias JM-109 químicamente competentes con los productos de ligación y siémbrelos en placas de agar LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Cultive las bacterias transformadas a 30 grados Celsius durante al menos 22 horas. Para confirmar la fidelidad del clonado, corte el ADN de mini prep con las enzimas de restricción NGOM-four y HPA-one en un doble digestión a 37 grados Celsius durante dos horas.Posteriormente, analícelo en un gel de agarosa TAE al 1%. Calcule el volumen de virus necesario de cada stock en función del título en UI por microlitro obtenido mediante un ensayo en células TZM-BL, con el fin de infectar cinco veces 10 a la quinta células GXR-25 a una multiplicidad de infección de 0,05. Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado para trabajar con VIH con capacidad de replicación, que incluye bata completa, mascarilla facial y doble guante. El día de la infección, retire los stocks de virus del congelador a menos 80 grados Celsius y deshiélelos. A continuación, diluya el virus en medio C-R-P-M-I hasta un volumen de 100 microlitros, para alcanzar un MOI de 0,05. Agréguelo a la placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo en V, incluyendo tanto un control positivo como un control negativo en cada serie de experimentos de replicación, y prepare la placa de manera que cada dos columnas estén vacías para limitar la contaminación cruzada entre los pocillos. Posteriormente, cuente las células GXR-25 utilizando un contador celular automatizado y calcule el número total de células necesarias para todas las infecciones. Aliquote el volumen requerido en un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue para obtener el pellet celular. Luego aspire cuidadosamente el medio y resuspenda en C-R-P-M-I a una concentración de cinco veces 10 a la quinta células por 100 microlitros. Transfiera las células con una pipeta a una cubeta estéril y mezcle bien. Posteriormente, utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de células a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenga el virus diluido y mezcle completamente. Después, añada dos microlitros de una solución de polibreno a cinco miligramos por mililitro a cada pocillo y mezcle bien las células. A continuación, incube a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular con 5% de CO2 durante tres horas.Para lavar las células infectadas, centrifugue la placa de 96 pocillos en forma de V para sedimentar las células. Luego, retire cuidadosamente 150 microlitros del medio y sustitúyalo por 150 microlitros frescos de C-R-P-M-I sin perturbar el sedimento celular. Repita el procedimiento dos veces más para lavar adecuadamente las células. Después de la última centrifugación y la adición de 150 microlitros de C-R-P-M-I, resuspenda el sedimento celular con una pipeta multicanal. Añada la mezcla de cada pocillo a 800 microlitros de C-R-P-M-I en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. A continuación, coloque la placa en un incubador de cultivo celular con 5% de CO₂ a 37 grados Celsius. Cada dos días, transfiera 100 microlitros de sobrenadante desde la superficie del pocillo de cultivo a un pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de U y congélelos para su posterior análisis mediante el ensayo de RT. Luego, resuspenda completamente las células y retire la mitad del volumen restante para evitar el sobrecrecimiento celular. A continuación, restablezca el volumen original añadiendo 550 microlitros de C-R-P-M-I fresco a cada pocillo. En este procedimiento, agregue uno a dos microlitros de DTTP de 10 milicurios por mililitro y cuatro microlitros de DTT uno molar a cada alícuota de un mililitro de la mezcla maestra de RT. Mezcle cuidadosamente cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros de mezcla maestra de RT, DTT y DTTP con una pipeta de 1000 microlitros y transfiera a una cubeta estéril.A continuación, distribuya 25 microlitros de la mezcla de RT marcada en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos con paredes delgadas. Añada cinco microlitros de cada sobrenadante a la placa PCR que contiene la mezcla maestra de RT. Luego selle la placa PCR con una cubierta de lámina adhesiva e incube durante dos horas a 37 grados Celsius en un termociclador. Tras la incubación, haga pequeños orificios en la cubierta de lámina usando una pipeta multicanal de 200 microlitros. Mezcle las muestras cinco veces. Transfiera cinco microlitros de cada muestra a papel DE-81 y deje secar al aire todas las muestras durante 10 minutos. Coloque las tiras en recipientes de lavado separados. Posteriormente, lave las tiras cinco veces con SSC 1X. A continuación, lávelas dos veces con etanol al 90 % durante cinco minutos por cada lavado antes de dejarlas secar al aire. Una vez secas, envuelva cuidadosamente la tira en papel plástico transparente y expóngala a la pantalla fosforescente en una caja hermética durante toda la noche a temperatura ambiente.Una vez listo, analice las pantallas fosfo con un imagenador de fósforo y cuantifique los transcritos radiactivos.Se muestran aquí imágenes representativas de geles que ilustran la separación electroforética de los diversos amplicones PCR necesarios para generar un amplicón de gag derivado de paciente, capaz de clonarse en el vector plasmídico MJ-four. Esta imagen representativa de gel muestra la separación electroforética de digestiones con enzimas de restricción para la clonación de genes gag de pacientes en MJ four.Y esta imagen representativa de un gel muestra la separación electroforética de digestiones con enzimas de restricción de un ADN plasmídico purificado del quimera gag MJ-cuatro. Este gráfico muestra la reproducibilidad del ensayo de replicación a lo largo del tiempo en la línea celular GXR-25. Se utilizaron los mismos virus quiméricos gag MJ-cuatro para infectar células GXR-25 en dos experimentos independientes realizados aproximadamente con un año de diferencia.Los puntajes de replicación se generaron calculando la pendiente de los valores de DLU transformados logarítmicamente y normalizando dicha pendiente respecto al tipo silvestre MJ-four. Las dos mediciones independientes están fuertemente correlacionadas y resaltan la reproducibilidad de los ensayos realizados en diferentes momentos y con células en distintos pasajes. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH/sida exploren los determinantes virales de la patogénesis, en la infección aguda por subtipo C, el subtipo más prevalente en el mundo. Trabajar con VIH con capacidad de replicación puede ser extremadamente peligroso. Todos los pasos que involucren virus vivos deben realizarse en una instalación BSL dos más. Todas las superficies deben descontaminarse regularmente y debe usarse doble guante en todo momento.

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Inmunología e Infección

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

La competencia de crecimiento entre virus casi isogénicos proporciona una medida sensible para determinar la aptitud relativa para la replicación. Los protocolos descritos aquí incluyen la construcción de clones recombinantes de VIH-1, la propagación del virus y la competencia de crecimiento y métodos de análisis optimizados para producir resultados sensibles y consistentes.

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Presentamos un flujo de trabajo de ingeniería de genoma por la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por VIH-1 que recapitular integración proviral en sitios genómicos. Ataques contra reporteros derivados del VIH es facilitada por la manipulación del genoma mediada por Cas9 CRISPR, site-specific. Cuentan con protocolos detallados unicelular clon generación, detección y verificación dirigida a corregir.

Ingeniería de genoma CRISPR Cas9 basado en generar modelos de Jurkat reportero para infección por VIH-1 con los sitios seleccionados integración Proviral

Aquí presentamos un enfoque de secuenciación profunda que proporciona una determinación imparcial de naciente 3'-termini, así como perfiles mutacionales de moléculas de ADN monocatenario. La principal aplicación es la caracterización de los nacientes DNAs complementarios retrovirales (cADN), los intermedios generados durante el proceso de transcripción inversa retroviral.

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Aprende a evaluar la capacidad de replicación del VIH-1 mediante clonación de genes gag derivados de pacientes en el plásmido MJ4. Este método permite cuantificar la producción de viriones y visualizar la cinética de replicación viral in vitro.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la In vitro Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus (Video) | JoVE Journal

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