一种基于限制性内切酶的克隆方法用于评估 体外 HIV-1 C亚型Gag-MJ4嵌合病毒的复制能力

本实验的总体目标是将来自HIV1 C亚型感染个体的gag基因插入具有复制能力的HIV1质粒中，以评估gag序列多态性对HIV1体外复制能力的影响。该目标通过以下步骤实现：首先从患者的血浆中扩增gag基因；第二步是将患者来源的gag序列克隆至具有复制能力的感染性分子克隆MJ-four中；接着转染gag-MJ-four嵌合体质粒，以产生具有感染性的病毒储备液，并在指示细胞系上测定其感染滴度；最后一步是在GXR-25 T细胞系中测定体外复制能力。最终，通过放射性标记的逆转录酶活性检测法，定量分析随时间变化的病毒颗粒产生量，从而可视化病毒复制动力学。

我们今天将要介绍的方法有助于解答HIV研究领域中的一些关键问题，包括确定HIV复制适应性的决定因素，以及理解HIV适应性如何影响长期致病过程。今天的方法介绍将由我的两名研究生Jessica Prince和Dan Claiborne来讲解。

开始此实验步骤时，首先通过一步法反转录 PCR，利用反转录酶和耐热 DNA 聚合酶将 RNA 反转录为 cDNA，并扩增第一轮 DNA 产物。然后，取第一轮 PCR 扩增产物 1 微升作为 DNA 模板，进行巢式第二轮 PCR 扩增。接着，向 5 微升第二轮反应体系中加入 3 微升 5X 上样染料。

在含有紫外荧光DNA染料的1%琼脂糖TAE凝胶上以120伏电压电泳，直至条带分离清晰。然后在蓝光成像仪上观察1.6 KB的条带。随后，将剩余的45微升反应体系在含有DNA染料的1%琼脂糖TAE凝胶上电泳。用洁净的剃刀切下目标条带，并将每个个体的三个阳性反应产物合并。接着使用凝胶纯化试剂盒从凝胶片段中提取DNA，并用无核酸酶水洗脱。将产物于-20摄氏度冷冻保存以备后续使用。0:15:56 在本步骤中，扩增MJ-four质粒的长末端重复序列5'非翻译区后，在成像仪上观察1.3 KB的PCR产物。切下阳性扩增片段，然后按照前述方法进行纯化并冷冻保存。接下来，通过拼接重叠延伸PCR方法构建融合的MJ-four LTR-gag扩增子。观察、切下、纯化并冷冻保存长度为3.2 kb的扩增产物。现在，在50摄氏度条件下，用BCL-one限制性内切酶消化1.5微克MJ-four质粒和1.5微克纯化的LTR-gag PCR产物，反应1.5小时。随后，在消化反应体系中加入1微升NGOM-four，于37摄氏度孵育1小时。之后，在限制性酶切反应体系中加入5×上样染料。将全部反应体积在含有DNA染料的1%琼脂糖TAE凝胶中以100伏电压缓慢电泳1至2小时。按照前述方法观察、切下并纯化指定条带用于克隆。

接下来，使用纯化的LTR-gag插入片段和MJ-four载体DNA进行连接反应，插入片段与载体的比例为3:1。将连接反应在4°C下过夜孵育。

然后将连接产物转化至JM-109化学感受态细菌中，涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将转化后的细菌在30 °C下培养至少22小时。为验证克隆的保真性，使用NGOM-four和HPA-one限制性内切酶对质粒小提DNA进行37 °C、2小时的双酶切消化。

随后，在1%琼脂糖TAE凝胶上进行分析。根据TZM-BL细胞实验测定的每微升感染单位（IU）滴度，计算每种病毒储备液所需的体积，以在感染复数（MOI）为0.05的条件下感染5 × 10⁵个GXR-25细胞。操作具有复制能力的HIV时，务必穿戴适当的个人防护装备，包括全套实验服、面部口罩和双层手套。在感染当天，从-80°C冰箱中取出病毒储备液并解冻。接着，将病毒用C-R-P-M-I培养基稀释至100 µL，以达到0.05的MOI。将稀释后的病毒加入V型底、经组织培养处理的96孔板中，每组复制实验均需设置阳性和阴性对照，并安排每间隔一列留空，以减少孔之间的交叉污染。随后，使用自动细胞计数仪对GXR-25细胞进行计数，并计算所有感染实验所需的细胞总数。将所需体积的细胞分装至50 mL锥形管中，离心以形成细胞沉淀。小心吸除上清液，然后重悬于C-R-P-M-I培养基中，调整浓度为5 × 10⁵个细胞/100 µL。将细胞悬液转移至无菌槽中并充分混匀。随后使用多通道移液器，向含有稀释病毒的96孔板每孔加入100 µL细胞悬液，并充分混匀。之后，向每孔加入2 µL浓度为5 mg/mL的polybrene溶液，并充分混匀细胞。然后将板置于含5% CO₂的组织培养孵育箱中，37°C孵育3小时。

为了洗涤感染的细胞，将96孔V型底板离心，使细胞沉淀。然后小心吸除150微升培养基，并更换为150微升不含细胞沉淀干扰的新鲜C-R-P-M-I培养基。重复该步骤两次，以充分洗涤细胞。最后一次离心并加入150微升C-R-P-M-I后，使用多通道移液器重悬细胞沉淀。将每孔中的混合液转移至24孔组织培养板中含800微升C-R-P-M-I的孔内。随后将培养板置于37摄氏度、5% CO2的组织培养孵育箱中。每隔两天，从培养孔表面吸取100微升上清液，转移至96孔U型底板的孔中，冷冻保存，用于后续RT检测分析。然后充分重悬细胞，并移除剩余体积的一半，以防止细胞过度生长。之后，通过向每孔加入550微升新鲜C-R-P-M-I，恢复原始培养体积。

在此步骤中，向每1毫升RT预混液分装样品中加入1至2微升浓度为10毫居里/毫升的DTTP以及4微升1摩尔的DTT。使用1000微升移液器小心混匀每支含有RT预混液、DTT和DTTP的1.5毫升微量离心管，并转移至无菌槽中。

接下来，将25微升标记的反转录混合液加入96孔薄壁PCR板的每个孔中。向含有反转录预混液的PCR板中各加入5微升上清液。然后用粘性铝箔封膜密封PCR板，并在PCR仪中37摄氏度孵育2小时。孵育结束后，使用200微升多通道移液器在铝箔封膜上扎几个小孔。将样品上下吹打混匀5次。取每个样品5微升点样于DE-81滤纸，所有样品在空气中干燥10分钟。将点样后的滤纸分别放入不同的洗涤容器中。随后用1X SSC缓冲液洗涤滤纸5次，再用90%乙醇洗涤2次，每次5分钟，之后让其自然晾干。干燥后，小心地用保鲜膜包裹滤纸，并在室温下置于密闭暗盒中过夜，使其与磷屏接触曝光。

准备就绪后，使用磷屏成像仪分析磷屏，并对放射性转录产物进行定量。

图中所示为具有代表性的凝胶图像，展示了为获得可克隆至 MJ-four 质粒骨架中的患者来源 gag 扩增片段所需的各类 PCR 扩增产物的电泳分离结果。该代表性凝胶图像还展示了将患者 gag 基因克隆至 MJ four 质粒时所用限制性酶切产物的电泳分离情况。

此代表性凝胶图像显示了纯化的 gag MJ-4 嵌合体质粒 DNA 经限制性酶切后的电泳分离结果。该图表展示了在 GXR-25 细胞系中，复制检测随时间的重复性。在相隔约一年的两次独立实验中，均使用相同的 gag MJ-4 嵌合病毒来感染 GXR-25 细胞。

通过计算经对数转换的 DLU 值的斜率，并将该斜率归一化至野生型 MJ-four，从而生成复制得分。两次独立测量结果具有高度相关性，凸显了在不同时间点以及使用不同传代次数的细胞所进行的实验具有良好的可重复性。该技术为艾滋病（HIV/AIDS）领域的研究人员探索急性C亚型感染（全球最流行的HIV亚型）中致病性的病毒决定因素奠定了基础。操作具有复制能力的HIV病毒具有极高危险性。所有涉及活病毒的操作均须在生物安全二级增强（BSL-2+）实验室中进行，所有工作表面应定期去污染，并始终佩戴双层手套。