Dos métodos para fijar las células humanas primarias endometrial estromales de la histerectomía especímenes

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos primarios de células estromales endometriales a partir de histerectomías resecadas. Esto se logra primero distinguiendo y separando las capas uterinas para aislar una sección de tejido endometrial. El segundo paso es elegir una técnica de aislamiento celular entre los métodos de raspado y prueba cuando se utiliza el método de raspado.

La fuerza mecánica y el raspado se utilizan para separar y disociar las células estromales endometriales. Alternativamente, cuando se utiliza el método de la tripsina, la actividad enzimática de la tripsina se utiliza para separar y disociar las células del estroma endometrial. En última instancia, la microscopía se utiliza para observar el crecimiento y la morfología de las células, mientras que otras técnicas discutidas en el manuscrito se utilizan para verificar los cultivos de estromas endometriales.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave de fisiología en el campo reproductivo: fenómenos como el ciclo reproductivo y la menstruación. Los especímenes de histerectomía utilizados en este manuscrito se recolectaron de acuerdo con un protocolo de ética aprobado por el IRB de la universidad, numerado I-R-B-H-S-R número 1 4 4 2 4. Mantenga el tejido derivado del paciente en un tubo de 50 mililitros que contenga RPMI o DMEM con glucosa alta a cuatro grados Celsius durante no más de 24 horas antes de que se procese la muestra. Cuando esté listo para comenzar, lave la muestra de tejido tres veces con un XPBS y deseche la solución entre cada lavado.

A continuación, añada de cuatro a 10 mililitros de medio de crecimiento suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina a la muestra de tejido. Además, agregue una zona de hongos a una concentración final de 0,25 microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos. A continuación, deseche el medio de crecimiento y lave el tejido dos veces con un XPBS.

Coloque el tejido en una placa de cultivo celular de seis centímetros e identifique la capa de endometrio utilizando estas imágenes como guía. A continuación, separe el endometrio y guarde las otras capas de tejido para su uso futuro. Use un bisturí o una cuchilla de afeitar para seccionar el tejido en pedazos pequeños mientras rasca la placa de cultivo celular.

Los rasguños facilitan la unión de las células estromales endometriales primarias emergentes. A continuación, agregue suavemente dos mililitros de medio de crecimiento al plato rayado. En esta etapa, los fragmentos de tejido serán visibles e inmovilizados por el movimiento de rascado.

Coloque la placa en una incubadora de cultivo celular designada separada de otras líneas celulares para evitar la contaminación. Controle las células diariamente con un microscopio óptico. Busque pequeñas poblaciones de células que emerjan del tejido cortado al segundo o tercer día cada tres días.

Retire suavemente los cultivos de lavado de medios viejos con un XPBS y luego agregue dos mililitros de medios de crecimiento frescos. Comience a agregar cuatro mililitros de sustrato. Una vez que la tasa de proliferación aumenta durante los pasos de lavado, aspire las piezas restantes de tejido.

Es poco probable que surjan nuevas colonias del tejido. Después de una semana de paso de crecimiento, las células usan 0.05% de tripsina. Cuando las células alcancen entre el 75 y el 80% de fluidez, congele una placa de células.

Una vez que se mantienen dos o tres placas, las células primarias no pueden pasar indefinidamente. Para iniciar el aislamiento mediado por tripsin, se coloca un pequeño trozo de tejido endometrial en un tubo cónico con dos mililitros de tripsina al 0,25% suplementado con 0,03 miligramos por mililitro. A continuación, puede micina incubar el tejido en una plataforma giratoria a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, agite brevemente el tejido y luego centrifugue a 200 a 400 veces G durante dos minutos, deseche el sobrenadante y agregue tripsina fresca. Y puede micina luego incubar el tejido a 37 grados centígrados durante una hora mientras gira. Después de la incubación, agite el tejido durante cinco a 10 segundos.

A continuación, añada dos mililitros de sustrato que contengan un 10% de FBS y un 1% de penicilina estreptomicina. Para desactivar la tripsina, centrifugar las células a 200 a 400 veces G durante dos o tres minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda.

En dos mililitros de medio de crecimiento, la célula se suspende en una placa de cultivo celular de seis centímetros y raspa la placa para mejorar la unión de las células primarias. Controle el crecimiento celular diariamente con un microscopio óptico y cambie el medio de crecimiento cada dos o tres días. Una vez que las células hayan alcanzado una cofluidez del 75 al 80%, utilice 0,05% o 0,25% de tripsina para hacerlas pasar, aislando las células del estroma endometrial.

El uso del método de raspado genera grupos de células emergentes tempranas. A lo largo de los rasguños inducidos por el bisturí, las células del estroma endometrial se pueden identificar por su morfología de fibroblastos. El método de tripsina tiene un tiempo de preparación más largo que el método de raspado, pero las células viables se observan antes.

El método de prueba también genera células con patrones de crecimiento agrupados y dispersos. Todavía no se ha descubierto un marcador tisular específico para las células estromales endometriales. Una forma en que se identifican las células estromales endometriales es midiendo la pérdida de un marcador.

Para células epiteliales como la citoqueratina. La falta de citoqueratina demuestra una ausencia de células epiteliales endometriales. La pérdida de tinción de citoqueratina observada en el pasaje cinco en comparación con el pasaje dos, confirma la ausencia de células epiteliales.

La evidencia funcional de la presencia de células estromales endometriales se puede proporcionar mediante un ensayo de descelularización. El aumento de la prolactina y de la proteína uno de unión al factor de crecimiento similar a la insulina en respuesta al tratamiento con CAMP y acetato de hidroxiprogesterona indica el establecimiento exitoso de un cultivo del estroma endometrial. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer cultivos primarios de células estromales endometriales a partir de histerectomías resecadas.