Name: In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a evaluar la toxicidad del cloro en cardiomiocitos de rata y células epiteliales de vías respiratorias humanas mediante modelos de cultivo celular in vitro. Este método permite estudiar los mecanismos de daño por gases tóxicos en órganos vitales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación es apoyada por el Programa de CounterACT, Institutos Nacionales de Salud (NIH), la Oficina del Director, y el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) Número de Grant U54 ES015678 (CWW). SA también es apoyado por el Hospital de Niños Escuela de Minas de Colaboración Premio Pilot # G0100394 y el Hospital de Niños # Premio Piloto de Investigación de Colorado Institue G0100471 Colorado / Colorado.

1. Culturas Rata cardiomiocitos <ol><li> Todos los experimentos se realizaron bajo protocolos aprobados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional, IACUC. </li><li> Obtener cardiomiocitos de rata de los corazones (ventrículos) de ratas macho (240-260 g) empleando los métodos descritos anteriormente 4. En pocas palabras, anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg; confirmar la anestesia por el método pizca dedo del pie) y luego retire corazones en 10,0 ml, 1 mM Ca 2 + que contiene tampón Krebs Ringer, pH 7,4. </li><li> Enjuague los corazones 5-6x para quitar la sangre y luego cambiar a un 2 tampón Krebs Ringer Ca + gratuito que contiene 0,02% de proteasa y 0,06% de colagenasa A (5,0 ml / corazón). Incubar los corazones en esta solución durante 10-15 min a 37 ° C con agitación ocasional. </li><li> Después de 10-15 minutos, lavar la solución enzimática con tampón Ca 2 + libre de Krebs Ringer durante 5 min. Liberar las células del tejido fláccido nosotrosing una pipeta de 25 ml con la pipeta la suspensión arriba y abajo varias veces. </li><li> Separar las células de los tejidos mediante el filtrado a través de una malla de nylon de 70 micras y permitir que se asienten en tampón Krebs Ringer que contenía 0,1 mM Ca 2 +. Suspender el sedimento de células en 1,0 ml de tampón Krebs Ringer que contenía 0,2 mM Ca 2 +. </li><li> Capa cuidadosamente más de 5,0 ml 60 / ml de albúmina de suero bovino mg, BSA, en 15 ml tubos de centrífuga, para separar los cardiomiocitos de nonmyocytes y permitir que se asienten durante 30 min. Los cardiomiocitos son más pesados ​​y se mueven a la parte inferior del tubo. Retire con cuidado las células sobrenadante y medios de comunicación. Repita este paso una vez para purificar aún más las células. </li><li> Transición gradual por lavado (en pasos utilizando 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, y 1,0 mM de Ca 2 tampón + que contiene) los miocitos ventriculares / cardiomiocitos a 1,0 mM de Ca tampón 2 + que contiene y se resuspendieron en medio ACCT que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco , DMEM containing 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitina, creatina 5 mM, 5 mM de taurina, 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Placa de los cardiomiocitos en medio ACCT a una densidad de 100 a 150 células / mm 2 en 100 mm o 35 mm de laminina recubierto placas de cultivo de plástico o 40 x 22 mm cubreobjetos de vidrio recubiertos previamente con laminina (1 g / cm 2). Después de 1 hora, lavar los platos con ACCT 2,0 ml para eliminar las células que no están conectados. Añadir 10,0 ml de medio fresco y se incuban las células. </li></ol> 2. Interfaz de aire-líquido diferenciada (ALI) Cultivo de células de las vías respiratorias humanas epiteliales basales <ol><li> Adquirir tejidos traqueobronquiales humanos de la enfermedad de Investigaciones Científicas de intercambio bajo la Junta de Revisión Institucional de los protocolos aprobados. Cosecha celular y realizar cultivo utilizando un 5,6 procedimiento publicado. Este procedimiento utiliza cultivos de células, ya que son un modelo preciso de la exposición por inhalación humana a TICs, sin embargo, si es necesario se puede aislar y crecer a ALI moutilizar y / o células epiteliales de las vías respiratorias de rata 7,8. </li><li> Brevemente, hacer piezas pequeñas (~ ¼ de pulgada) de tejido después de la eliminación de todos los nodos de tejido conjuntivo y los ganglios. Lave el tejido varias veces en solución de Ringer con lactato. Añadir los tejidos a un tubo cónico de 50 ml y añadir solución de proteasa (1% Protease/0.01% de DNasa en medio mínimo esencial, MEM, tejido a la proporción de fluido (01:10)). </li><li> Rock the tejido a 4 ° C durante la noche. Fin de la disociación del tejido mediante la adición de suero bovino fetal al 10%. Raspar la superficie epitelial con un bisturí quirúrgico y recoger las células por centrifugación (2000 rpm durante 10 min). </li><li> Las células de la placa en el paso uno en snapwells recubiertas de colágeno en medio especial ALI preparados como se describe en detalle por Fulcher et al 9. Cultura durante 5 días antes de cambiar a la interfase aire-líquido (ALI) mediante la eliminación de los medios apicales. </li><li> Alimentar a las células por medio de los medios de comunicación ALI cada dos días y permitir que las células se diferencien por 2-3 semanas adicionales (observar numerosos cilios paliza y la secreción de moco) antes de realizar las exposiciones. Lave la superficie apical con PBS caliente junto con los cambios de los medios. </li></ol> 3. La exposición al cloro <ol><li> Contener el sistema de exposición al cloro (CES) dentro de una campana química calificada con una velocidad de extracción de funcionamiento de 100 pies por minuto que proporciona la contención secundaria necesaria para evitar la exposición del personal en caso de fugas accidentales de cloro. </li><li> Haga funcionar el sistema bajo presión ligeramente positiva (0,5 pulgadas de agua). El aire seco se alimenta a 15 L / min y un nivel adecuado de cloro se alimenta para alcanzar la concentración de cloro final deseado. Las cámaras tienen una tapa de cierre con 4 mini cerraduras BCU y una junta de silicona de durómetro bajo para proporcionar el sello de presión. </li><li> Entregar la mezcla de Cl 2 a través de un controlador de flujo másico. El CES utiliza un cilindro de gas comprimido que contiene 1,0% de Cl 2 en nitrógeno seco. </li><li> Regular el flujo de aire de dilución utilizando eldiseñado a medida del panel de control y del mismo modo regular la concentración de Cl2 entregado a las cámaras de exposición. Una bomba de muestreo de bajo volumen saca los gases de escape de las cámaras en un analizador de cloro para controlar las concentraciones que luego se graban en un registrador de datos conectado al analizador. </li><li> Medir las tasas de flujo dentro de las cámaras antes de la exposición usando un medidor de flujo para asegurar velocidades de suministro y de escape iguales. </li><li> Preparar los cultivos celulares para la exposición mediante la eliminación de los medios de comunicación de sobrenadante y añadir medio fresco (medio basolateral en culturas ALI). Cualquier pretratamientos con agentes podrían ser realizados en este momento. </li><li> Exponga las culturas ALI de las células epiteliales de la vía aérea a Cl 2 gas (50, 100, o 300 ppm durante 30 minutos) en las dos cámaras bioconfinamiento polisulfona selladas. Los cardiomiocitos (sumergidas o culturas en las membranas confluentes) están expuestos a 50 o 100 ppm de Cl 2 durante 15 min. </li><li> Después de la exposición limpiar las cámaras de aire hasta que la Cl 2 nivel cae por debajo de 1 ppm y se puede abrir de forma segura para eliminar las células (dentro de 5 min). </li></ol> 4. Resistencia eléctrica transepitelial (TER) Medición <ol><li> Mida la TER de aire-líquido-interfaz, ALI, culturas utilizando un voltohmmeter epitelial con un par de electrodos de cloruro de &quot;palillos&quot; de plata. </li><li> Equilibrar el electrodo palillo en el ALI medios 15 min antes de su uso. </li><li> Añadir media caliente al apical (1,0 ml) y basolateral (2,0 ml) de la superficie y medir la TER usando los electrodos palillos del voltohmmeter. </li><li> Sumergir el brazo más corto del electrodo en medios apical y el brazo más largo en los medios de comunicación basolateral. Haga clic en el botón de &quot;medida&quot; en el voltohmmeter para evaluar la resistencia eléctrica. </li><li> El voltohmmeter tiene la opción para medir ohmios o K ohmios. Restar la resistencia a través de un soporte de cultivo libre de células a partir de la resistencia medida a través de cada capa de células para producir el transresistencia epitelial (TER). </li></ol> 5. Medición de Caspasa <ol><li> Añadir medios ALI fresco (2,0 ml) a la exposición basolateral mensaje superficie e incubar la célula a temperatura ambiente. Recoger medio sobrenadante a las 4 y 24 horas. </li><li> Medir la caspasa 3/7 actividad en los sobrenadantes de los medios de comunicación mediante el uso de una caspasa comercial 3/7 kit de ensayo. </li></ol> 6. Western Blot e inmunocitoquímica <ol><li> Realizar transferencias de Western usando lisados ​​de células como se ha descrito previamente 10. Suspender el lisado de proteínas (20 g) en tampón de muestra 5x reducida y hervir durante 5 min. Se somete el lisado de proteínas a SDS-PAGE (4-15%) y transferir las proteínas separadas a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia electroforética. </li><li> Bloquear la unión no específica mediante la incubación de la membrana con leche 5% en tampón de lavado (PBS + 0,1% de detergente) y la sonda las membranas con anticuerpos primarios contra SERCA2 o actina sarcomérica en dilución 1:1000, durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar e incubar las membranas con los respectivos anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y desarrollar para la detección como se ha descrito antes 10 usando el kit de detección de peroxidasa comercial. </li><li> Por inmunocitoquímica tratan células vivas cultivadas en insertos o cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos con 0,4% Triton-X-100 en mM tampón de citrato de sodio 10 durante 20 minutos después de enjuagar con PBS. </li><li> Bloquear la unión no específica tratando las células con 5% de suero de burro durante 20 min, y luego incubar las células con IgG no específica o anticuerpos primarios individuales específica a la actina sarcomérica o Ki-67. </li><li> Lavar las células con PBS y se incuban con anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado para detectar el anticuerpo primario y un tinte nuclear (1 g / ml DAPI). </li><li> Lavar con PBS y montar cubreobjetos utilizando medio de montaje comercial. </li><li> Visualizar la tinción utilizando un microscopio de fluorescencia. </li></ol>

<ol><li>Mohan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+accidental+exposure+to+chlorine+gas%3A+clinical+presentation%2C+pulmonary+functions+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Chest+Dis+Allied+Sci%22%5BJournal%5D)">Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes.</a> Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).</li>
<li>Kose, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction%2C+acute+ischemic+stroke%2C+and+hyperglycemia+triggered+by+acute+chlorine+gas+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation.</a> Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).</li>
<li>Das, R., Blanc, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+gas+exposure+and+the+lung%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Ind+Health%22%5BJournal%5D)">Chlorine gas exposure and the lung: a review.</a> Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).</li>
<li>Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+the+terminally+differentiated+adult+cardiac+muscle+cell%3A+a+light+and+scanning+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study.</a> Dev Biol. 80, 466-482 (1980).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+suppresses+sarcoplasmic%2Fendoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+expression+in+cystic+fibrosis+airways%3A+role+in+oxidant-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death.</a> Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+signals+airway+epithelial+basal+cell+survival+via+coagulation+and+protease-activated+receptor+isoforms+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+tracheal+basal+cells+to+ciliated+cells+and+tissue+reconstruction+on+the+synthesized+basement+membrane+substratum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro.</a> Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).</li>
<li>Fulcher, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Med. , 107-183 (2005).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA2+regulates+non-CF+and+CF+airway+epithelial+cell+response+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone.</a> PloS One. 6, e10(2011).</li>
<li>Martin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine-induced+injury+to+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Chlorine-induced injury to the airways in mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).</li>
<li>Evans, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Chlorine: state of the art.</a> Lung. 183, 151-167 (2005).</li>
<li>Vliet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+nitrogen+species+during+peroxidase-catalyzed+oxidation+of+nitrite.+A+potential+additional+mechanism+of+nitric+oxide-dependent+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity.</a> J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cells+release+ATP+during+ozone+exposure%3A+signaling+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival.</a> Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).</li>
<li>Allen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+exposure+of+cultured+cells+and+other+materials+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone.</a> Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El tipo más común de exposición a sustancias tóxicas agudas se produce cuando se respira un producto químico venenoso en los pulmones. Estas sustancias químicas también pueden ser tomadas rápidamente en el torrente sanguíneo y pueden afectar otros órganos, como el cerebro y el corazón. Toxicidad por inhalación de diversos agentes que utilizan modelos animales son estudiados e informó ampliamente, sin embargo los mecanismos son menos conocidos. Esto es un obstáculo importante en el desarrollo de terapias eficaces. Ausenc...

La exposición a productos químicos tóxicos inhalados (TICs) / gases como el cloro (Cl 2) sigue siendo un problema de salud en curso en exposiciones accidentales, así como en su uso potencial como un agente de amenaza química. Aunque los pulmones son el blanco principal, órganos como el corazón y el cerebro también se ven afectados 1-3. Modelos in vivo se utilizan generalmente para las pruebas de toxicidad de las TIC, pero en los ensayos in vitro para la evaluación de la toxicidad son más simples, más rápido y más rentable. En modelos in vitro también permiten la extensa investigación de las interacciones célula-agente que pueden ser difíciles de evaluar in vivo. Tales sistemas de exposición in vitro en son raros y por otra parte, en algunos modelos convencionales donde se añaden agentes tóxicos al medio de cultivo en el que se sumergen las células, las propiedades de los agentes pueden cambiar debido a las interacciones y la unión a componentes en el medio. En tales sistemas de cultivo de células escenarios tales como la interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células primarias vías respiratorias humanas epiteliales, que aquí se proponen, que pueden estar expuestos directamente a los agentes gaseosos podrían ser prometedores. Las células epiteliales que recubren las vías respiratorias son las primeras líneas de defensa contra sustancias químicas tóxicas inhaladas. El epitelio de la vía aérea humana forma una barrera física entre la luz y las células subyacentes en el pulmón y participa en la respuesta del pulmón. Se produce un número de citoquinas y otros agentes pro-y anti-inflamatorias, así como segrega líquido de la superficie de moco / las vías respiratorias (ASL) que cubre el epitelio. Una de las limitaciones en sumergido en sistemas de cultivo in vitro convencionales es también que la ASL y el moco que cubre la superficie epitelial se quita o se diluyen. Esto no refleja el estado fisiológico de las células epiteliales del pulmón que se exponen al aire. Por lo tanto, un ideal sistema in vitro para las pruebas de toxicidad TIC debe replicar esta arquitectura. Hay un gran interés en el desarrollo de la detección rápida métodos que predicen la toxicidad in vivo. Las células epiteliales cultivadas en el ALI diferenciar y tienen estructuras y funciones bien diferenciadas en comparación con las células cultivadas sumergidas y servir a un modelo superior de las vías respiratorias. En este estudio, se describe el uso de la cultura-líquido interfaz aérea de las vías respiratorias humanas (traqueobronquiales) las células epiteliales para las pruebas de toxicidad por inhalación de gas venenoso y lo comparamos con un cultivo de células sumergida de los cardiomiocitos, estudiando, por lo tanto otro objetivo importante de la toxicidad.

<table><tbody><tr><td>Ratas</td><td>Laboratorios Harlan</td><td>Sprague-Dawley &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Cloro</td><td>AirGas, Inc</td><td>X02NI99CP163LS1</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa 3/7 kit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmímetro epitelial y electrodo de palillo</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM y STX2</td><td></td></tr><tr><td>Insertos Snapwell</td><td>Corning</td><td>07-200-708</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de nailon de 70 micras</td><td>Corning</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de biocontención de polisulfona&nbsp;</td><td>BCU, Allentown Cage Equipment</td><td>BCU</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de actina sarcomérica</td><td>Abcam Cambridge, MA</td><td>Anticuerpo AB28052</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2</td><td>Biorreactivos de afinidad, Golden, CO</td><td>MA3-9191</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Ki-67</td><td>Dako, Carpintería, CA</td><td>M7248</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado Alexa 488</td><td>Invitrogen, Grand Island, NY</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Carnitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6257</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Tampón Ringer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Ringer Lactato</td><td>Abott Laboratories</td><td>7953</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Fisher Scientific</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Geles SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dergent, Tween&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detección de peroxidasa</td><td>Pierce</td><td>3402</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje, Fluormount G</td><td>eBiosciences</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8028</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD biosciences</td><td>354259</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>200-6140AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modelo de cultivo celular para toxic inhalado prueba química

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Los cultivos celulares son indispensables para desarrollar y estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos, antes de su uso en modelos animales. Tenemos la capacidad única de modelar las células del epitelio de la vía aérea humana y del músculo del corazón bien diferenciadas. Esto podría ser una herramienta muy valiosa para estudiar los efectos nocivos de los productos químicos tóxicos inhalados, como el cloro, que normalmente pueden interactuar con las superficies de las células, y forman varios subproductos al reaccionar con el agua, y la limitación de sus efectos en cultivos sumergidos. Nuestro modelo utilizando cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana bien diferenciados en la interfaz aire liqiuid elude esta limitación, así como proporciona una oportunidad para evaluar los mecanismos fundamentales de la toxicidad de los potenciales químicos inhalados venenosas. Describimos una mayor pérdida de la integridad de la membrana, la liberación de caspasa y la muerte sobre químicos tóxicos inhalados, como la exposición al cloro. En este artículo, se propone métodos para modelar la exposición al cloro en el corazón de los mamíferos y de las vías respiratorias epiteliales cells en la cultura y sencillas pruebas para evaluar su efecto en estos tipos de células.

Cardiomiocitos en forma de varilla primaria se adhieren sobre matrices de laminina y se propagan y se diferencian en cultivos confluentes (Figura 1A y su inserción). Estas células se caracterizan además sobre la base de actina sarcomérica y la expresión de SERCA2 (Figuras 1B y 1C). Cardiomiocitos de rata son altamente susceptibles a la toxicidad de cloro como 15 minutos de exposición a 100 ppm de cloro causó grandes redondeo celular y muerte en cultivos sumergidos y la ...

Este protocolo está diseñado para demostrar método de exposición de cultivos de células a productos químicos tóxicos inhalados. La exposición de diferenciada interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias proporciona un modelo único de la exposición de las vías respiratorias a los gases tóxicos tales como el cloro. En este manuscrito se describe el efecto de la exposición al cloro en las culturas de la interfaz aire-líquido de las células epiteliales y la cultura sumergida de los cardiomiocitos. In vitro sistemas de exposición permiten importantes estudios sobre el mecanismo para evaluar las vías que podrían entonces ser utilizados para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.

In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de la exposición al cloro en modelos de cultivo celular in vitro del pulmón, las vías respiratorias y el corazón. Esto se logra primero cultivando cardiomiocitos de rata o células epiteliales de las vías respiratorias humanas. Los cultivos de cardiomiocitos de rata se expondrán a gas cloro para evaluar la toxicidad del cloro en órganos vitales como el corazón, mientras que la exposición de cultivos diferenciados de células epiteliales de las vías respiratorias humanas al cloro permite modelar más detalladamente las exposiciones humanas a gases tóxicos.Finalmente, se puede medir la liberación de caspasa 3/7 y la resistencia eléctrica transepitelial para determinar la muerte celular apoptótica de los cardiomiocitos y la alteración de la membrana y la muerte celular de los epitelios respiratorios humanos, respectivamente. La ventaja principal de este método es que utiliza cultivos celulares de tejidos primarios en lugar de animales completos, lo que permite un método sencillo de prueba química in vitro. Consejo cuatro: realizar experimentos de exposición al cloro.El sistema de exposición al cloro debe estar contenido

in-vitro-cell-culture-model-for-toxic-inhaled-chemical-testing

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

El objetivo de este protocolo es exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D humanos al humo de cigarrillo (CS) convencional en la interfaz aire-líquido. A continuación, se investiga el impacto de la CS en los tejidos mediante un ensayo de actividad del citocromo P450, una medición del latido de los cilios y un enfoque de biología de sistemas.

Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

Los usuarios del cigarrillo electrónico (e-cig) están aumentando en todo el mundo. Sin embargo, poco se conoce efectos sobre la salud inducidos por aerosoles inhalados e-cig. Este artículo describe una técnica de generación de e-cig aerosol apto para exposiciones de animales y estudios toxicológicos posteriores. Tales protocolos deben establecer sistemas de exposición experimental reproducible y estandarizado e-cig.

Generación del Aerosol del cigarrillo electrónico por un dispositivo de Vaping máquina de tercera generación: aplicación a estudios toxicológicos

Aquí, presentamos un protocolo para realizar exposiciones de aerosol celular portable y medir la respuesta celular. El método utiliza las células, cultivadas en la interfase aire-líquido, imitando en vivo fisiología. Respuesta celular a aerosoles de nanopartículas de cobre se observó como el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la citotoxicidad como liberación de lactato deshidrogenasa.

Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

Presentamos un sistema de exposición in vitro robusto, transferible y predictivo para el cribado y seguimiento de partículas transmitidas por el aire relativas a su citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido (ALI).

Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento primario de monocitos de sangre humana, así como su diferenciación en macrófagos y células dendríticas y el montaje con células epiteliales en un modelo pulmonar humano multicelular. Se comparan las respuestas biológicas de las cocultivos compuestas de células inmunitarias diferenciadas de los monocitos recién aislados o descongelados, tras la exposición a estímulos proinflamatorios.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Establecemos un modelo estandarizado in vitro para estudiar la exposición al vapor de cannabis en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona un enfoque sistemático para examinar los impactos del cannabis vaporizado, abordando el creciente interés en los vaporizadores de cannabis como alternativa a fumar.

In vitro Exposiciones al cannabis de las células epiteliales pulmonares en la interfaz aire-líquido

Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes...

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

Aprenda a evaluar la toxicidad del cloro en cardiomiocitos de rata y células epiteliales de vías respiratorias humanas mediante modelos de cultivo celular in vitro. Este método permite estudiar los mecanismos de daño por gases tóxicos en órganos vitales.

In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Explorar más videos