Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

El objetivo general del siguiente protocolo es examinar los efectos de la infección microbiana sobre la inflamación crónica in vivo utilizando un modelo animal fisiológicamente relevante. Esto se logra infectando oralmente ratones con Porphyromonas gingivalis para inducir inflamación crónica local y sistémica. La resonancia magnética se puede utilizar para medir la progresión de la inflamación sistémica en animales vivos, mientras que la pérdida ósea inflamatoria local se evalúa mediante micro tomografía computarizada y las placas ateroscleróticas se pueden visualizar mediante la tinción de lípidos en la cara después del sacrificio.

En última instancia, las diferencias en el volumen óseo alveolar y la acumulación de placas ateroscleróticas entre los ratones infectados por P. gingivalis y los controles no infectados pueden medirse mediante análisis de microtomografía computarizada y tinción de lípidos faciales, respectivamente. La principal ventaja de nuestro modelo animal es que permite examinar tanto el huésped como los mecanismos patogénicos implicados en la inflamación crónica y, en concreto, en lugares alejados de la infección. Por lo tanto, puede observar los sitios sistémicos, así como los sitios locales de infección, utilizando ratones transgénicos y mutantes bacterianos definidos.

Este modelo puede ayudar a identificar aspectos clave de la patogénesis, como el huésped y los factores microbianos que contribuyen a la enfermedad. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos específicos del huésped y el patógeno implicados en la pérdida ósea inflamatoria y la aterosclerosis, también puede adaptarse a otros modelos de enfermedad en ratones, como la artritis reumatoide, la diabetes y el cáncer. Esta es la instalación central de resonancia magnética de alto campo de la Universidad de Boston, y mi compañero postdoctoral Ning va a demostrar aspectos de la imagen de ratones Comience rayando tallos congelados de melocotón gingivalis 3 81 en placas de agar sangre anaeróbica e incube las placas en una cámara anaeróbica a 37 grados centígrados.

Después de tres a cinco días, use los organismos cultivados en placa para inocular cultivos líquidos de cinco mililitros de caldo de infusión cerebro-corazón, o BHI. Después del crecimiento durante la noche, transfiera los cultivos a 45 mililitros de BHI e incube los cultivos anaeróbicamente durante 18 a 24 horas adicionales. A mediados de la fase logarítmica, recoja las bacterias por centrifugación durante 10 minutos a 7.000 GS y temperatura ambiente, y luego vuelva a suspender completamente el pellet en cinco mililitros de PBS con una pipeta serológica después de lavar el pellet tres veces en 50 mililitros de PBS Resus, el pellet en PBS tal que una dilución de uno a 10 del cultivo tenga una densidad óptica de 1,0 a 660 nanómetros.

A continuación, saque suficiente carboximetilcelulosa de viscosidad media para lograr una solución de 2% de peso a volumen y añada lentamente la carboxetilcelulosa a la suspensión bacteriana mientras se agita en vórtice para evitar la aglomeración. Para medir la progresión de la inflamación en C dos. En primer lugar, coloque un soporte para animales con la cabeza del ratón en posición supina en una sonda vertical de 30 milímetros y en el orificio vertical de un escáner TMRI 11,7.

Después de los procesos de bamboleo y calza, utilice una secuencia poco común para adquirir imágenes de exploración a lo largo de tres orientaciones ortogonales para crear imágenes axiales coronales y sagitales. Luego, después de usar una angiografía por resonancia magnética de baja resolución para confirmar que las imágenes adquiridas están dentro de la región objetivo, realice una angiografía por resonancia magnética de alta resolución de la arteria innominada con una secuencia de eco de gradiente 3D sin catar utilizando los siguientes parámetros. Un espesor de losa de 1,5 centímetros, un ángulo de giro de 45 grados, un tiempo de repetición de 20 milisegundos, un tiempo de eco de 2,2 milisegundos, un campo de visión de 1,5 por 1,5 por 1,5 centímetros, una matriz de 1 28 por 1 28 por 1 28 y un número del promedio de cuatro para un tiempo total de escaneo de aproximadamente 22 minutos.

A continuación, seleccione una imagen axial de la arteria denominada de 0,3 a 0,5 milímetros por debajo de la bifurcación subclavia para el análisis de la ROI para sujetar la aorta, manteniendo el tejido cubierto de PBS en todo momento. Comience colocando la aorta en posición anatómica con los bulbos de la aorta a la izquierda. A continuación, coloque clavos de mnuchino temporales consecutivamente en los cinco lugares siguientes, la parte superior de la aorta por debajo de la tercera rama del arco, a mitad de la aorta descendente cerca del extremo inferior de la aorta descendente y por encima de la rama de la arteria femoral.

A continuación, utilice unas tijeras de resorte extrafinas para cortar el lado izquierdo de la aorta desde la rama izquierda de la arteria femoral hasta debajo de la rama más baja de la aorta ascendente. Luego, después de cortar y sujetar cada rama para exponer su superficie interna, continúe sujetando el pañuelo. Toda la superficie interior está expuesta y claramente visible desde arriba y libre de interferencias visuales de los pines.

Para teñir los lípidos y cuantificar las lesiones, comience por cubrir la aorta clavada con una solución de Sudan four o aceite rojo O recién preparada. Después de 50 minutos, lave el pañuelo con isopropanol al 70% durante uno a cinco minutos y luego enjuague suavemente la aorta con agua destilada doble hasta que el agua que sale del tejido ya no sea roja. A continuación, cubra la aorta con PBS y coloque una regla junto al tejido para ayudar en la calibración de la imagen.

A continuación, capture imágenes del tejido con la cámara de alta resolución conectada a un microscopio de disección, guardando las imágenes como archivos TIFF. Por último, en el software de análisis de imágenes se traza manualmente cada superficie íntima para determinar su área. A continuación, para calcular el área de la lesión mediante el umbral de color automatizado, establezca un umbral para cada imagen con el fin de definir una intensidad de color que discrimine las lesiones de las áreas normales.

El porcentaje de la superficie íntima cubierta por lesiones ateroscleróticas se puede calcular en este experimento representativo con ratones infectados con p gingivalis. El análisis volumétrico reveló que los ratones infectados exhiben una pérdida ósea significativa en comparación con los controles no infectados. La inspección visual del hemi maxilar reconstruido ilustra un aumento en la superficie expuesta de las raíces molares en ratones infectados en comparación con los controles propensos a la aterosclerosis.

Ratones deficientes en POE. P gingivalis induce una inflamación crónica que conduce a la pérdida de hueso alveolar y la deposición de placa inflamatoria dentro del seno aórtico y una arteria nominal tan pronto como 24 horas después de la última infección, que se puede monitorear en ratones vivos por resonancia magnética in vivo en varios puntos posteriores a la infección, como en estas imágenes representativas. Además, las mediciones faciales de la aorta de Sudán con cuatro tinciones demuestran que la infección por p gingivalis aumenta significativamente la deposición de lípidos y las áreas lesionales en la superficie intimal.

Además, el análisis inmunohistoquímico de las lesiones del seno aórtico revela un aumento de la infiltración de micrófagos y una elevada expresión del receptor inmunitario innato tipo toll-like receptor dos IV en ratones infectados. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que los puntos de tiempo de duración experimental en los que se evalúa la inflamación deben alinearse adecuadamente con la progresión de la enfermedad. Después de la resonancia magnética de otros, se pueden realizar otros métodos, como la bioquímica de boca o la histoquímica inmunitaria, para responder a preguntas adicionales como la carga aterosclerótica global o los componentes celulares de la lesión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de un modelo de ratón in vivo, que le permite examinar tanto el huésped como los factores patogénicos involucrados en la inflamación crónica. No olvide que trabajar con patógenos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso adecuado de EPP al realizar este procedimiento.