Name: Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprende a inducir trauma cerebral agudo en ratones mediante punción estereotáctica y observa el comportamiento celular con microscopía de dos fotones in vivo. Este método permite estudios longitudinales de lesiones cerebrales.

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Estamos profundamente agradecidos con el Dr. Frank Kirchhoff para proporcionar GFAP-EGFP y cepas de ratón CX3CR1-EGFP. El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Tekes, finlandés Graduate School of Neuroscience (FGSN) y la Academia de Finlandia.

Todos los procedimientos que aquí se presentan se realizaron de acuerdo a la guía local para el cuidado de animales (La Ley finlandesa sobre Experimentación Animal 62/2006). Licencia Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) se obtuvo de las autoridades locales (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Ratones adultos de 1-3 meses de edad, peso 24-38 g, se mantuvieron en jaulas individuales en las instalaciones de animales certificados de la Universidad y siempre con comida y agua ad libitum. 1. Lesión Cerebral Imaging través de una ventana craneal <ol><li> Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio <ol><li> Anestesie ratones por inyección peritoneal de una mezcla de ketamina (Ketalar, 80 mg / kg) y xilazina (Rompun, 10 mg / kg) disuelto en esterilizada por filtración tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Compruebe los reflejos del ratón de forma regular (de cola y sonda pizca dedo del pie) para verificar la profundidad de la anestesia. Aumentar la dosis cuando sea apropiado, para mantener la anestesia adecuada, pero evitar Overdose. </li><li> Mantener el animal a 37,0 ° C usando una almohadilla calefactora durante la operación quirúrgica, sesión de imágenes y primera hora después de la recuperación de la anestesia. </li><li> Para proteger los ojos del ratón se seque, aplique lubricante ocular. </li><li> Administrar dexametasona (veterinario Rapidexon, 2 mg / kg) por inyección subcutánea para reducir la inflamación y el edema cerebral. </li><li> Administrar un analgésico (por ejemplo, ketoprofeno por vía intraperitoneal) hasta 30 minutos antes o inmediatamente después de la cirugía. Si el animal muestra algún síntoma de dolor, como la renuencia a moverse, comer o beber, o pérdida de peso, salivación, piloerección o respiratoria anormal sonidos después de la cirugía, repetir la inyección de analgésico. </li><li> Afeitarse la cabeza del ratón &#39;con una máquina de afeitar (ver Materiales y Equipos). Evite dañar los bigotes. </li><li> Tratar la piel sobre la cabeza del ratón con solución de etanol al 70% para limpiar el área afeitada. </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas (ver Materiales yEquipment) y las pinzas (ver Materiales y Equipos), cortaron la piel de la línea media entre las orejas de la frente. </li><li> Raspar suavemente lejos el tejido conectivo unido al cráneo con una cuchilla microquirúrgica contundente. </li><li> Deslice las fronteras de la piel hacia los lados y tire de barras para los oídos ligeramente en los orificios auditivos en el cráneo de la cabeza y la fijación de la piel. </li><li> Limpie el cráneo con PBS estéril y tratar la zona de la cirugía en la cabeza del ratón con el 0,5% de digluconato de clorhexidina, luego seque la superficie del cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido. </li></ol></li><li> Imposición de la lesión pinchazo <ol><li> Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con un titular de los animales (ver Materiales y Equipos). </li><li> Ajustar la posición del microscopio binocular al lado del instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo del animal. </li><li> Utilizando un microscopio binocular, localice el punto bregma en el cráneo. </li><li> Identificar el region de interés utilizando las coordenadas estereotáxica. NOTA: Evite las áreas de interés que se encuentran directamente sobre los vasos corticales superficiales. La destrucción de estas puede afectar fuertemente a la progresión trauma. </li><li> Coloque la aguja de 30 G por encima de la región elegida y marca el sitio de destino por el rascado la superficie del cráneo. </li><li> Perforar el cráneo con todas las precauciones posibles para evitar la ampliación innecesaria de la superficie del hueso afectado. Use un taladro quirúrgico de alta velocidad (ver Materiales y Equipos) bajo el microscopio. Fresando si el líquido aparece en el área perforada. </li><li> Toque la parte inferior del pozo perforado con la aguja. </li><li> Sumergir la aguja sin problemas en el cerebro (tasa de inserción de 5-10 mm / min), a la profundidad de 0,5-2,0 mm de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo. </li><li> Retire la aguja inmediatamente después de llegar a la profundidad deseada (velocidad de retracción de 5-10 mm / min) y limpiar la sangre que aparece después del pinchazo con un pequeño tapón (see Los materiales y equipos). </li><li> Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión utilizando una bomba de microjeringa (WPI) y 10 l jeringa Hamilton de montar con pipeta de vidrio. NOTA: Durante la preparación de la pipeta de vidrio de capilar de vidrio de borosilicato, afilar la punta de un diámetro de 10 a 20 micras. </li><li> Infundir 250-1.500 nl de la solución de inyección a una velocidad de 2-5 nl / seg. NOTA: Deje la pipeta después de la final de la infusión durante al menos 5 min en el parénquima cerebral, luego retírela lentamente y con cuidado para evitar la solución de flujo de salida. </li></ol></li><li> Craneotomía para ventana craneal crónica <ol><li> Perforar el cráneo con mucho cuidado para hacer una ventana de círculo alrededor del sitio de la lesión. Utilice la ventana diámetro de 3-3,5 mm. </li><li> Aplicar una gota de tampón de corteza (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM y 2 mM de MgSO4 en H2O destilada) para cubrir el wiNDOW. </li><li> Coloque un cubreobjetos ronda (# 1.5 grosor) en la ventana del cráneo. </li><li> Retire el exceso de buffer de la corteza alrededor del cubreobjetos. </li><li> Selle los bordes del cubreobjetos con pegamento acrílico (ver Materiales y Equipos). NOTA: Asegúrese de que el pegamento no se aplica a la superficie superior del cubreobjetos. Si el cristal de la cubierta está contaminada con cola, esperar hasta que el vidrio sea de forma estable pegado al cráneo y el pegamento en la superficie de vidrio se seca, a continuación, retire con cuidado el pegamento contaminando con un microcuchilla. </li><li> Espere 5 minutos a que el pegamento se seque. </li><li> Con los tornillos altura de la barra del oído, ajuste la posición de la cabeza de manera que el soporte de metal puede ser colocado. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de pegamento acrílico en el anillo del soporte de acero (ver Materiales y Equipos). </li><li> Pegue el anillo del soporte de acero para el cubreobjetos de vidrio con la maneta metal titular dirigido hacia atrás. </li><li> Espere 5 minutos a que el pegamento se seque. </li><li> Mix cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos. </li><li> Selle los bordes de la ventana craneal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel. </li><li> Espere 15 minutos para dejar que la mezcla de pegamento + cemento seque y luego retire las barras de oído. </li><li> Realice microscópica de excitación (TPEM) de dos fotones para la región de interés y un área de control, ya que se describe en el Protocolo 3. </li><li> Después de las imágenes, que el animal pueda recuperarse de la anestesia en una almohadilla eléctrica y mantenerla en una jaula individual bajo observación hasta la recuperación completa. Alimento húmedo se puede dar para facilitar la masticación y la hidratación. </li></ol></li></ol> 2. Lesión Cerebral Imaging través del cráneo Diluido <ol><li> Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio <ol><li> Anestesiar el ratón y prepararlo para la inducción traumacomo se describe en el paso 1.1. </li></ol></li><li> Cráneo adelgazamiento e imposición de la lesión pinchazo <ol><li> Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con el titular de los animales (ver Materiales y equipos). </li><li> Ajuste la posición de un microscopio binocular junto al instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo animal. </li><li> Localice el punto bregma en el cráneo usando un microscopio binocular, identificar el área del cerebro en ser fotografiado en base a coordenadas estereotáxica y se marca por el rascado. NOTA: La posición adelgazamiento cráneo no debe colocarse sobre o cerca suturas craneales, como la estabilidad del cráneo se ve comprometida en esas áreas. Por otra parte, los grandes vasos y las meninges, situados debajo de las suturas del cráneo corticales o meníngeos son susceptibles de causar los artefactos de imagen. </li><li> Coloque el soporte de metal recubierto con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal, aplicar una ligera presión y esperar 5 minutos hasta que el soporte de metal está sólidamente pegadas al cráneo. </li&gt; <li> Mezclar cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos. </li><li> Selle los bordes del soporte de metal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel. </li><li> Espere 15 minutos para dejar que el cemento y la mezcla de pegamento se secan. </li><li> Enjuague la región adelgazada cráneo y las partes circundantes del soporte metálico varias veces con PBS, de manera que los restos de pegamento no polimerizado son lavados. NOTA: Es fundamental para garantizar el apego estable del cráneo para el titular. Esto permite que la estabilidad de la preparación durante la exploración. </li><li> Usando el modo de alta magnificación del microscopio binocular, eliminar las capas superiores del hueso del cráneo con una micro-perforación de alta velocidad para crear una zona adelgazada cráneo de ~ 0,5 a 1,5 mm de diámetro. Utilice aire comprimido durante la perforación para eliminar los restos de los huesos. Realice la perforación intermittentlY durante el procedimiento de adelgazamiento con el fin de evitar el sobrecalentamiento inducida por la fricción. Se enfría la broca utilizando la solución a temperatura ambiente y aplicar periódicamente tampón a la zona adelgazada para absorber el calor. NOTA: Para evitar daños en la corteza, no perforar en grandes regiones (&gt; 1,5 mm) hasta una capa fina (&lt;50 micras). NOTA: La estructura ósea del cráneo del roedor se compone de dos capas delgadas de hueso compacto separadas por una gruesa capa de hueso esponjoso. Cavidades diminutas de la forma del hueso y círculos concéntricos canalículos esponjosos, que contienen vasos sanguíneos. Utilice la microtaladro para eliminar tanto la capa de hueso compacto externo y la mayor parte de la capa esponjosa. La interrupción de los vasos sanguíneos dentro del hueso esponjoso puede causar sangrado. Utilice la hemostasia esponja de colágeno para detener el sangrado. </li><li> Utilice la generación de segundo armónico (SHG) de formación de imágenes para examinar si se ha eliminado la mayoría del hueso esponjoso. Tenga cuidado de evitar el adelgazamiento excesivo, asegúrese de que el hueso restante es thel parpadeo de 50 micras, en esta etapa de la preparación. </li><li> Ponga una gota de tampón caliente (35-37 ° C) en la parte superior de la región adelgazada. Utilice una hoja de microcirugía o Micro Acabado Bur para eliminar más capas de hueso y formar un área lisa de ~ 700 m de diámetro con un grosor de hueso de ~ 20 micras. Durante este paso, es útil para realizar las imágenes SHG repetitivo y medir regularmente el espesor de los huesos. </li><li> Realice imagen TPEM para la región de interés y un área de control. </li><li> Ajustar la posición de la cabeza con los tornillos altura de la barra del oído de una manera tal que adelgaza región está posicionado estrictamente horizontal. Coloque la aguja por encima de la región adelgazada y asegúrese de que no hay grandes vasos debajo de la página de destino. </li><li> Hacer una lesión por inmersión de la aguja en el cerebro, a la profundidad de 0,5-2,0 mm de superficie del cráneo adelgazada y de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo. </li><li> Retire la aguja y reprimir la hemorragia que aparece después de tque la lesión cerebral aguda con el tapón hemostático (ver Materiales y equipos). Espere hasta que se forman coágulos sanguíneos y la pulsación del vaso en el lugar de la lesión se detiene. </li><li> Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión, tal como se describe anteriormente en la Sección 1.2.10. </li><li> Realice imagen TPEM para monitorear la progresión de lesiones y la recuperación como se describe en el Protocolo 3. </li><li> Después de las imágenes, que el animal pueda recuperar la conciencia de la anestesia en una almohadilla térmica. No deje que el animal desatendido y devolverlo a su jaula sólo después de la recuperación física completa. </li></ol></li></ol> 3. Imaging <ol><li> Colocar el animal bajo el microscopio por colocación del soporte del metal para el marco a la medida. </li><li> Para imágenes, utilizar por ejemplo el FV1000MPE microscopio de dos fotones equipado con láser de Mai Tai DeepSee y XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de inmersión en agua optimizado para in vivo de dos fotonesde formación de imágenes. </li><li> Identificar el lugar de la lesión en el microscopio utilizando el modo de fluorescencia de campo amplio. Utilice filtros de paso largo para visualizar la vasculatura cerebral y seleccione el área de control de acuerdo con el patrón observado de los vasos sanguíneos. </li><li> Para la imagen de la señal de generación de segundo armónico (SHG), ajustar el láser de femtosegundo para la longitud de onda de 800 nm y recogen la luz emitida mediante el filtro de derivación nm 380-410. Para imágenes de fluorescencia, utilice el filtro de paso de banda (515-560 nm) para recoger la luz emitida, y las siguientes longitudes de onda se utilizan para excitar la fluorescencia: GFP-860 nm, YFP-950 nm. </li><li> Utilice software Fluoview para la adquisición de imágenes. </li><li> Tienda Coordenadas cada ROI para imágenes repetitivas posterior. Imagen de la misma ROI con el tiempo, y ajustar las coordenadas cada vez para maximizar el solapamiento de imagen. </li><li> Analizar las imágenes con el software apropiado (por ejemplo. ImageJ). Las reconstrucciones que se presentan aquí se realizaron utilizando el software Imaris. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Traumatismo cerebral es un acontecimiento imprevisible abrupto. Aquí, se describe el modelo animal que reproduce un espectro de cambios patológicos observados en pacientes humanos después de la lesión cerebral, tales como la neurodegeneración, la eliminación de las dendritas, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias en la corteza cerebral, junto con una hemorragia subaracnoidea focal y aumento de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro. Para estudiar la patogénesis primaria y secundaria, así como la recuperació...

Lesión cerebral aguda es un problema de salud pública con una alta incidencia de lesiones en accidentes automovilísticos, caídas o agresiones, y la alta prevalencia de la discapacidad crónica posterior. Enfoques terapéuticos para el tratamiento de la lesión cerebral permanecen totalmente sintomático, lo que limita la eficacia de la atención pre-hospitalaria, quirúrgica y crítica. Esto hace que el impacto social y económico de la lesión cerebral particularmente grave. Por una variedad de razones, la mayoría de los ensayos clínicos no han demostrado mejora en la recuperación después de la lesión cerebral utilizando nuevos enfoques terapéuticos. Los modelos animales son cruciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas hacia una etapa en que la eficacia del medicamento se puede predecir en los pacientes con lesiones cerebrales. En la actualidad, existen varios modelos animales bien establecidos de trauma en la cabeza, incluyendo el impacto controlado cortical 1, lesión de percusión de fluido 2, la deformación cortical dinámico 3, peso-drop4, y la lesión foto 5. Un número de modelos experimentales se han utilizado para estudiar algunos aspectos morfológicos, moleculares y de comportamiento de la patología asociada con el trauma de cabeza. Sin embargo, ningún modelo animal único es un éxito completo en la validación de nuevas estrategias terapéuticas. Desarrollo de modelos confiables, reproducibles y controlados animales de lesión cerebral, es necesario evaluar los procesos patológicos complejos. La nueva combinación de las últimas tecnologías de la imagen microscópica y reporteros fluorescentes genéticamente codificados ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar todas las fases de la lesión cerebral, que incluyen la lesión primaria, extensión de la lesión primaria, lesión secundaria, y la regeneración. En particular, microscopía in vivo de dos fotones es una tecnología óptica no lineal único que permite la visualización en tiempo real de las estructuras celulares y subcelulares incluso en profundas capas corticales del cerebro de roedores. Varios tipos de células y OrgaNelles se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante la combinación de diferentes marcadores fluorescentes. El uso de esta potente herramienta, podemos visualizar cambios morfológicos y funcionales dinámicos en el cerebro que vive en condiciones postraumáticas. Las ventajas de la in vivo microscopía de dos fotones en el estudio de la lesión cerebral se demostraron recientemente por Kirov y colegas 6. Utilizando un modelo de contusión cortical focal leve, estos autores demostraron que la lesión aguda dendríticas en la corteza pericontusional es cerrada por la disminución en el flujo sanguíneo local. Por otra parte, demostraron que la corteza metabólicamente comprometido alrededor del sitio de contusión está dañado aún más por la despolarización de la difusión. Este daño secundario afecta circuitos sinápticos, haciendo que las consecuencias de la lesión cerebral traumática más severa. Aquí, se propone el método de punción estereotáxica con una aguja de jeringa, que podría combinarse con la aplicación tópica del fármaco simultánea, como un modelo avanzado de cerebro locallesiones y como una herramienta para estudiar las consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en el cerebro de mamíferos in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pinzas tontas 2A-sa, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; en aguja</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora de animales, máquina de afeitar</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura biológico con almohadilla térmica de acero inoxidable</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla microquirúrgica roma</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato con filamento</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Para la producción de pipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Digluconato de clorhexidina</td><td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Taladros desechables</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Pinza Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos Ealing</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Extractor vertical para la producción de pipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Control de taladro Foredom</td><td>Foredom FM3545</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pieza</td> <td>de mano de micromotor ForedomForedom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de anestesia gaseosa para ratones</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>Montado en instrumento estereotáxico</td></tr><tr><td>Hemostasia Colágeno Esponja</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee láser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soporte metálico</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza de microapósito, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>Microjeringa de llenado de capilares</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser multifotónico</td><td>Olympus FV1000MPE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa NanoFil 10 &mu; l</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>Jeringa Hamilton</td></tr><tr><td>Hisopos no tejidos 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampones quirúrgicos</td></tr><tr><td>Pegamento poliacrílico</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio redondos&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica 1,5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espesor&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequeños animales</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador para ratón Stoelting y rata neonatal</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Montado sobre instrumento estereotáxico.</td></tr><tr><td>Tijeras de iris para estudiantes, rectas 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamina 101</td><td>Sondas moleculares</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de microjeringa UMP3 y Micro 4 controlador de bomba de microjeringa</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>Microinyector y controlador</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

trauma cerebral aguda en ratones seguido de longitudinal dos fotones de imágenes

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Aunque el trauma cerebral aguda a menudo resulta de daño cabeza en diferentes accidentes y afecta a una fracción sustancial de la población, no existe un tratamiento eficaz para la que todavía. Limitaciones de modelos animales utilizados actualmente impiden la comprensión del mecanismo de patología. Multiphoton microscopía permite estudiar las células y los tejidos dentro de los cerebros animales intactos longitudinalmente en condiciones fisiológicas y patológicas. A continuación, describimos dos modelos de lesión cerebral aguda estudiados por medio de dos fotones de imágenes de la conducta de las células cerebrales en condiciones postraumáticas. Una región del cerebro seleccionado se lesiona con una aguja para producir un trauma de una anchura controlada y la profundidad en el parénquima cerebral. Nuestro método utiliza pinchazo estereotáxica con una aguja de jeringa, que se puede combinar con la aplicación del fármaco simultánea. Proponemos que este método se puede utilizar como una herramienta avanzada para estudiar los mecanismos celulares de consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en cerebro de los mamíferos <em&gt; In vivo. En este video, combinamos la lesión cerebral aguda con dos preparaciones: craneal ventana y el cráneo de adelgazamiento. También se discuten las ventajas y limitaciones de ambas preparaciones para imágenes multisesión de la regeneración del cerebro después de un traumatismo.

Hemos optimizado dos procedimientos de operación: 1) la ventana craneal crónica y 2) adelgazamiento del cráneo, por imagen cerebral postraumático en ratones transgénicos. Vista esquemática de las preparaciones experimentales se presenta en la Figura 1. Pinchazo traumática por aguja de acero de 0,3 mm de diámetro exterior (30 g) se aplica a la pozo perforado (Figura 1A). Una preparación de ventana del cráneo con éxito permite obtener imágenes a profundidades de hasta 650 m por debajo de ...

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Hola, soy Michel iv, investigador posdoctoral en el Centro de Neurociencia de la Universidad de Helsinki. Hola, soy Hel Stein, estudiante de posgrado en la Universidad de Helsinki. En este video describiremos un método para la aplicación de un trauma agudo local en el cerebro de un ratón, seguido de imágenes ópticas del comportamiento celular cerebral y de las condiciones postraumáticas.Sea C, la lesión aguda del cerebro es una patología grave que afecta a una proporción considerable de la población en los países desarrollados. La microscopía de múltiples fotones permite estudiar las células en su contexto tisular en el cerebro vivo de roedores bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí describimos un método de lesión aguda del cerebro aplicado mediante una punción estereotáxica con la aguja de una jeringa, seguida de un análisis mediante imagen de dos fotones del comportamiento celular cerebral y de las condiciones postraumáticas.El método de inducción estereotáxica de lesión cerebral local es una herramienta para estudiar las consecuencias fisiopatológicas del trauma agudo. En el cerebro de mamíferos, se puede dirigir específicamente una región cerebral determinada y lesionarla con una aguja fina para producir un trauma de anchura y profundidad deseadas en el parénquima cerebral. En este video, utilizaremos la lesión cerebral aguda en combinación con procedimientos de ventana craneal o adelgazamiento del cráneo, seguidos de imágenes de dos fotones de neuronas y glía en el cerebro pos traumático.Todos los experimentos presentados aquí se realizan de acuerdo con las regulaciones de la Universidad de Helsinki para experimentos con animales; el ratón se anestesia mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Se elimina un trozo de piel para exponer el cráneo y luego se fija al animal utilizando barras auriculares sobre la mesa calefactora conectada al manipulador estereotáxico. Se fija una jeringa con una aguja de acero de 0,3 milímetros de diámetro en el sistema de microinyección.El montaje de microinyección nos permite aplicar una punción traumática a un área definida del cerebro utilizando un microscopio binocular; localizamos el punto bregmático en el cráneo. Identificamos la región de interés utilizando las coordenadas estereotácticas. Taladramos suavemente y con cuidado el cráneo en el punto marcado usando un taladro quirúrgico de alta velocidad.Aplicamos la punción en el orificio perforado e introducimos brevemente la aguja en el cerebro entre 0,5 y dos milímetros de profundidad, comenzando desde el nivel del fondo del orificio. Una ventaja notable de este método es que podemos inyectar agua desionizada o fármacos en el mismo orificio pequeño y, por lo tanto, administrar soluciones con precisión en el sitio de la lesión. Para la administración de soluciones a la corteza, utilizamos un microinyector con controlador electrónico y una jeringa de 10 microlitros conectada a un manipulador estereotáctico.Cuando la punta de la pipeta de vidrio toca la superficie del cerebro, se introduce entre 0,5 y un milímetro más. Luego, se utiliza el controlador de microinyección para inyectar entre 0,5 y dos microlitros de la solución de D o del fármaco en el cerebro a una velocidad de cinco nanolitros por segundo. A continuación, se perfora suavemente el hueso alrededor del sitio de la lesión y se retira el fragmento redondo del cráneo.La superficie del cerebro se enjuaga con un tampón de corteza y se coloca encima de la abertura del cráneo una fina cubreobjetos redonda. La cubreobjetos se sella con pegamento de poli acrilamida y el soporte de acero se pega encima de la cubreobjetos. Para asegurar una fijación firme de la ventana craneal al cráneo, se coloca cemento dental alrededor de todo el soporte.El ratón anestesiado se coloca en el microscopio de dos fotones y se obtienen imágenes de las células en el sitio de la lesión dentro del cerebro vivo. Esta imagen se tomó tres horas después de la lesión cerebral. El sitio de la lesión se muestra en el cerebro de un ratón transgénico que expresa GFP bajo el promotor GFAP en astrocitos.Además de los astrocitos verdes que expresan GFP, muchas células astrocíticas se tiñen de rojo mediante la inyección de sulfur rhodamine 1 0 1. Las fibras blancas representan la señal de generación de segundo armónico, que presumiblemente visualiza las estructuras fibrilares en la matriz extracelular. La generación de segundo armónico resulta ser una herramienta valiosa para delimitar el sitio de la lesión.La señal es emitida por estructuras no simétricas centrales, como las fibras proteicas, y no requiere ninguna tinción exógena. La señal de generación de segundo armónico es más intensa en la superficie del cerebro y no se extiende profundamente en el parénquima cerebral. En esta imagen, se puede observar la acumulación de microglía activada en el sitio de la lesión.Las células microgliales se muestran en verde y la generación de segundo armónico en gris. En la proximidad del sitio de lesión, la microglía activada exhibe una morfología característica con pocos procesos ramificados mientras se prepara la superficie del cráneo. Utilice coordenadas estereotácticas para localizar el área cerebral que se va a imaginar y márquela con un bolígrafo.Evite las áreas de interés ubicadas directamente sobre los buscadores craneales porque el cráneo es menos estable en estas zonas y porque los grandes vasos subyacentes en las meninges comprometerán la calidad de la imagen. Coloque el soporte craneal codificado con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal aplicando la mínima presión posible. A continuación, coloque cemento dental alrededor del soporte y espere aproximadamente cinco minutos para que el soporte craneal quede firmemente adherido al cráneo.Lave varias veces la abertura del soporte del cráneo con PBS para eliminar el pegamento no polimerizado residual. Bajo un microscopio binocular, afine un área circular del cráneo, típicamente de 0,5 a 1,5 milímetros de diámetro, sobre la región de interés. El cráneo del ratón consta de dos capas delgadas de hueso compacto y una capa gruesa de hueso esponjoso intercalada entre ellas.El hueso esponjoso contiene pequeñas cavidades dispuestas en círculos concéntricos y múltiples canalículos que contienen vasos sanguíneos; al adelgazarse, elimine la capa externa de hueso compacto y la mayor parte del hueso esponjoso. Utilizando un microtaladro de alta velocidad, emplee aire comprimido durante la perforación para expulsar los restos óseos. Realice la perforación de forma intermitente con el fin de evitar el sobrecalentamiento del hueso provocado por la fricción.Enfríe, la parte aburrida en el líquido, mantenida a temperatura ambiente y aplique periódicamente el tampón de corteza en el área que se está adelgazando para observar el calor. Algunos sangrados de los vasos que atraviesan el hueso esponjoso pueden ocurrir durante el proceso de adelgazamiento. Este sangrado generalmente se detendrá espontáneamente en unos minutos.Utilice la imagen de generación de segundo armónico para asegurarse de que se elimine la mayor parte de este tejido óseo esponjoso. En esta etapa, el grosor del cráneo aún debe ser de al menos 50 micrómetros. Sumerja el cráneo en una gota del tampón cortical y continúe el procedimiento de adelgazamiento del cráneo utilizando una hoja microquirúrgica o una fresa de acabado microscópica para obtener una preparación muy delgada y lisa de aproximadamente 20 micrómetros de grosor y 700 micrómetros de diámetro. Durante la etapa final del proceso de adelgazamiento, examine repetidamente la preparación utilizando la imagen de generación de segundo armónico.Se puede obtener una imagen de la región elegida antes y después de provocar la lesión. Se debe obtener imágenes de varias áreas diferentes de la región delgada para controlar posibles artefactos inducidos por la cirugía en la provocación del trauma. Coloque la aguja por encima de la región delgada.Asegúrese de que no haya vasos grandes debajo. Sumerja la aguja en el cerebro entre 0,5 y dos milímetros hacia abajo según las coordenadas del sitio de aplicación de la punción. Retire la aguja y suprima la hemorragia que aparezca tras la lesión cerebral aguda.Con un tampón hemostático, espere hasta que se formen coágulos sanguíneos y disminuya la pulsación en el sitio de la lesión. Se pueden inyectar soluciones que contienen, por ejemplo, rumina de azufre 1 0 1 u otros colorantes, en la abertura de la lesión, de la misma manera que se demostró anteriormente para la preparación de la ventana craneal. A diferencia de la ventana craneal en la preparación de adelgazamiento del cráneo, el sitio de la lesión puede accederse repetidamente para la administración de fármacos y colorantes.Mantener la esterilidad de todas las operaciones ayuda a mantener la región adelgazada transparente al prevenir la inflamación. Aquí puede observarse el sitio de la lesión captado tras el adelgazamiento del cráneo. En la imagen del lado izquierdo, puede verse el lado de la lesión rodeado por dendritas marcadas con YFP de neuronas corticales 20 minutos después del trauma.La imagen derecha representa la misma área del cerebro en el mismo animal cinco días después del trauma. En esta imagen, puede observarse otro ejemplo de microscopía de dos fotones del cerebro. Tras el adelgazamiento del cráneo, el hueso puede verse mediante la señal de generación de segundo armónico mostrada en gris.En el panel izquierdo, las microglías aparecen en verde. En este montaje experimental, las microglías pueden observarse bajo el hueso alrededor del sitio de la lesión, como se muestra en el panel derecho. En el presente estudio, utilizamos tanto la ventana craneal crónica como las preparaciones de adelgazamiento del cráneo para estudiar el comportamiento celular en condiciones posatraumáticas dentro del cerebro vivo.Ambos métodos tienen ciertas ventajas y limitaciones. La ventana craneal crónica ofrece mejor resolución, mayor penetración en el tejido cerebral y la comodidad de múltiples sesiones de imagen. Por otro lado, el procedimiento de adelgazamiento del cráneo tiene menos probabilidades de inducir inflamación en el sitio de imagen y permite aplicaciones repetitivas de fármacos y colorantes.

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En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

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Entrega de una lesión cerebral traumática al cerebro de un ratón

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

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