Name: De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende un método de liberación sostenida de fármacos a la retina de rata usando Elvax 40W. Esta técnica económica permite evaluar la eficacia mediante electroretinografía para condiciones oculares crónicas.

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Esta investigación fue apoyada por el Consejo Australiano de Investigación a través del Centro de Excelencia ARC en Ciencias de la Visión (CE0561903), el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (1049990), y Progetto regionale speciale multiasse 'Reti per l'Alta Formazione' - PO FSE Abruzzo 2007-2013 - Azione 4.II.iii.

Todos los experimentos realizados fueron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y con la aprobación de la Universidad de Comité de Ética Animal de L&#39;Aquila y al Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Australia. Las ratas adultas (P100-200) se utilizan en todo este estudio. 1. Preparar los gránulos de resina de copolímero <ol><li> Coloque 20 pastillas Elvax 40W en un pequeño vaso de vidrio en la vitrina de gases. </li><li> Llenar el vaso de precipitados con 100% de etanol asegurando para cubrir todos los gránulos. </li><li> Cubrir el vaso con Parafilm, y tomar las pastillas en etanol al 100% a temperatura ambiente durante 7-10 días. NOTA: A partir de este paso adelante, no use metal o plástico para manejar o almacenar la resina. </li></ol> 2. Preparar la solución de fármaco para la carga <ol><li> Se disuelve el fármaco de elección en el 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO). Hacer la solución del fármaco hasta 40 l de volumen.Cargue la resina con tres veces la concentración de la droga que se daría en una sola dosis. </li></ol> 3. Preparar y Cargar el Complejo de resina de Drogas <ol><li> Transferir los 20 sedimentos lavados a otro pequeño vaso de vidrio. Disolver los pellets en 4 ml de diclorometano durante aproximadamente 45 min. Cubrir el vaso con Parafilm mientras que los pellets se están disolviendo. </li><li> Preparar una solución de Fast Green FCF disolviéndolo en 0,1% de DMSO a una concentración de 0,001 mg / ml. </li><li> Tome una pipeta, y elaborar 40 l de la solución de fármaco preparado con anterioridad. Cargue otra pipeta con 40 l de solución de verde rápido. </li><li> Añadir las dos soluciones simultáneamente en el vaso de precipitados. Mix rápidamente utilizando una varilla agitadora de vidrio hasta que el colorante verde se distribuye uniformemente por toda la mezcla. </li><li> Transferir inmediatamente el vaso de precipitados sobre hielo seco durante 10 min para congelar la resina ayunar. </li><li> Establecer una &quot;cámara de evaporación&quot; que se evapore el disolvente. Llene unamayor recipiente hasta un tercio con guijarros de sulfato de calcio. Crear un pozo en los guijarros, y coloque cuidadosamente el vaso de precipitados en el pozo de manera que las piedras lleguen hasta la mitad del vaso, para estabilizar el vaso en la cámara. </li><li> Cubra el recipiente fuera más grande con Parafilm. </li><li> Traslado de la cámara de evaporación al congelador. Mantener a -20 ° C durante 2-3 semanas. </li></ol> 4. preparar el complejo fármaco-resina para la implantación quirúrgica <ol><li> Retire la cámara de evaporación del congelador. Transferir el bloque de resina sólida de fármaco a un plato de vidrio se mantienen en hielo. </li><li> Con la ayuda de un microscopio o lupa, cortar un trozo de aproximadamente 0,05 mm de diámetro y 0,1 mm de longitud del bloque con una herramienta o trépano de perforación. </li><li> Envolver el resto del bloque en el material a prueba de congelación (por ejemplo, papel de aluminio) y mantener a -20 ° C hasta su utilización. </li></ol> 5. implantar quirúrgicamente el complejo fármaco-resina en la rata de ojos </p&gt; <ol><li> Preparar al animal para la cirugía. Anestesiar usando una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg / kg de peso corporal) y xilazina (12 mg / kg de peso corporal). Observar el animal hasta que se logre la anestesia completa. NOTA: El animal debe tener una pérdida de movimientos (excepto para respirar), y una pérdida de los reflejos de la córnea y de arrastre del dedo del pie. </li><li> Traslado al animal completamente anestesiado a la mesa de cirugía. Uso mydriaticum (por ejemplo, sulfato de atropina), y anestesia local (por ejemplo, clorhidrato de tetracaína) gotas en el ojo (s) sometidos a cirugía. Aplicar lágrimas artificiales para mantener la córnea húmeda durante la cirugía. Utilizar agujas desechables e instrumentos estériles durante toda la cirugía. </li><li> Estabilizar el ojo usando un par de pinzas curvas contundentes después de que el alumno esté completamente dilatado. Utilice un microscopio de operación para hacer una herida por punción de profundidad completa para llegar al vítreo, aproximadamente 2 mm desde el limbo usando una aguja de 25 G. </li><li> Inserte la pieza preparada de tél complejo fármaco-resina en la herida de punción usando un par de pinzas, puntiagudos fino (por ejemplo, pinzas) que son capaces de penetrar en el sitio de la punción. </li><li> Como profilaxis de la infección bacteriana, aplique ungüento antibiótico en el ojo, para prevenir la inflamación, así como la prevención de la sequedad de la córnea mientras el animal se está recuperando. </li><li> Observar al animal hasta la recuperación completa. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la conciencia. No devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. Si el animal muestra signos de estrés o malestar, los analgésicos deben ser utilizados de acuerdo con el protocolo de ética aprobado. </li><li> Siga los procedimientos experimentales habituales para la recolección y el análisis de los tejidos. </li><li> En la realización de experimentos, la eutanasia al animal con una inyección intraperitoneal de una pentobarbital (60 mg / kg de peso corporal) solución de clorhidrato de lidocaína al 2%. </li></ol> NOTA: Lidocaína Clorhidrato minducir al mínimo el malestar local.

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Los autores no tienen nada que la divulgación.

Este trabajo demostró el uso de un complejo de fármaco-resina para el suministro de liberación lenta de fármacos a la retina. El objetivo de presentar un método que es relativamente barato y fácil de aplicar en un modelo de pequeños animales. Dado que la función de APB es actuar como un análogo de glutamato, bloqueará la respuesta de la retina en el ojo. Los resultados muestran que APB provocó el bloqueo de la respuesta de la retina en una semana después de la implantación. Esto indica que A...

El tratamiento de enfermedades crónicas como la diabetes y la hipertensión arterial presenta muchos desafíos, ya que estas enfermedades generalmente requieren tratamiento durante largos períodos de tiempo, a menudo de por vida. Esto ha llamado para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos de liberación lenta, que reducen la necesidad de una dosificación frecuente. La eficacia de estos métodos de liberación lenta se ha demostrado mediante el desarrollo de bombas de insulina, para reducir el número de inyecciones de insulina necesarias para tratar la diabetes. Las enfermedades crónicas de los ojos, sobre todo los que afectan a sus capas internas, requieren la administración frecuente de medicamentos a través de procedimientos invasivos. Una enfermedad crónica que afecta tal que el ojo humano es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Afecta a la retina central, que es una capa de tejido neural situado en la parte posterior del ojo responsable de iniciar la visión. AMD es la principal causa de ceguera en el mundo occidental 1. Un desafío particular con el tratamiento de reenfermedades intes- es que el medicamento es necesario para llegar a esta capa profunda en el ojo, que a menudo requiere de métodos invasivos de entrega. Los fármacos se administran habitualmente a la cámara vítrea y la retina utilizando inyecciones intravítreas. Sin embargo, con cada inyección hay un riesgo de complicaciones postinyección, incluyendo endoftalmitis, desprendimiento de retina, cataratas y hemorragia del vítreo 2. Este riesgo se multiplica con cada reinyección de la droga. La reducción de la necesidad de múltiples inyecciones sería un beneficio importante en el tratamiento de la AMD. Para tratar la forma húmeda de AMD, donde el nuevo crecimiento de los vasos es un sello distintivo, la estrategia terapéutica establecida es apuntar a los factores de crecimiento endotelial (VEGF) que utilizan inhibidores del VEGF 3. En la actualidad, éstos se entregan a través de inyecciones intravítreas repetidas. Del mismo modo, en el tratamiento de edema macular, una complicación común de la retinopatía diabética, los corticosteroides se entregan a través de inyecciones repetidas <shasta&gt; 4. La entrega de estos medicamentos a través de métodos de liberación lenta de hecho podría reducir el riesgo de complicaciones inyección. La noción de un sistema de administración de fármacos de liberación lenta se describió primero usando un vehículo de caucho de silicona para entregar pequeñas moléculas en los tejidos animales 5. Desde entonces, otros métodos de liberación lenta se han desarrollado para proporcionar moléculas más grandes, varios de los cuales han sido probados en el ojo. Portadores de partículas, tales como microesferas biodegradables, poli-lactida-co-glicolida (PLGA) nanopartículas y vesículas de fosfolípidos (liposomas) pueden ser útiles como vehículos de administración 6,7. Nanopartículas y liposomas de PLGA se han comparado en un entorno in vitro por su capacidad para suministrar agentes anti-cáncer a través de la esclerótica en el tiempo 7. Ambos vehículos fueron efectivos en la liberación de los fármacos lentamente. Sin embargo, el estudio sólo se llevó a cabo en un entorno in vitro. BOCHOT et al. (2002) 8 probadosla eficacia de los liposomas para entregar moléculas a la retina in vivo. Ellos han demostrado que los liposomas entregar con éxito pequeños oligonucleótidos a la retina de conejo. Los autores sugirieron que los liposomas podrían ser beneficiosos en el tratamiento de enfermedades de la retina 8. Sin embargo, la naturaleza de estas vesículas para flotar en el humor vítreo significa que es probable que difuminar o poner en peligro la visión 9. Okabe et al. (2003) 10 no utilizan discos de polímero biodegradable compuesta por 33% de acetato de etileno-vinilo para aplicar beta-metasona en conejos. Se implantaron los discos en un bolsillo escleral y demostraron la liberación eficaz del fármaco en el humor vítreo y la retina de hasta un mes 10. Sin embargo, en este protocolo particular, el implante fue relativamente grandes y rígidos, y requiere un procedimiento quirúrgico más complejo que incluye una gran incisión escleral y la sutura. Un estudio anterior investigó el tissue respuesta a diversos vehículos de polímero por implantarlos en la córnea de los ojos del conejo, y se encontró que los copolímeros de acetato de etileno-vinilo lavadas en alcohol no causan inflamación o irritación. Estos complejos se muestran para sostener el suministro de compuestos más grandes en los tejidos animales durante largos períodos de tiempo, algunos superior hasta 100 días dependiente de la droga 11. Uno de tales tipos de resina de copolímero se ha desarrollado industrialmente en forma de Elvax 40W (40% en peso de etileno-acetato de vinilo contenido de comonómero con un aditivo de amida de &quot;W&quot; para mejorar el manejo de pellets). Esta resina de copolímero es una sustancia inerte que es estable tanto a temperatura ambiente y corporal. No se ha demostrado que causa alergia o toxicidad en el tejido biológico. Esta resina efectivamente ha entregado una gran variedad de drogas en diferentes modelos experimentales que investigan las funciones de varios sistemas, como el sistema ductal mamaria 12, la corteza auditiva primaria 13,14 &lt;/ Sup&gt;, y el sistema visual 15 rana. Esta resina también se ha utilizado en el ojo para suministrar fármacos para el desarrollo de tortuga 16,17, 18,19 embrión de pollo, y hurón adulto retinas 20. En el sistema nervioso central de la rata, la resina sólo se ha utilizado en el cerebro 21-23, pero su uso en el ojo de la rata no se ha documentado. Las ventajas del uso de esta resina de copolímero para suministrar fármacos lentamente a la retina con respecto a otros métodos, es que es un compuesto estable que no causa inflamación o irritación en el ojo. A diferencia de los portadores de partículas, el complejo fármaco-resina no perjudicar la visión después de la implantación, ya que normalmente permanece en el sitio de la entrega en lugar de flotar en el humor vítreo. Sólo se requeriría un proceso de implantación sencilla en la cavidad vítrea cerca del limbo del ojo, y no requeriría la sutura después de la implantación. Recientemente, ha habido un surgimiento en varios nuevos sistemas de suministro, tales comola tecnología de células encapsuladas (ECT) 24,25, hidrogeles 26 y 27 microfilms. Sin embargo, el método utilizado en el estudio actual para preparar y entregar el complejo fármaco-resina es a la vez fácil de seguir y de bajo costo, siendo por tanto más ventajoso para su uso en un entorno de investigación básica. El reto de la utilización de este complejo para ofrecer tratamientos farmacológicos a largo plazo es determinar la concentración óptima de la droga que va a maximizar los beneficios terapéuticos de tener un menor número de inyecciones intravítreas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar el uso del complejo fármaco-resina para el tratamiento a largo plazo de la retina de rata adulta. La eficacia de este modo de entrega se prueba utilizando el análogo de glutamato 2-amino-4-fosfonobutirato (APB) que el medicamento. APB bloquea la respuesta a la luz de las células bipolares ON imitando el glutamato, un neurotransmisor endógeno en la retina 28. Cuando APB compite con glutamato por su receptor, bloquea el light respuesta. APB se ha utilizado en estudios fisiológicos para controlar la función de la retina y medir su efecto usando métodos electrofisiológicos como el electrorretinograma (ERG). En estudios anteriores, APB se ha utilizado durante tanto a corto plazo 29 y el tratamiento a largo plazo de la retina en desarrollo; En ella se registra dar una dosis única vía inyección intraocular al día durante 30 días 30. La misma cantidad de APB (0,092 mg en solución salina estéril, a una concentración de 50 mM) se utilizó para todas las inyecciones como se sugiere en el trabajo anterior 28,29,31. Elegimos APB para poner a prueba el complejo fármaco-resina como un vehículo de liberación lenta para administrar fármacos en el ojo. Los métodos descritos en este estudio son similares a los métodos descritos anteriormente que implican la preparación de la droga-resina compleja 16,32; Sin embargo, también detalle su uso específicamente en el ojo de rata adulta. Después de la implantación quirúrgica de la resina cargada-APB en el ojo, ERG se realizó para determinar si APB suprime la rrespuesta a la luz etinal, y por lo tanto si APB ha sido lanzado con éxito en el humor vítreo y la retina.

<table><tbody><tr><td>Elvax 40W Pellets</td><td>Du Pont, DE, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EE. UU. Ácido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-amino-4-fosfonobutírico (APB)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EE. UU</td>. <td>A1910</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EE. UU</td>. <td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drierita, sulfato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EE. UU</td>. <td>238910</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, Ilium Ketamil</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina, Ilium Xilazil-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de atropina, Minims gotas para los ojos</td><td>Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetracaína, gotas oftálmicas Minims</td><td>Bausch & Lomb Pty. Ltd., Nueva Gales del Sur, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorfenicol, ungüento Chlorsig</td><td>Aspen Pharma Pty. Ltd., Nueva Gales del Sur, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, Lethabarb</td><td>Virbac Australia Pty. Ltd., Nueva Gales del Sur, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de lidocaína, Ilion Lignocaína-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., Nueva Gales del Sur, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de punzonado de un solo núcleo</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operativo, Zeiss OPMI 99</td><td>Zeiss, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Occidental Aguja de insulina de 25 G</td><td>Terumo Corp., Tokio, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de liberación lenta drug delivery través elvax 40w a la rata retina: implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Enfermedades de la retina son difíciles de tratar como la retina se encuentra profundamente dentro del ojo. Los métodos invasivos de administración de fármacos a menudo son necesarios para el tratamiento de estas enfermedades. Enfermedades de retina crónico tales como edema retinal o la neovascularización por lo general requieren múltiples inyecciones intraoculares para tratar eficazmente la enfermedad. Sin embargo, los riesgos asociados con estas inyecciones aumentan con la entrega repetida de la droga. Por lo tanto, los métodos de entrega alternativos necesitan ser establecidos con el fin de minimizar los riesgos de reinyección. Varias otras investigaciones han desarrollado métodos para administrar fármacos a través del tiempo extendido, a través de materiales capaces de liberar sustancias químicas lentamente en el ojo. En esta investigación, se describe el uso de Elvax 40W, una resina de copolímero, para actuar como un vehículo para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. La resina se hace y se carga con el fármaco. El complejo fármaco-resina se implanta en la cavidad vítrea, en donde será liberar el fármaco lentamente sobre timí. Este método fue probado usando 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), un análogo de glutamato que bloquea la luz de respuesta de la retina. Se demostró que la APB se libera lentamente de la resina, y fue capaz de bloquear la respuesta de la retina por 7 días después de la implantación. Esto indica que la administración de fármacos de liberación lenta usando esta resina de copolímero es eficaz para el tratamiento de la retina, y podría ser utilizado terapéuticamente con más pruebas.

Electrorretinograma de campo completo (ERG) se utilizó para detectar el efecto de APB en la retina. Para más detalles sobre cómo se realizó el ERG, consulte los siguientes estudios 33,34. En resumen, después de anestesiar al animal, un electrodo de oro fue colocado en la córnea del ojo, y el electrodo de referencia se colocó en el cuero cabelludo anterior entre los ojos, para registrar la actividad eléctrica de la retina. Los estímulos se generaron utilizando una unidad de flash electrónico y la intensidad va...

Este documento detalla cómo Elvax 40W se puede utilizar como un método de liberación lenta para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. El protocolo para la preparación, carga, y entrega el complejo fármaco-resina para el ojo se describe.

De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar un método relativamente sencillo y rentable para proporcionar un sistema de liberación prolongada de fármacos destinado a tratar afecciones crónicas del ojo. Esto se logra primero preparando los gránulos de resina de copolímero, creando así un vehículo para el fármaco de elección. En una segunda etapa, se combinan la solución del fármaco y D para formar el complejo de resina con fármaco.A continuación, se inserta el complejo de fármaco y resina en el ojo para garantizar la administración directa del fármaco a la retina. Se obtienen resultados que muestran la entrega exitosa del fármaco basada en la electroretinoscopia. Por lo tanto, la implicación de esta técnica se extiende hacia el tratamiento de afecciones crónicas de la retina, ya que puede ofrecer una liberación lenta del fármaco directamente al tejido diana.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como nanopartículas, hidrogeles y microcapas, es que es relativamente fácil de seguir y económica, y por consiguiente alcanzable en un entorno de laboratorio científico. El primer paso consiste en preparar los gránulos de resina d

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