Demostración de la activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) mediante la combinación de mediciones de corriente con detección de fragmentos de escisión

El objetivo general del siguiente experimento es investigar el efecto de las proteasas sobre el canal epitelial de sodio o ENaC expresado heterológicamente en ovocitos de zaplavas. Esto se logra primero midiendo la corriente total sensible a amilorida en un ovocito. Después de permitir que el ovocito se recupere, se expone a la proteasa y se vuelve a medir la corriente.

Luego, en paralelo, los ovocitos se biotinilan y se someten a inmunotransferencia para monitorear la aparición de fragmentos de corte de gamma ENaC en la superficie celular; los resultados obtenidos muestran una relación causal entre el corte del canal y su activación, basada en una combinación de la técnica de bloqueo de voltaje con dos electrodos y el enfoque de biotinilación. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la medición no planificada es que la célula puede exponerse a proteasas u otros agentes farmacológicos entre las dos mediciones durante un período de tiempo variable en un pequeño volumen de solución de prueba. Dos días después de aislar los ovocitos de zap y de inyectarlos con CN según el protocolo descrito, utilice ND 96 para llenar una jeringa de un sistema de perfusión por gravedad y ND 96 que contenga amida para llenar una segunda jeringa.

Después de montar las jeringas a 50 centímetros por encima de la cámara de baño, encienda una fuente de luz fría halógena de 150 vatios y ajústela a 10 centímetros por encima de la cámara de baño de citos, permitiendo una buena visualización con el microscopio binocular; encienda la succión y coloque el tubo de succión opuesto al adaptador del tubo de superfusión en la cámara de baño de ovocitos. A continuación, utilizando el dispositivo de control de flujo por gravedad IV, ajuste la velocidad de superfusión de cada solución a entre tres y cinco mililitros por minuto. Luego, con un adaptador, conecte los tubos de superfusión a la cámara de baño de ovocitos utilizando capilares de vidrio para pipetas micrométricas polarizados para obtener diámetros de punta menores a un micrómetro.

Luego, utilice cloruro de potasio tres molar para llenarlos aproximadamente un cuarto de su capacidad. Inserte las micropipetas en los portaelectrodos del electrodo de corriente y del electrodo de voltaje y, mediante el uso de micromanipuladores, colóquelas en ND 96 que contiene una solución de amida de dos micromolar. Para medir las corrientes totales sensibles a la amida, comience ajustando el botón de compensación de VM a cero para igualar el potencial del electrodo de voltaje y el botón de compensación de VE a cero para el electrodo de corriente.

Coloque un sitio de UO en la cámara de baño y cerca del electrodo sensor de voltaje. Luego, utilizando ambos microelectrodos, introduzca suavemente el sitio de UO, ajuste el potencial de mantenimiento del amplificador a menos 60 milivoltios y encienda el registrador gráfico. A continuación, encienda la solución que contiene amida.

A continuación, comience a grabar y, si es necesario, ajuste la ganancia. Una vez que la corriente medida alcance una meseta estable, cambie a la solución libre de amida. Cuando se alcance una meseta de corriente, vuelva a perfundir con la solución que contiene amida. Luego, cuando la corriente del sitio UO regrese a la corriente basal inicial, apague el clamp de voltaje y retire suavemente los electrodos para permitir el resellado de la membrana plasmática en los sitios de inserción.

Coloque el sitio Uoc en un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga de 100 a 150 microlitros de solución ND 96 libre de proteasa durante cinco minutos antes de transferir el sitio UOC a una solución que contenga proteasa o a una solución control sin proteasa. Durante 30 minutos posteriores a la incubación, repita la medición de corriente, deseche los ovocitos defectuosos bajo el microscopio estereoscópico y prepare anti 96 con y sin la proteasa adecuada. Prepare pipetas Pasteur etiquetándolas y flameando brevemente sus puntas para evitar dañar los ovocitos.

Llene cada pocillo de una placa de seis pocillos con 2,5 mililitros de ND 96 a temperatura ambiente o ND 96 que contenga una proteasa. A continuación, agregue 30 ovocitos por pocillo e incúbelos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de agregar 2,5 mililitros de ND 96 a los pocillos de una nueva placa de seis pocillos, transfiera cada grupo de ovocitos a un pocillo lleno con ND 96.

Trasladar las células secuencialmente a dos pocillos adicionales con ND 96 para eliminar cualquier proteasa residual e incubarlas en el pocillo final durante cinco minutos; preparar biotina en tampón de elución de biotina según el protocolo descrito en el texto. Después de colocar cada grupo de ovocitos en un pocillo que contenga 2,5 mililitros de tampón de elución de biotina, incubar durante 15 minutos con agitación suave. A continuación, tras colocar cada grupo de ovocitos en un pocillo que contenga 2,5 mililitros de tampón de bloqueo para detener la reacción de biotinilación, transferirlos a un segundo pocillo con tampón de bloqueo e incubar durante cinco minutos.

Con agitación suave, transfiera cada grupo de ovocitos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y, utilizando un mililitro de tampón de lisis suplementado con inhibidores de proteasas, lice los ovocitos pasándolos a través de una aguja de calibre 27. Centrifugue los lisados durante 10 minutos a 1500 ×g. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga TRITON X-100 y MP-40, e incube los tubos en hielo durante 20 minutos. Vortexe repetidamente los tubos para disolver las proteínas; tras equilibrar 100 microlitros de perlas de agarosa por grupo de ovocitos, añádalas a las soluciones de detergente con proteínas e incube las muestras con rotación superior durante la noche a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, centrifugue las muestras durante tres minutos a 1500 veces G. Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo para detectar fragmentos de clivaje de act en la superficie celular. Repare las muestras del gel utilizando tampón de lisis para lavar las perlas tres veces antes de agregar tampón muestral SDS-PAGE 2X. Después de centrifugar las muestras durante tres minutos a 20,000 veces G, aspire el sobrenadante y transfiéralo a nuevos tubos microcentrífugos.

Analice las muestras mediante blot de Western según el protocolo descrito para investigar si la serina proteasa plasmina puede activar corrientes mediadas por ENaC. Se determinó el delta IE de células individuales que expresan ENaC antes y después de una incubación de 30 minutos de las células en solución libre de proteasa o conteniendo plasmina. Mediante la técnica de bloqueo de voltaje con dos electrodos, como se muestra aquí, la exposición a plasmina incrementó el delta IE en cada célula medida.

En contraste, la incubación en una solución libre de proteasas tuvo un efecto despreciable. Esta figura compara el efecto de la tripsina chi sobre el ENaC de tipo silvestre y sobre el ENaC con sitios de escisión de prostasina y plasmina mutados. Como se observa aquí, el canal mutante retrasa y reduce la activación de la corriente mediada por ENaC inducida por la tripsina chi.

Además, genera un fragmento de escisión a una velocidad reducida en comparación con el canal ENaC de tipo salvaje. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo una combinación de los métodos descritos puede utilizarse para correlacionar el efecto estimulador de las proteasas sobre la ocurrencia interna con la aparición de productos de escisión en la superficie celular. Esto puede ser útil para una amplia gama de aplicaciones, por ejemplo, para abordar preguntas similares relacionadas con la regulación de otros canales iónicos, transportadores o receptores transmembrana.