Name: Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a construir un biorreactor vibratorio para estudiar células madre mesenquimales en un entorno similar a las cuerdas vocales. Este método permite analizar respuestas celulares a nivel proteico y translacional.

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Agradecemos al Dr. Jeffrey Caplan para su formación y asesoramiento sobre la imagen confocal. También agradecemos al Keck Microscopía Electrónica y Laboratorios Dr. Chaoying Ni para la asistencia SEM. Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIDCD, R01DC008965 y R01DC011377). ABZ reconoce NSF Integrativa de Posgrado Formación y programa (IGERT) para la financiación de la investigación de prácticas.

1. Asamblea biorreactor (vídeo 1) <ol><li> Hacer un molde de aluminio (matriz circular + pin espaciador) con las dimensiones internas y externas predeterminadas (Figura 1). </li><li> Usando el molde desde el paso 1.1, fabricar una membrana de silicona (diámetro: 42 mm, espesor: 1,5 mm, Figura 1) con un manguito arraigada (diámetro: 12 mm, espesor ~ 0,25 mm, en forma de por el pasador de espaciador en la Figura 1) en el medio utilizando un kit de elastómero de silicona disponible en el mercado. </li><li> Hacer un par de bloques de acrílico (Figura 2 (4, 5)) con una abertura circular (diámetro: 24 mm) en el centro, grabar la parte superior (1,8 cm de espesor) e inferior (0,9 cm de espesor) bloques con aristas coincidentes y ranuras . 10 </li><li> Emparedado de la membrana de silicona entre los bloques de acrílico pareadas. Fije el conjunto con cuatro tornillos de las esquinas con un destornillador de torsión micro ajustado a una fuerza constante (35 cN · m). Como resultado, un estanca al agua, 24 mm de ancho y 18 mm de cámara profunda vibración es creada (Figura 2C). </li><li> Montar un &quot;rango extendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por debajo de la cámara de la vibración a través de otro conjunto de tornillos de las esquinas en el bloque de acrílico inferior. En este punto, un módulo de vibración individual está montado. </li><li> Replicar siete módulos de vibraciones adicionales. Coloque cuatro de ellos a uno de dos barras de aluminio fijos (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando las bases de altavoz en orificios circulares uniformemente espaciados (diámetro: 7 cm, espesor: 2 cm) cortadas en los bares. Estabilizar cada altavoz mediante la inserción de un tornillo a través del lado de la barra de aluminio en cada agujero circular. </li><li> Controlar individualmente los altavoces por un selector de altavoces. Conectar altavoces individuales al selector uniendo cables a las entradas positiva y negativa en el cuerpo de altavoz a continuación a las salidas correspondientes en el selector. El selector del altavoz permite que la señal de tque generador de funciones, después de pasar a través de un amplificador de potencia, para alcanzar los ocho altavoces al mismo tiempo (Figura 2E). </li><li> Coloque las dos matrices de cámara, el selector de altavoces y componentes electrónicos asociados en un recinto anti-humedad. Casa todo el conjunto en una incubadora de cultivo celular comercial. </li><li> Alimentar a los cables principales (a través de un tubo de PVC de grado médico) que conecta el amplificador de potencia y el selector de altavoz a través del conjunto de filtro en la parte posterior de la incubadora. </li></ol> 2. Fabricación de la estructura y Caracterización <ol><li> Disolver gránulos de PCL en cloroformo a una concentración de 15% en peso. Cargar la solución en una jeringa de 10 ml tapado con una aguja de punta roma 21 G. </li><li> Bloquee la jeringa en una bomba de inyección programable y ajustar la velocidad de flujo a 1 ml / hr. </li><li> Coloque el colector de aluminio cubierto de aluminio a través de la aguja en posición horizontal, con una aguja de distancia de punta a colector de ~ 18 cm. </li><li> Sujete el alli positivoGator clip a la media de la aguja, y la pinza de cocodrilo de tierra al colector de aluminio, a continuación, establecer el voltaje en la fuente de alimentación de alta tensión de 15 kV. PRECAUCIÓN: alta tensión, mantener la distancia de la aguja. </li><li> Convertir secuencialmente en la bomba de jeringa y la fuente de alimentación; rápidamente limpiar / remover la solución de polímero residual que rodea la punta de la aguja con una toalla de papel seca antes de jets fibra estable y Taylor cono 19 se forman. </li><li> Dejar que las fibras se acumulan en el colector de Al con un grosor de ~ 250-300 micras (~ 7 h bajo las condiciones de hilado actuales). Guarde los andamios resultantes en un desecador de vacío durante 1-2 días para eliminar cualquier disolvente residual. </li><li> Imagen de los andamios, recubrieron por deposición con oro, utilizando un microscopio electrónico de barrido para mostrar la morfología de la fibra consistente. 10 </li></ol> 3. Asamblea biorreactor y Caracterización <ol><li> Haz un disco cilíndrico (diámetro: 8 mm) con cuatro brazos (longitud: 2mm) fuera de la estera como hilado-PCL (Figura 2A) por primera usando un punzón de biopsia de 12 mm de diámetro para cortar el diámetro exterior del disco. A continuación, utilice un segundo, 8 mm punzón de biopsia para hacer cuatro muescas 2 mm de largo espaciados uniformemente alrededor de la hoja circular de anotar dónde están las armas para cortar. Después de anotar con el punzón de 8 mm, utilizar una cuchilla de escalpelo para cortar los bordes de los brazos hacia afuera. Inserte el andamio en la ranura de la membrana de silicona a través de los brazos extendidos (Video 1). Acoplar el andamio insertado presionando suavemente la superficie con unas pinzas de cabeza plana. </li><li> Coloque un pedazo pequeño de fina lámina de aluminio (8 mm x 2 mm, de forma ortogonal, Figura 2B) al cadalso PCL para ayudar a la reflexión del láser. </li><li> Asegure la membrana de silicona / PCL andamio montado (como se detalla en el paso 1.4) en la cámara de vibración. Añadir 1,5 ml de agua en la cámara con el fin de hidratar el andamio PCL antes de la vibración. </li><li> Usando el generador de funciones, introducir señal de vibraciónALS (por ejemplo, 200 Hz ondas sinusoidales con una tensión de pico a pico, Vpp, de 0,1 V) a la cámara de acrílico intercalada. Utilice un voltímetro para medir con precisión el voltaje en cada entrada del altavoz. Nota: la lectura Vpp desde el generador de funciones será diferente de la tensión de la eventual entrega al altavoz. </li><li> Montar la LDV de un solo punto y asegurar la cabeza del sensor láser de fibra óptica en un trípode cabeza pan-tilt. Ángulo de la cabeza del sensor de manera que está apuntando perpendicular al tablero de la mesa. Conectar el cabezal del sensor LDV al módulo de adquisición de datos a través de cable coaxial entonces el módulo a la computadora portátil a través de USB. </li><li> Enfocar el haz de láser perpendicularmente a diversos puntos predeterminados en la membrana de silicona (Figura 2B y Figura 3). </li><li> Utilizando el software de adquisición de datos, registrar el desplazamiento mediados de membrana. Haga clic en &quot;Configuración de adquisición&quot; en el menú &quot;Opciones&quot;; a continuación, cambiar el modo de medición a &quot;FFT221;. A continuación, haga clic en la &quot;medición continua&quot; en la barra de herramientas principal haga clic en el pico que se forma en la frecuencia elegida (Figura 6D) para registrar el desplazamiento. </li><li> Trazar el desplazamiento mediados de membrana normal (w 0) como una función de la posición relativa a través del sustrato. Construir un mapa de colores 3D del perfil vibratoria superficie usando Origen software de análisis de datos 8.5. </li></ol> 4. Vibratorio Cultivo Celular <ol><li> MSC derivadas de médula ósea humana Sub-cultura en frascos de cultivo de tejidos T150 en una densidad de siembra inicial de 4.000-5.000 células / cm 2 en MSC medio de mantenimiento. </li><li> Después de 7-8 días de cultivo celular (hasta ~ 85% de confluencia), trypsinize las células con un reactivo de disociación celular como accutase, contar utilizando un hemocitómetro, se centrifuga (440 g durante 5 min), y volver a suspender el sedimento celular en fresca MSC medios de mantenimiento a una concentración de 4,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Sumerja el Scaffo PCLld en el 70% de etanol O / N. Después de evaporar el disolvente, exponer ambos lados del andamio para germicida de luz UV (254 nm) para 5-8 min. </li><li> Remojar el andamio PCL en una solución de fibronectina 20 mg / ml a 37 ° C durante 1 hora. Inserte el andamiaje de fibronectina recubierto en la membrana de silicona. Montar el biorreactor como se detalla en el paso 1. </li><li> Distribuir 40 l de la suspensión celular de manera uniforme en el cadalso PCL garantizado. Permitir que las células se unan durante 1-1,5 h antes de la adición de un adicional de 1,5 ml de medio fresco a la cámara de vibración. </li><li> Cultura al cadalso PCL-MSC cargado estáticamente durante 3 días y actualizar los medios de comunicación al término de la cultura estática. </li><li> Imponer regímenes de vibración seleccionados para los constructos celulares. Nota: A modo de ejemplo, las células se someten a una 1-hr-a-1-hr-desactivación (OF) de vibración a 200 Hz con aw 0 de ~ 40 m durante 12 horas al día durante un máximo de 7 días. Las construcciones sometidas a estímulos vibratorios se designan como muestras Vib y esas culturojo estáticamente en cámaras de vibraciones idénticas servir como controles estáticos (Stat). </li></ol> 5. Evaluaciones biológicas <ol><li> Recoger 200 l de medios de cultivo celular a partir de cada cámara de cada dos días (días 1, 3, 5, y 7) y agrupar las partes alícuotas de la misma muestra juntos (800 l cada uno). </li><li> Cuantificar la producción celular de la matriz metaloproteinasa-1 (MMP1) y HA mediante un kit de ELISA MMP1 Desarrollo y un kit de ELISA competitiva ácido hialurónico, respectivamente, siguiendo el procedimiento de los fabricantes. Mientras tanto, el ensayo de la producción de precursor de la elastina soluble en siguiendo el procedimiento de ELISA se informó anteriormente. 8 </li><li> Al finalizar el último ciclo de la vibración en el día 7, eliminar rápidamente los constructos celulares de las cámaras de vibración utilizando pinzas afiladas y enjuagarlos con frío tampón fosfato salino (PBS, 4 ° C) brevemente. </li><li> Para la tinción vivo / muerto, incubar las construcciones con yoduro de propidio (1:2.000 en PBS) ySyto-13 (1:1.000 en PBS) simultáneamente durante 5 min a TA. Imagen de las construcciones teñidos con un microscopio confocal multifotónica. </li><li> Por separado, complemento congelar los constructos celulares se enjuagaron con PBS en hielo seco y se extrae el ARN celular total después de un protocolo se informó anteriormente para el análisis de genes. 9 </li><li> Verificar, la cantidad y la calidad del ARN extraído usando un espectrofotómetro UV-Vis. Las muestras de ARN con A260/A280 y A260/A230 proporciones de 1.8 a 2.2 se utilizan para el análisis de qPCR posterior. </li><li> Transcribir inversamente el ARN (500 ng / muestra) en ADNc usando un kit de transcripción inversa disponibles comercialmente. </li><li> Realizar la reacción de PCR en un sistema de detección de secuencias en tiempo real usando una mezcla maestra de PCR disponible comercialmente siguiendo el procedimiento detallado anteriormente. 8 </li><li> Analizar los resultados qPCR utilizando software comercial para el análisis de datos qPCR. Para garantizar la fiabilidad de los análisis de datos, múltiples genes de referencia (YWHAZ, PDD, PPIA) se emplean como intcontroles ernal, y la varianza de las eficiencias de cebadores específicos se tiene en cuenta. 8 </li></ol>

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No existen intereses financieros en competencia.

Ingeniería con éxito de los tejidos de las cuerdas vocales funcionales in vitro requiere la recreación de un microambiente veces como vocal para mediar en el comportamiento de las células multipotentes. En general se acepta que las estructuras de tejidos u órganos reflejan las funciones que se requieren para llevar a cabo. 22 Para los tejidos de las cuerdas vocales, se proponen las vibraciones de alta frecuencia que se producen durante la fonación a ser importante para la maduración de los tejidos. E...

El pliegue vocal humano, compuesto por una capa epitelial, la lámina propia (LP) y el músculo vocal, es un tejido blando especializada que convierte el flujo de aire de los pulmones a las ondas acústicas para la producción de sonido. 1 Las cuerdas vocales oscilan regularmente durante la fonación normal, exhibiendo cepas de hasta 30% en las frecuencias fundamentales que van desde 100 hasta 300 Hz. 2 adultos vocal LP veces es una estructura compuesta de un gradiente superficial (SLP), un compuesto intermedio (ILP) y un (DLP) capa profunda. Otros grupos de clasificación del epitelio y la SLP como la capa mucosa, y combina la ILP y DLP en el ligamento vocal. 3 La capa SLP contiene principalmente una matriz amorfa con fibras colágenas escasamente dispersas, mientras que el ligamento está enriquecida con colágeno maduro y las fibras de elastina para proporcionar suficiente resistencia. 4 La estructura y la mecánica de las cuerdas vocales recién nacidos varían significativamente de sus contrapartes maduros. Aunque el mecanismos que regulan el desarrollo de las cuerdas vocales y la maduración aún no se entienden completamente, la evidencia experimental ha señalado a los roles que definen a los esfuerzos mecánicos derivados de la vocalización. Varias condiciones médicas, incluyendo el abuso de la voz, infecciones, irritantes químicos y procedimientos quirúrgicos, pueden dañar la cuerda vocal. Trastornos de las cuerdas vocales afectan a un estimado de 3.9% de la población de los EE.UU.. Los métodos actuales de tratamiento para los trastornos de las cuerdas vocales se limitan 5 y un enfoque de la ingeniería de tejidos a base de células madre se ha convertido en una estrategia prometedora para restaurar la función de las cuerdas vocales. Las células madre mesenquimales (MSC) son una alternativa adecuada a los fibroblastos de las cuerdas vocales principales para la ingeniería de tejidos vocal fold. 6-9 especificación del destino de células madre y el desarrollo del tejido posterior son mediados por el nicho específico que residen en, de los cuales la condición mecánica es un factor vital. 10 Las fuerzas mecánicas son reguladores esenciales de tejidos morfogénesis unND homeostasis, sobre todo para los tejidos que están sometidos rutinariamente a la carga. 11 Desde una perspectiva de la ingeniería de tejidos, se ha demostrado que la exposición a estímulos mecánicos fisiológicamente relevantes promueve la diferenciación de células madre y remodelación de la matriz específica de tejido. 12-15 Biorreactores de cultivo de tejidos están diseñados para simular el entorno fisiológico deseado para la célula o tejido crecimiento in vitro. Para vocal ingeniería tisular veces, es especialmente crítico para recrear el ambiente mecánico de las cuerdas vocales fonación. Un biorreactor de las cuerdas vocales ideal debe cumplir efectivamente las señales vibratorias a células de cultivo, permitiendo el control fácil sobre la frecuencia, amplitud y duración de las vibraciones. Titze y compañeros de trabajo idearon un biorreactor vocal veces (biorreactor T1) 16 que combina estiramiento estático con alta frecuencia (20-200 Hz) oscilaciones para estimular la producción celular de proteínas de la matriz. Usíng este biorreactor, Webb y colegas 17 estudiaron los efectos de 10 días-, 100-Hz vibraciones en fibroblastos dérmicos cultivados en un ácido hialurónico (HA) a base de hidrogel. Las construcciones sometidas a vibraciones mostraron una elevada expresión de HA sintasa-2 (HAS2), decorina, fibromodulina y la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), relativa a los controles estáticos. Se encontró que los efectos estimulantes de ser dependiente del tiempo. Más recientemente, nuestro grupo de 18 reunió a un biorreactor de las cuerdas vocales (biorreactor J1) con un amplificador de potencia, un generador de funciones, un altavoz cerrado y una membrana de silicona circunferencialmente ancladas que transfiere el aire oscilante a las células unidas. Fibroblastos de prepucio neonatal cultivados en el biorreactor J1 se sometieron a 1 hora de vibración a 60, 110 o 300 Hz, con una cepa en el plano de hasta 0,05%. Los resultados qPCR sugirieron que la expresión de algunos genes ECM fue alterado moderadamente en respuesta a las múltiples frecuencias vibratoriasy amplitudes. Estos diseños de biorreactores, mientras intrigante, tienen varias limitaciones. Por ejemplo, el sistema T1 requiere un gran número de conectores y barras de acoplamiento mecánico, la limitación de las frecuencias máximas alcanzables. Por otra parte, las células pueden ser sometidos a agitación y indeseable de fluido perturbación mecánica que complican la interpretación de los datos. El biorreactor J1, por otro lado, exhibe relativamente baja eficiencia de conversión de energía y no es fácil de usar. Además, la vibración con frecuencia separa los constructos de células cargado de la membrana de silicona subyacente. El J2 biorreactor de las cuerdas vocales informado aquí, diseñado basado en el mismo principio que la versión J1, está optimizado para la consistencia y reproducibilidad. Las vibraciones de fonación que imitan se generan aerodinámicamente en cámaras de vibración montados individualmente cuando poli fibrosa poblada-MSC (ε-caprolactona) (PCL) andamios son effectively asegurado. Láser Doppler vibrometría (LDV) permite al usuario verificar el perfil vibratorio del conjunto de membrana / andamio. En nuestra demostración, las MSC se exponen a 200 Hz vibraciones sinusoidales con una (DE) patrón 1-hr-a-1-hr-off para un total de 12 horas al día durante 7 días. Las respuestas celulares a las señales vibratorias impuestas son investigadas sistemáticamente. En general, el pliegue vocal J2 ofrece la mayor cantidad de funciones fáciles de usar, lo que permite estudios de cultivo celular dinámico para llevarse a cabo en un alto rendimiento y la moda reproducible.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Cura la membrana a 100 &#176; C para 2 horas</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, disuelva O/N</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSC derivadas de la médula ósea humana</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Recibido con el paso de 2</td></tr><tr><td>medios de mantenimiento MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS en medios basales suplementado con L-glutamina, gentamicina y anfotericina</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet Kit ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA Kit ELISA</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Kit</td> de transcripción inversa Life Technologies <td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Altavoz de repuesto</td><td>DAYTON audio (vía Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Cono de papel, rango completo (80-13.000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Destornillador dinamométrico Ergo Micro</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Rango de par: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>Selector de altavoces estéreo</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Potencia máxima 50 W</td></tr><tr><td>Generador de funciones&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>33220A Rango de</td><td>frecuencia 1 y micro; Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>Amplificador de potencia&nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Respuesta de frecuencia: 10 Hz-50 kHz, dos canales < altavoz/br/></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td>Bomba de jeringa <td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de alto voltaje</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Voltaje de salida: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento de pulverización catódica de oro de escritorio</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Vibrómetro láser Doppler&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Medición de velocidad sin contacto (0-22 kHz)Sistema de</td></tr> <tr><td>detección de secuencia PCR&nbsp;</td><td>Micros</td><td>ABI7300 copio</td><td></td></tr><tr><td>confocal multifotónico</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrofotómetro&nbsp;</td><td>Productos NanoDrop a través de Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos VibSoft Ancho</td> de banda de adquisición <td>Polytec</td><td></td><td>de hasta 40 MHz</td></tr><tr><td>Software de análisis de datos Origin 8.5&nbsp;</td><td>Software</td> de análisis de datos qPCR qbasePlus de OriginLab<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Aleación de aluminio&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr><tr><td>Bloques acrílicos</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara antihumedad de policarbonato</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Resistente a los impactos&nbsp; Tornillos de policarbonato</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cable/alambre</td><td></td><td></td><td></td>electrónico</tr><tr><td>Tubo de PVC de grado médico</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Jeringa transparente, biocompatible</td></tr><tr><td>de 10 ml&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aguja de punta roma</td><td>Piezas pequeñas</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2" de longitud</td></tr><tr><td>Adaptadores de pinza de cocodrilo&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia de 8 mm</td> totalmente aislado<td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? DepartamentoID=10& CategoryID=96">Sklar&nbsp; Instrumentos quirúrgicos</a></td><td>96-1152</td> Punzón de biopsia <td>estéril y desechable</td></tr> de <tr><td>12 mm</td><td>Acuderm (vía Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td></td><td>Cultivo celular tratado</td></tr></tbody></table>

construcción y caracterización de un fold biorreactor novela vocal

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

La ingeniería in vitro de tejidos mecánicamente activos requiere la presentación de condiciones mecánicas fisiológicamente relevantes a las células cultivadas. Para emular el entorno dinámico de las cuerdas vocales, se construye y caracteriza un novedoso biorreactor de cuerdas vocales capaz de producir estimulaciones vibratorias a frecuencias fundamentales de fonación. El dispositivo está compuesto por un generador de funciones, un amplificador de potencia, un selector de altavoces y cámaras de vibración paralelas. Las cámaras de vibración individuales se crean intercalando una membrana de silicona hecha a medida entre un par de bloques acrílicos. La membrana de silicona no solo sirve como fondo de la cámara, sino que también proporciona un mecanismo para asegurar el andamio cargado de celdas. Las señales de vibración, generadas por un altavoz montado debajo del bloque acrílico inferior, se transmiten a la membrana aerodinámicamente por el aire oscilante. Ocho módulos de vibración idénticos, fijados en dos barras metálicas estacionarias, están alojados en una cámara antihumedad para un funcionamiento a largo plazo en una incubadora de cultivos celulares. Las características de vibración del biorreactor de cuerdas vocales se analizan de forma no destructiva utilizando un vibrómetro Doppler láser (LDV). La utilidad del dispositivo de cultivo dinámico se demuestra mediante el cultivo de construcciones celulares en presencia de vibraciones sinusoidales de 200 Hz con un desplazamiento de la membrana media de 40 μm. Las células madre mesenquimales cultivadas en el biorreactor responden a las señales vibratorias alterando la síntesis y degradación de los componentes de la matriz extracelular relevantes para las cuerdas vocales. El novedoso sistema de biorreactor presentado en este documento ofrece una excelente plataforma in vitro para el estudio de la mecanotransducción inducida por vibraciones y para la ingeniería de tejidos funcionales de las cuerdas vocales.

Los andamios PCL fabricadas por electrospinning contienen poros intersticiales clasificadas micrón y fibras enredadas al azar con un diámetro medio de 4,7 micras (Figura 4). A un aumento superior, ranuras nanoescala y poros son visibles en fibras individuales (Figura 4B). El recubrimiento de los andamios con fibronectina mejora hidrofilicidad y facilita la adhesión celular inicial / difusión en el cadalso PCL (observación no publicada). Formas de onda sinuso...

Se construye y caracteriza un novedoso biorreactor de cuerdas vocales capaz de proporcionar estimulación vibratoria fisiológicamente relevante a las células cultivadas. Este dispositivo de cultivo dinámico, cuando se combina con un andamio fibroso de poli(ε-caprolactona), crea un entorno mimético de las cuerdas vocales que modula los comportamientos de las células madre mesenquimales.

Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar el efecto de la estimulación vibratoria sobre las células madre mesenquimales utilizando un biorreactor diseñado para emular la fonación. Esto se logra mediante la creación de andamios de poli épsilon-caprolactona para proporcionar un sustrato tridimensional para cultivos celulares similares al ligamento vocal. Como segundo paso, los andamios se incorporan en membranas de silicona, que facilitan la transducción de la oscilación hacia los constructos celulares.A continuación, se utiliza el vibrómetro láser Doppler para determinar las características vibratorias de cada combinación de andamio de membrana. Finalmente, se pueden realizar análisis mediante EISA y R-T-P-C-R cuantitativa para evaluar las respuestas celulares a nivel de proteínas y traduccional. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la laringología, como el modo en que la cuerda vocal madura y las consecuencias del mal uso vocal.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de trastornos de las cuerdas vocales debido al nivel de control celular ahora posible con este método para fabricar el andamio, primero disuelva gránulos de PCL en cloroformo a una concentración del 15 por ciento en peso. Luego cargue la solución resultante en una jeringa de 10 mililitros provista con una aguja roma de calibre 21. Fije la jeringa a una bomba de jeringa programable y ajuste la velocidad de flujo a un mililitro por hora.Luego, coloque un colector cubierto con papel de aluminio directamente frente a la aguja en posición horizontal, con una distancia entre la punta de la aguja y el colector de aproximadamente 18 centímetros. A continuación, sujete con una pinza cocodrilo positiva el centro de la aguja y conecte a tierra la pinza al colector. Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación de alto voltaje a 15 kilovoltios, teniendo cuidado de mantenerse alejado de la aguja.Luego encienda la bomba de jeringa y la fuente de alimentación. Utilice una toalla de papel seca para eliminar rápidamente la solución polimérica residual que rodea la punta de la aguja antes de que se forme el chorro estable de fibras y el cono regulado, permitiendo que las fibras se acumulen en el colector de aluminio durante aproximadamente siete horas hasta alcanzar un espesor de 250 a 300 micrómetros, y luego almacene el resultado en andamios en un desecador al vacío durante uno o dos días para eliminar cualquier disolvente residual. Los andamios de PCL contendrán poros intersticiales de tamaño micrométrico y fibras enredadas al azar con un diámetro promedio de aproximadamente 4,7 micrómetros.Con un aumento mayor, serán visibles surcos y poros a escala nanométrica en las fibras individuales para armar el biorreactor. Comience utilizando un punzón de biopsia de 12 milímetros de diámetro para cortar el diámetro exterior de un disco circular de ocho milímetros de un material de PCL recién hilado. Luego, utilice un segundo punzón de biopsia de ocho milímetros para marcar el lugar donde se realizarán los cortes de los brazos.Después de hacer las incisiones, utilice una hoja de bisturí para cortar los bordes de los brazos hacia afuera e inserte el andamio en la ranura de la membrana de silicona a través de los brazos extendidos. Aplane el andamio insertado presionando suavemente la superficie con pinzas de punta plana, y luego fije un trozo de aluminio delgado de ocho milímetros por dos milímetros al andamio de PCL. Para facilitar la reflexión del láser, asegure el andamio de PCL ensamblado en la membrana de silicona dentro de la cámara de vibración.Luego, coloque la membrana de silicona entre bloques de acrílico apareados. Sujete el conjunto con cuatro tornillos en las esquinas utilizando un destornillador de par microajustado a una fuerza constante de 35 centinewton por metro, creando una cámara de vibración hermética de 24 milímetros de ancho y 18 milímetros de profundidad. A continuación, monte un mini altavoz de rango extendido con tres patas debajo de la cámara de vibración mediante otro juego de tornillos en las esquinas del bloque de acrílico inferior, completando así el ensamblaje de un módulo individual de vibración.Después de replicar siete módulos adicionales de vibración, fije cuatro de los módulos a una de las dos barras de aluminio fijas colocando las bases de los altavoces en orificios circulares espaciados uniformemente. Realice cortes en las barras y estabilice cada altavoz insertando un tornillo desde el lateral de la barra de aluminio hacia cada orificio circular. Luego, conecte los altavoces individuales al selector conectando cables a las entradas positiva y negativa del cuerpo del altavoz y a las salidas correspondientes del selector.El selector de altavoces permite que la señal del generador de funciones, después de pasar por un amplificador de potencia, alcance los ocho altavoces simultáneamente. Luego, coloque las dos matrices de cámaras, el selector de altavoces y la electrónica asociada dentro de un recinto anti-humedad, alojando todo el conjunto en una incubadora comercial para cultivo celular. Pase los cables principales a través de un trozo de tubo de PVC de grado médico y conecte el amplificador de potencia y el selector de altavoces a través del ensamblaje de filtros en la parte trasera de la incubadora.Para caracterizar primero el biorreactor, agregue 1.5 mililitros de agua en la cámara de vibración para hidratar la estructura de PCL antes de la vibración. Luego, utilizando el generador de funciones, introduzca señales de vibración en la cámara de acrílico ensamblada. Use un voltímetro con precisión.Mida el voltaje en cada entrada del altavoz y luego ensamble el vibrómetro láser Doppler de punto único. Fije el sensor láser de fibra óptica. Colóquelo en un trípode con cabezal orientable y angule la cabeza del sensor de modo que apunte perpendicularmente a la superficie de la mesa.Luego, conecte la cabeza del sensor al módulo de adquisición de datos mediante un cable coaxial y el módulo a una computadora portátil a través del puerto USB. Enfocar el haz láser perpendicularmente en varios puntos predeterminados de la membrana de silicona y, a continuación, utilizando el software de adquisición de datos, haga clic en configuración de adquisición en el menú de opciones. A continuación, cambie el modo de medición a FFT y luego haga clic en la herramienta de medición continua en la barra de herramientas principal.Haga clic en el pico que se forma en la frecuencia elegida para registrar el desplazamiento y graficar el desplazamiento normal del medio de la membrana como una función de la posición relativa a través del sustrato. Para configurar un cultivo celular vibratorio, primero subcultive células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana en frascos de cultivo de tejidos T150 con una densidad inicial de siembra de cuatro a cinco veces 10³ células por centímetro cuadrado en medio de mantenimiento durante siete a ocho días; el día anterior al experimento, sumerja un andamio de PCL en etanol al 70 % durante la noche.A la mañana siguiente, desprenda las células con Accutase y luego centrifugue las células y resuspenda el precipitado en medio de mantenimiento fresco a una concentración de 4,5 veces 10 a la seis células por mililitro. Después de que el etanol se haya evaporado, exponga ambas caras del andamio a luz ultravioleta germicida durante cinco a ocho minutos. Luego, sumerja el andamio de PCL en una solución de fibronectina a 20 microgramos por mililitro a 37 grados Celsius durante una hora.El biorreactor como se acaba de demostrar, y luego distribuya uniformemente 40 microlitros de la suspensión celular sobre el andamiaje fijado. Deje que las células se adhieran durante una a 1,5 horas y luego agregue 1,5 mililitros adicionales de medio fresco a la cámara de vibración. Después de cultivar el andamiaje de PCL cargado con células madre mesenquimales estáticamente durante tres días, renueve el medio y luego aplique los regímenes de vibración seleccionados sobre los constructos celulares.Las frecuencias de vibración se seleccionan para reflejar las frecuencias fundamentales del habla humana, y existe una relación lineal entre el desplazamiento normal y el voltaje pico a pico en el rango de cero a 0,125 voltios. Para todas las frecuencias ensayadas a un voltaje pico a pico determinado, el desplazamiento normal disminuye a medida que la frecuencia aumenta de 100 a 300 hercios. Las respuestas celulares a las estimulaciones vibratorias se examinaron a nivel de ARNm en términos de la expresión de proteínas esenciales de la lámina vocal. Las proteínas de la matriz extracelular, como la elastina, la hialuronano sintasa uno, el colágeno tipo tres alfa uno y la metaloproteasa de matriz uno, demuestran que la vibración cíclica de una hora encendida y una hora apagada provoca un aumento de 2,3 veces en la expresión de elastina en comparación con los controles estáticos.En el día siete, las estimulaciones vibratorias también aumentan moderadamente la expresión de colágeno. Es destacable que la expresión de las principales enzimas de remodelación de la matriz extracelular, la hialuronato sintasa uno y la metaloproteasa de matriz uno, se ve significativamente aumentada por las señales vibratorias desde el día tres hasta el día siete. Las células cultivadas dinámicamente producen 4,2 ± 0,1 microgramos por miligramo por peso seco del andamiaje de elastina soluble, tal como se detectó mediante ELISA tras siete días de vibraciones.Donde los controles estáticos acumulan solo 2,7 ± 0,2 microgramos por miligramo de elastina. En promedio, siete días con vibraciones de una hora encendidas y una hora apagadas resultan en aumentos de 2,2 y 4,7 veces respecto a los controles estáticos correspondientes en la secreción de ácido hialurónico y MMP-1, respectivamente. Aunque nuestro sistema está diseñado para estudiar la fisiología en forma VOCO, también puede aplicarse a muchos otros sistemas.Por ejemplo, tejidos auriculares y dérmicos humanos. Gracias por ver este video. Buena suerte con sus experimentos.

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