Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

El objetivo general de este procedimiento es generar células progenitoras de la cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo definido, reproducible y rápido. Estas células pueden utilizarse luego para el estudio de enfermedades relacionadas con la cresta neural in vitro o para la diferenciación posterior de estas células en células derivadas. Esto se logra primero sembrando una alta densidad de células madre pluripotentes humanas en monocapa sobre matrigel.

El segundo paso consiste en diferenciar las células en células neuroepiteliales utilizando una secuencia y combinación definidas de moléculas pequeñas que afectan vías de señalización clave. A continuación, las células neuroepiteliales se replatan y se diferencian aún más en células progenitoras de la cresta neural. El paso final es aislar las células de la cresta neural mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Finalmente, se utilizan ensayos de inmunofluorescencia y funcionales, como la capacidad de migración celular, para demostrar que se generaron células de cresta neural adecuadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los protocolos existentes para la obtención de células de cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas es que es más corta. Solo dura 18 días.

Es más reproducible debido a la ausencia de células alimentadoras MS cinco. Es fácil de escalar y altamente reproducible entre líneas de células madre pluripotentes humanas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia estudios de los mecanismos de enfermedades humanas relacionadas con la línea neurore y muestran potencial para mejorar el modelado in vitro y el cribado de fármacos para estas enfermedades.

Antes de comenzar este protocolo, asegúrese de que las colonias de células madre pluripotentes humanas sean lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista y aún tengan bordes definidos con pocas células diferenciadas en sus periferias. Luego, cuando las CPMH estén listas para ser divididas, aspire el medio, lave una vez con cinco mililitros de PBS 1X y agregue cuatro mililitros de tripsina 0,05 % con EDTA a las células. A continuación, agite vigorosamente la placa horizontalmente durante dos minutos hasta que, bajo el microscopio, se observe que los fibroblastos embrionarios de ratón se desprendan de la placa como células individuales.

Las colonias de HPSC permanecerán adheridas al recipiente como colonias; luego aspire inmediata y completamente la tripsina y deje la placa a temperatura ambiente durante dos a cuatro minutos. Añada dos mililitros de medio HES a la placa y utilice una pipeta P 1000 para desprender las células. Si las células no se separan fácilmente, incube la placa durante dos a tres minutos adicionales.

A temperatura ambiente, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de medio HES, suplementado con 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 dihidrocloruro. Luego aspire el matrigel de un plato de 10 centímetros previamente tratado y siembre las células en una proporción de uno a uno o uno a dos sobre la placa tratada con matrigel. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono.

Alimente las células diariamente con medio HES hasta que estén listas para la diferenciación. Luego, inicie la diferenciación neural cuando las células alcancen una confluencia del 90 % al 100 %. Este es el día cero.

Alimente las células diariamente desde el día cero hasta el día tres con 10 mililitros de medio de diferenciación KSR que contenga 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542. Luego, en los días cuatro y cinco, alimente las células con 10 mililitros de medio que contenga 75% de medio de diferenciación KSR y 25% de medio de diferenciación And two, además de 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542. En los días seis y siete, alimente las células con medio ajustado para contener 50% de medio de diferenciación KSR y 50% de medio de diferenciación And two, además de estar suplementado con 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542.

Del día ocho al nueve, alimente las células con un medio de diferenciación de 25% KSR y un medio de diferenciación de 75% y dos, ambos conteniendo 0,1 micromolar LDN 193189 y 10 micromolar SB 4352. Luego, en los días nueve y diez, prepare placas de cultivo con laminina uno de poli-L-ornitina y fibronectina según se describe en el protocolo del texto, que se utilizarán para el resembrado de las células. En el día 11, alimente las células con medio de diferenciación N2, suplementado con 0,1 micromolar LDN 19319 y 10 micromolar SB 431542. El día 10 al 11, aspire la solución de laminina uno y fibronectina de las placas de cultivo previamente preparadas y déjelas secar a temperatura ambiente en una cabina de cultivo de tejidos durante 20 a 30 minutos.

A continuación, retire el medio de las células en diferenciación y lave las células una vez con un XPBS. Luego agregue ocho mililitros de acuate a cada placa de 10 centímetros y incube las placas durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, use un lifter celular para desprender las células y luego resuspenda las células en la solución de Accutane.

Con una pipeta de cinco mililitros, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue cinco mililitros de un XPBS al tubo y centrifugue las células durante cinco minutos a 115 G. Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de un XPBS. Luego, filtre la suspensión celular a través de un filtro para células de 40 micrones para asegurar una suspensión de células individuales.

Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Centrifugue nuevamente las células durante cinco minutos a 115 G y re suspenda las células a una concentración de 100.000 a 150.000 células por 10 microlitros de medio de diferenciación N2 suplementado. Utilice una pipeta repetidora para sembrar gotas de 10 microlitros de la suspensión celular en placas de cultivo de 15 centímetros que hayan sido previamente tratadas con poli-L-ornitina.

Laminina uno y fibronectina. Deje que las gotas reposen a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Luego, agregue muy cuidadosamente 30 mililitros del medio de diferenciación N dos suplementado a la placa sin perturbar las gotas.

Incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono. En el día 12, alimentar cuidadosamente las células con 20 mililitros de medio de diferenciación N2 que contenga 200 micromolares de ácido ascórbico, 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro, 100 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos 8 y 20 nanogramos por mililitro de sonic hedgehog por placa de 15 centímetros.

Luego, desde el día 14 hasta el día 17, alimente las células cada dos o tres días con medio de diferenciación N2 que contenga únicamente 200 micromolares de ácido ascórbico, 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 100 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos ocho. Prepare placas con laminina poli-L-ornitina y fibronectina el día 16 y 17 para su uso en el resembrado de las células de la cresta neural.

Después del análisis por fax el día 18, tras haber separado las células mediante clasificación de células por fluorescencia, cuente las células de la cresta neural y luego centrifúguelas a 115 G durante cinco minutos. Re suspenda el botón celular en medio de diferenciación N dos suplementado con 10 nanogramos por mililitro.

FGF dos 20 nanogramos por mililitro de EGF y 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 dihidrocloruro a una concentración de 30.000 células por 10 microlitros. Seque completamente las placas de cultivo previamente preparadas con poli-L-ornitina, laminina uno y fibronectina. A continuación, siembre aproximadamente de 50 a 70 gotas de la suspensión celular por placa de 10 centímetros.

Incubar las células a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos en 20 mililitros de medio de diferenciación N2 suplementado con 10 nanogramos por mililitro de FGF2, 20 nanogramos por mililitro de EGF y 10 micromolar de Y-27632 dihidrocloruro, en cada placa de 10 centímetros, sin perturbar las gotas.

A continuación, incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono. Tras la incubación, mantener y pasar las células de cresta neural según el protocolo de texto adjunto; las células de cresta neural se obtuvieron a partir de células madre pluripotentes humanas en 18 días. Utilizando este nuevo protocolo de diferenciación in vitro libre de células alimentadoras.

El análisis de fax realizado el día 18 identificó células positivas tanto para HNK-1 como para P75, lo que confirmó la presencia de células de la cresta neural. En ambos protocolos, el de diferenciación libre de células alimentadoras y el dependiente de células alimentadoras, las células de la cresta neural pasaron por una etapa de roseta neural. Además, las células separadas por citometría de flujo presentan morfología idéntica y expresan los marcadores de la cresta neural, HNK-1 y AP2. Una comparación de la expresión génica global de células de la cresta neural derivadas de estos dos protocolos de diferenciación reveló que ambos conjuntos de células se agrupan estrechamente.

El análisis de la capacidad de migración de las células de la cresta neural derivadas mediante el protocolo libre de células alimentadoras mostró que las células migraron exitosamente hacia el área rayada tras 48 horas. Estas células también tienen el potencial de diferenciarse en células del sistema nervioso autónomo, tal como se confirmó mediante tinción positiva para mash one y touch one tras cuatro días adicionales de diferenciación. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo neuralizar células madre pluripotentes humanas y derivar células progenitoras de la cresta neural in vitro.