Name: Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a derivar células progenitoras de la cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo libre de alimentadores. Este método de 18 días utiliza moléculas pequeñas y clasificación por citometría de flujo para facilitar el estudio de enfermedades relacionadas con la cresta neural.

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Este trabajo fue apoyado por una beca para investigadores avanzados de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por medio de donaciones de NYSTEM (C026446; C026447) y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).

1. Preparación de medios de cultivo, placas revestidas y Mantenimiento de hPSCs Preparación 1.1 Medios Nota: todos los medios de filtro para la esterilización y se almacenan a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Números de los nombres de Reactivos para la empresa y catálogo se listan en la Tabla de Materiales. <ol><li> DMEM/10% de SFB: Combinar 885 ml DMEM, FBS 100 ml, 10 ml penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina. </li><li> HES-medio: Combinar 800 ml de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 10 ml de MEM mínimo de solución aminoácidos esenciales, 1 ml β-mercaptoetanol. Añadir 10 ng / ml de FGF-2 después de filtrar el medio. PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es tóxico, evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel. </li><li> Medio KSR-diferenciación: Combinar 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamina, 10 ml penicilina / estreptomicina, 10 ml MEM mínima solución aminoácidos esenciales y 1 ml β-mercaptoetanol. </li><li> N2-differentiatien un medio: Disolver 12 g de polvo en 980 ml ​​de DMEM/F12 dH 2 O, añadir 1,55 g de glucosa, 2 g Bicarbonato sódico y 100 mg APO transferrina humana. Mezclar 2 ml de dH2O con 25 mg de insulina humana y 40 l de NaOH 1 N, añadir la solución disuelta para el medio. Añadir 100 l de dihidrocloruro de putrescina, 60 l de selenito, 100 l progesterona y llevar el volumen hasta 1 litro con dH 2 O. </li></ol> 1.2 Recubrimiento de placas de cultivo <ol><li> Revestimiento Matrigel: Descongelar 1 ml congelados alícuota matrigel al vaso 19 ml DMEM/F12 sobre la alícuota hasta que se haya disuelto. Eliminar grumos haciéndola pasar a través de un filtro de células de 40 micras y la placa 8 ml/10 cm plato. Incubar los platos durante 1 hora a TA. Aspirar el matrigel inmediatamente antes placas las células. Nota: Trabaje rápidamente con matrigel porque puede agruparse a temperaturas superiores a 4 ° C. </li><li> Recubrimiento PO / Lam / FN: Añadir 10 ml de 1x PBS que contenía 15 mg / ml bromhidrato de poli-L ornitina a una placa de 10 cm. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Lavar las placas con PBS 1x vez y añadir 10 ml/10 cm plato de 1x PBS que contenía 2 mg / ml ratón laminina-I y 2 mg / ml de fibronectina. Incubar los platos durante la noche a 37 ° C. Antes de placas las células, eliminar completamente la solución y deje que los platos se sequen completamente a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos en pie para arriba en la pared campana de cultivo de tejidos sin la tapa puesta. Nota: Los platos son completamente seca y lista para la siembra celular cuando uno puede ver las estructuras de cristal en la superficie (visible a simple vista). Las placas se pueden mantener a temperatura ambiente durante unas pocas horas en este estado seco. Platos PO / Lam / FN tienen que estar preparados 2 días antes de tiempo. En casos de emergencia Lam / FN puede incubarse por tan solo 2-4 horas. Sin embargo, esto puede poner en riesgo los resultados de la diferenciación / supervivencia subóptimos. </li></ol> 1.3 Mantenimiento de hPSCs Nota: hPSCs se mantienen en el 0,1% de gelatina y el ratón mitóticamente inactivados fibroblastos embrionarios (MEFS) en HES-medio suplementado con 10 ng / ml de FGF-2 como se describe previamente 10,12. Las células deben dividirse cada 6-8 días. <ol><li> Escudo un plato de 10 cm con 8 ml de 0,1% de gelatina (en 1x PBS sin magnesio o calcio) a TA durante 5 min. </li><li> Descongele MEFs congelados rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 1 millón de MEFs a 10 ml de DMEM/10% de FBS. </li><li> Aspirar la gelatina y la placa de las células. Incubar a 37 ° C durante al menos 6 horas. </li><li> Aspirar el FBS DMEM/10% de la placa de MEF preparado, lavar la placa con 1x PBS una vez y añadir 10 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro. Dejar que el medio se caliente a 37 ° C durante 20 min. Nota: Para la división manual hPSCs se utiliza una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado. Sin embargo, las células pueden ser pasadas utilizando métodos alternativos apropiados. </li><li> Bajo una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado, separar colonias separadas de utilizar una grúa móvil y permiten flotar. </li><li> Utilice un1 ml jeringa para aspirar las colonias flotantes y enviarlos a la placa MEF fresco, cálido. Transferir aproximadamente un cuarto de las células para el nuevo plato. Se incuba a 37 ° C. </li><li> Alimente células diariamente con medio HES fresco. </li></ol> 2. Plating de hPSCs de Diferenciación Nota: hPSCs deben dividir o chapada de diferenciación cuando las colonias son grandes, pero todavía tienen bordes afilados con tan poco como posibles células que se diferencian en sus fronteras (véase la Figura 1B). Cuando las células se mantienen utilizando pases manual de las colonias deben ser lo suficientemente grandes para ser fácilmente visto por el ojo. Para conseguir la sensación adecuada para este punto en el tiempo se puede mantener un plato HPSC separada por dos semanas sin pases y ver las células alcanzan y pasar el punto de tiempo ideal para pases / diferenciarlas. <ol><li> Preparar platos de 10 cm con matrigel 1 hora antes de iniciar la diferenciación. Revestimiento de matrigel acertada puede serverificado en la magnificación de 4x. </li><li> Cuando los hPSCs están listos para ser dividido, aspirar el medio y añadir 4 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a las células. </li><li> Agite el plato horizontalmente durante 2 min vigorosamente hasta que uno puede ver los MEFs como células individuales de elevación de la placa bajo el microscopio. Las colonias HPSC permanecen unidos como colonias. </li><li> Inmediatamente ya fondo, aspirar la tripsina y dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2-4 min. </li><li> Añadir 2 ml de HES-medio a la placa y el uso de una pipeta P1000, separar las células. Nota: Si las células no se pueden levantar fácilmente la superficie, la placa se puede incubar vacío a TA durante otros 2-3 min. </li><li> Transferir las células a 8 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro. </li><li> Aspirar el Matrigel a partir de un preparado previamente placa de 10 cm. Placa las células a una proporción de 1:1 o 1:2 (por ejemplo: Las células de una placa de 10 cm se dividen en dos placas de 10 cm) en la placa de Matrigel. Incubar a 37 °C durante la noche. Nota: Este chapado debe dar lugar a aproximadamente 100.000 células / cm 2. </li></ol> 3. La inducción de la diferenciación neuronal Nota: La diferenciación puede ser iniciado (día 0) cuando las células son confluentes al 90-100% (véase la Figura 1C), por lo general el día siguiente. Si la confluencia exacta no se alcanza, sin embargo, las células pueden ser alimentados diariamente con HES-medio hasta que estén listos para la diferenciación. Alternativamente, el número inicial de células sembradas se puede aumentar. <ol><li> En el día 0 a 3, alimentar a las células diariamente con 10 ml/10 cm plato medio KSR-diferenciación que contiene 0,1 LDN193189 mu M y 10 M SB431542. </li><li> En el día 4 y 5 de alimentación de las células con 75% de medio KSR-diferenciación y 25% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542. </li><li> En el día 6 y 7 de alimentación de las células con 50% de medio KSR-diferenciación y 50% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542. </li><li> En el día 8 y 9 de alimentación de las células con 25% de medio KSR-diferenciación y 75% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542. </li><li> El día 9 y 10 se preparan platos PO / Lam / FN, como se indica en el punto 1.2.2 para replating de las células en el día 11. </li><li> El día 10 las células de alimentación con medio N2-diferenciación que contiene LDN193189 y SB431542. </li></ol> 4. Replating en Gotitas por NC Especificaciones <ol><li> El día 11 de aspirado Lam / FN de las placas preparadas con anterioridad y deje que se sequen por completo a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, como se explica en el punto 1.2.2. </li><li> Retire medio de las células diferenciadoras, se lavan las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Utilizando un elevador de celular, separar las células y resuspender en accutase con una pipeta de 5 ml. Transferir la suspensión a un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de 1x PBS y girar las células durante 5 min a 114 x g. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de 1x PBS. Para garantizar una única suspensión de células, filtrado a través de un filtro de células de 40 micras y contar las células usando un hemocitómetro o una técnica equivalente. </li><li> Girar las células hacia abajo y volver a suspender en medio N2-diferenciación que contiene 200 mM de ácido ascórbico (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml de FGF8, 20 ng / ml de SHH, 10 mM de Y-27632 de dihidrocloruro a la concentración de 100 000 -150.000 células/10 l. </li><li> Usando una pipeta de repetición-, placa 10 l gotitas cerca uno del otro sin que toquen a la PO seca / Lam / FN 15 cm de platos. Nota: Una placa de 10 cm de células diferenciadas que normalmente se traduce en aproximadamente 2-3 veces 15 cm de platos o de aproximadamente 100 x 10 cm l droplets/15 plato. </li><li> Deje que las gotitas de pie a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, luego con mucho cuidado (no molestar a las gotas) añadir 30 ml de N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y y se incuba a 37 ° C. </li><li> El día 12, se alimentan con cuidado las células con 20 ml/15 cm N2/AA/BDNF/FGF8/SHH plato. </li><li> De day 14-17 alimentar las células cada dos o tres días con N2/AA/BDNF/FGF8. </li><li> El día 16 y 17 de la preparación / placas Lam / FN PO a replate NC células después de la separación FACS. </li></ol> 5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de células NC Nota: La preparación de las células para FACS requiere aproximadamente 2 horas. <ol><li> El día 18 a medio quitar, lavar las células una vez con PBS 1x en el plato y añadir 12 ml accutase. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Utilizando un elevador de celular, separar las células de la superficie y permiten flotar. Pipetear las células en suspensión utilizando una pipeta de 5 ml, transferir a un tubo de 50 ml y añadir 30 ml de PBS 1x. Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g. </li><li> Usando una pipeta P1000, resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS (el HBSS contiene 15 mM de HEPES). Añadir 19 ml de 2% de FBS / HBSS y filtrar las células a través de un filtro de células de 40 micras para asegurar una suspensión de células individuales. Se incuban las células en hielo durante 15 men para el bloqueo de anticuerpos y luego contarlos utilizando un hemocitómetro. </li><li> Girar las células hacia abajo y resuspender a la concentración de 10 millones de células / ml en FBS al 2% / HBSS. </li><li> Ponga a un lado 1 millón de células cada uno por la mancha, de un solo manchado (HNK-1 sólo y únicamente p75) y anticuerpo secundario manchado solamente (APC solamente y 488 solamente) FACS controla. </li><li> Añadir 5 l de HNK-1 y 5 l de p75 anticuerpo primario por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo. </li><li> Lavar las células en 10 ml de PBS 1x (centrífuga 5 min a 114 xg) y resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Añadir 2 l de APC y 1 l de anticuerpo secundario 488 por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo en la oscuridad. Nota: APC y 488 son los anticuerpos secundarios utilizados aquí para la tinción HNK-1 y p75, respectivamente. </li><li> Se lavan las células en 10 ml de 1x PBS dos veces, volver a suspender 10 millones de células en 500 l de2% de FBS / HBSS que contenía DAPI (a 0,5 ng / l) o tinción de células alternativa apropiada en vivo para excluir las células muertas del análisis FACS. </li><li> Transferir las muestras de apropiarse tubos de FACS. </li><li> Preparar tubos de FACS con 0,5 ml de FBS al 2% / HBSS para la recolección de células. Nota: Las células y los tubos de recogida se mantienen en hielo en la oscuridad durante el tiempo de clasificación. </li><li> Usando una máquina de clasificación de células con rayos láser que pueden detectar DAPI, APC y 488 especie DAPI-/HNK-1 + / P75 + células dobles positivas. Nota: El tiempo de preparación y la manipulación de las células conduce a un pequeño porcentaje de muerte celular, DAPI manchas células muertas sólo por lo que permite a estas células para ser excluidos de la población ordenada. Cualquier mancha en vivo / muerto alternativa funciona igual de bien para este propósito. DAPI en sí no causa citotoxicidad en la población de células vivas. </li></ol> 6. Replating de células clasificadas, Mantenimiento NC y Expansión Nota: las células FACS ordenados deben ser parteconducido con especial cuidado para asegurar la supervivencia óptima. Manténgalos en hielo hasta resiembra ellos. No agite ni pipetear con dureza. Las células se pueden resuspendieron accionando el tubo. <ol><li> Después de la separación FACS, contar las células NC, a continuación, girar hacia abajo y resuspender en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 en el volumen apropiado para replate ellos en 30.000 células / 10 gotas mu l. </li><li> Seque bien previamente preparado / placas Lam / FN PO y placa aproximadamente 50 a 70 gotas por placa de 10 cm. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min. </li><li> Añadir mucho cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sin molestar a las gotas. Se incuban las células a 37 ° C. </li><li> Alimentar a las células cada 2-3 días con N2/FGF2/EGF. Nota: NC células se expanden o se pasaron aproximadamente cada 4-5 días o cuando empiezan a acumular dentro de las gotitas. </li><li> Para el paso de las células NC, eliminar el medio, wash las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Pipetear las células de la placa usando una pipeta de 5 ml y transferir a un tubo de 15 ml. Añadir 6 ml 1x PBS. </li><li> Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g. </li><li> Resuspender las células en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 con el fin de tener 20.000 células/10 l gotita. </li><li> Replate las células en 10 gotas mu l en placas de PO / Lam / FN secas. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min. </li><li> Añadir con cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Se incuba a 37 ° C. Nota: NC células pueden mantenerse o ampliarse hasta por 2 semanas como progenitoras población relativamente homogénea. Cultura ya puede llevarlos a diferenciarse en diversos tipos de células progenie. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Para la diferenciación de las células exitosa R-NC de células madre / hiPSCs deben hacerse las siguientes consideraciones. Es fundamental trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. En particular, es importante para poner a prueba las culturas HPSC para contaminación por micoplasma regularmente, ya que esto impedirá la contaminación diferenciación exitosa, pero no puede fácilmente ser detectado visualmente en cultivos de HPSC. La diferenciación R-NC debe iniciarse con la densidad celular 90-100%; menor...

Las células madre embrionarias (células madre) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) han demostrado un enorme potencial, en particular para la investigación y el tratamiento futuro de enfermedades humanas para las que están disponibles ni los buenos modelos animales ni los tejidos primarios. Ejemplos de aplicación de la tecnología de células madre / hiPSC son los siguientes: Las células de especial interés pueden ser generados a partir de células madre / hiPSCs para la medicina regenerativa en cantidad ilimitada 1. Las células pueden producirse a partir de pacientes portadores de una enfermedad específica y se utiliza para establecer en modelos de enfermedad in vitro 2,3. Tales modelos de enfermedad pueden ser empleados para la detección de drogas a gran escala en la búsqueda de nuevos compuestos farmacológicos 4, así como las pruebas de los medicamentos existentes para la eficacia y la toxicidad 5. Modelos in vitro de enfermedades pueden conducir a la identificación de los mecanismos de las enfermedades nuevas. Para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC es importante trabajar con específica, bien definirtipos d células afectadas en la enfermedad de interés. Por lo tanto, la disponibilidad de protocolos de diferenciación in vitro sólidas y reproducibles en es crucial para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / hiPSC. Los protocolos son deseables que muestran una variabilidad mínima, gasto de tiempo, esfuerzo, dificultad y costo, así como la reproducibilidad máxima entre las líneas de células madre / hiPSC y diferentes investigadores. Las células de la cresta neural (NC) emergen durante neurulation vertebrados entre la epidermis y el epitelio neural. Ellos proliferan y migran ampliamente en todo el embrión en desarrollo y dan lugar a una impresionante diversidad de tipos de células progenie, incluyendo el hueso / cartílago, el esqueleto craneofacial, los nervios sensoriales, las células de Schwann, melanocitos, células de músculo liso, las neuronas entéricas, las neuronas autónomas, células cromafines , células cardiacas tabique, los dientes y las células glandulares suprarrenal / tiroideas 6. Por lo tanto, las células NC son un tipo de célula atractivo para el campo de células madre e importante para lamodelización de una variedad de enfermedades, como la enfermedad de Hirschsprung 7, disautonomía familiar 8, así como cánceres tales como el neuroblastoma 9. Además, ofrecen la posibilidad de estudiar los aspectos del desarrollo embrionario humano in vitro. El actualmente disponibles y ampliamente aplicado en protocolo de diferenciación in vitro para la derivación de células NC de hESCs 10,11 requiere hasta 35 días de diferenciación y que implica la inducción neural en células alimentadoras tales como células del estroma MS5 y por lo tanto se lleva a cabo bajo condiciones de mal definidos. Si bien puede ser en mayor escala para generar grandes cantidades de células NC, por ejemplo se requiere para la detección de drogas de alto rendimiento 4, se trata de mano de obra y costos de obra. Además, se trata de pases manual de las rosetas de los nervios, que pueden ser difíciles de reproducir y por lo tanto está sujeta a la variabilidad general, en particular cuando se aplica a una gran variedad de células madre o hiPSClíneas. Aquí, se muestra la derivación gradual de células NC en un protocolo de 18 días que está libre de células alimentadoras. Este método es más corto y más definido que el protocolo utilizado actualmente. Además, es muy robusto en la generación de células NC entre diferentes líneas hiPSC. Es importante destacar que se ha demostrado que las células NC producidas por ambos protocolos surgen en la frontera de los rosetones de los nervios (en lo sucesivo denominado roseta-NC o R-NC). Las células derivadas utilizando cualquiera de los dos protocolos parecen morfológicamente idénticas, expresan los mismos marcadores NC y se agrupan en el análisis de microarrays. NC células derivadas usando el nuevo protocolo (R-NC) son funcionales, similar a las células derivadas NC usando el protocolo antiguo (MS5-R-NC) tal que pueden migrar y diferenciarse en neuronas más. Por lo tanto, las células se pueden utilizar simultáneamente con las células MS5-R-NC. El protocolo de células R-NC para la derivación de células NC de células madre / IPSC será útil para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC que implica el linaje NC. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Suero knockout de reemplazo</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>El lote debe ser probado</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicinlina/Estreptomicina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM solución de aminoácidos esenciales mínimos&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>tóxico FGF humano recombinante básico (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 polvo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APO transferencia humana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Insulina humana&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de putriscina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenita</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L Hidrobromuro de ornitina</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de ratón-I</td><td>R& amperio; D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa en la solución salina equilibrada de Hank 5 U/ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologías Celulares Innovadoras</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Erizo sónico recombinante para ratón (SHH)</td><td>R& D Systems</td><td>464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1563-080</td><td></td></tr><tr><td>EGF recombinante humano</td><td>R& D Systems</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>gelatina (PBS sin Mg/Ca)</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td><td>Sigma</td><td>C6680-100TST</td><td>se debe analizar</td></tr><tr><td>el lote Anti-p75 mIgG1 (receptor del factor de crecimiento nervioso)</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>El lote AB-N07</td><td>debe ser probado</td></tr><tr><td>APC rata anti-mIgM</td><td>BD Parmingen</td><td>550676</td><td>lote debe ser probado</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG1&nbsp;</td>El lote de <td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>debe ser analizado</td></tr><tr><td>Anti Oct4 mIgG2b (utilizado en dilución 1:200)</td><td>El</td> lote <td>Santa Cruz sc-5279</td><td>debe ser analizado</td></tr><tr><td>Material/Equipo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón (7 millones de células/vial)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular: placas de 10 cm y 15 cm, tubos de centrífuga, tubos FACS, pipetas, pipetas Consejos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematocitómetro</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de cultivo</tr><tr><td>celular Incubadora de cultivo celular (CO2, humedad y temperatura controladas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar para cultivo celular con microscopio</td><td></td><td></td><td></td>integrado</tr><tr><td>Campana</td><td></td><td></td> <td>de bioseguridad para cultivos celulares</td></tr><tr><td>Máquina clasificadora de células, i.e. MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>invertido</tr><tr><td>1 ml Jeringa TB 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células Polietileno</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

derivación-feeder libres de células progenitoras de la cresta neural pluripotentes células madre

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen un gran potencial para el estudio de desarrollo embrionario humano, para el modelado de enfermedades humanas en el plato y como una fuente de células trasplantables para aplicaciones de regeneración después de la enfermedad o accidentes. Células de la cresta neural (NC) son los precursores para una gran variedad de células somáticas adultas, tales como células del sistema nervioso periférico y glía, melanocitos y células mesenquimales. Ellos son una valiosa fuente de células para estudiar aspectos del desarrollo embrionario humano, incluida la especificación del destino celular y la migración. Además diferenciación de las células progenitoras NC en tipos de células diferenciadas terminalmente ofrece la posibilidad de modelar enfermedades humanas in vitro, investigar mecanismos de la enfermedad y generar células para la medicina regenerativa. En este artículo se presenta la adaptación de un protocolo vitro disponibles actualmente en la diferenciación para la derivación de células NC desde hPSCs. Este nuevo protocolo requiere 18 días de diferenciación, es-alimentador libre, fácilmente escalable y altamente reproducible entre células madre embrionarias humanas (hESC) líneas, así como células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas. Ambos viejos y nuevos protocolos producen células NC de igual identidad.

Las dos mejoras más importantes del protocolo R-NC a través del protocolo MS5-R-NC 11 son las condiciones de diferenciación, definidos libres de alimentador y el acortamiento general del requisito de tiempo. Células alimentadoras MS5 13 son de médula ósea células del estroma derivadas murinas que han sido mostrados para apoyar la diferenciación neural de hESCs 14. Células madre embrionarias humanas cultivadas sobre células alimentadoras MS5 en estructuras de baja densidad de formulario e...

Las células de la cresta neural (NC) derivadas de células madre pluripotentes humanas (HPSC) tienen un gran potencial para modelar el desarrollo humano y las enfermedades y para las terapias de reemplazo celular. Aquí, una adaptación libre del alimentador ampliamente utilizado en la actualidad<em&gt; In vitro</em&gt; Protocolo de diferenciación para la derivación de células NC de hPSCs se presenta.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células progenitoras de la cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo definido, reproducible y rápido. Estas células pueden utilizarse luego para el estudio de enfermedades relacionadas con la cresta neural in vitro o para la diferenciación posterior de estas células en células derivadas. Esto se logra primero sembrando una alta densidad de células madre pluripotentes humanas en monocapa sobre matrigel.El segundo paso consiste en diferenciar las células en células neuroepiteliales utilizando una secuencia y combinación definidas de moléculas pequeñas que afectan vías de señalización clave. A continuación, las células neuroepiteliales se replatan y se diferencian aún más en células progenitoras de la cresta neural. El paso final es aislar las células de la cresta neural mediante clasificación celular activada por fluorescencia.Finalmente, se utilizan ensayos de inmunofluorescencia y funcionales, como la capacidad de migración celular, para demostrar que se generaron células de cresta neural adecuadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los protocolos existentes para la obtención de células de cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas es que es más corta. Solo dura 18 días.Es más reproducible debido a la ausencia de células alimentadoras MS cinco. Es fácil de escalar y altamente reproducible entre líneas de células madre pluripotentes humanas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia estudios de los mecanismos de enfermedades humanas relacionadas con la línea neurore y muestran potencial para mejorar el modelado in vitro y el cribado de fármacos para estas enfermedades.Antes de comenzar este protocolo, asegúrese de que las colonias de células madre pluripotentes humanas sean lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista y aún tengan bordes definidos con pocas células diferenciadas en sus periferias. Luego, cuando las CPMH estén listas para ser divididas, aspire el medio, lave una vez con cinco mililitros de PBS 1X y agregue cuatro mililitros de tripsina 0,05 % con EDTA a las células. A continuación, agite vigorosamente la placa horizontalmente durante dos minutos hasta que, bajo el microscopio, se observe que los fibroblastos embrionarios de ratón se desprendan de la placa como células individuales.Las colonias de HPSC permanecerán adheridas al recipiente como colonias; luego aspire inmediata y completamente la tripsina y deje la placa a temperatura ambiente durante dos a cuatro minutos. Añada dos mililitros de medio HES a la placa y utilice una pipeta P 1000 para desprender las células. Si las células no se separan fácilmente, incube la placa durante dos a tres minutos adicionales.A temperatura ambiente, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de medio HES, suplementado con 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 dihidrocloruro. Luego aspire el matrigel de un plato de 10 centímetros previamente tratado y siembre las células en una proporción de uno a uno o uno a dos sobre la placa tratada con matrigel. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono.Alimente las células diariamente con medio HES hasta que estén listas para la diferenciación. Luego, inicie la diferenciación neural cuando las células alcancen una confluencia del 90 % al 100 %. Este es el día cero.Alimente las células diariamente desde el día cero hasta el día tres con 10 mililitros de medio de diferenciación KSR que contenga 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542. Luego, en los días cuatro y cinco, alimente las células con 10 mililitros de medio que contenga 75% de medio de diferenciación KSR y 25% de medio de diferenciación And two, además de 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542. En los días seis y siete, alimente las células con medio ajustado para contener 50% de medio de diferenciación KSR y 50% de medio de diferenciación And two, además de estar suplementado con 0,1 micromolar de LDN 193189 y 10 micromolar de SB 431542.Del día ocho al nueve, alimente las células con un medio de diferenciación de 25% KSR y un medio de diferenciación de 75% y dos, ambos conteniendo 0,1 micromolar LDN 193189 y 10 micromolar SB 4352. Luego, en los días nueve y diez, prepare placas de cultivo con laminina uno de poli-L-ornitina y fibronectina según se describe en el protocolo del texto, que se utilizarán para el resembrado de las células. En el día 11, alimente las células con medio de diferenciación N2, suplementado con 0,1 micromolar LDN 19319 y 10 micromolar SB 431542. El día 10 al 11, aspire la solución de laminina uno y fibronectina de las placas de cultivo previamente preparadas y déjelas secar a temperatura ambiente en una cabina de cultivo de tejidos durante 20 a 30 minutos.A continuación, retire el medio de las células en diferenciación y lave las células una vez con un XPBS. Luego agregue ocho mililitros de acuate a cada placa de 10 centímetros y incube las placas durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, use un lifter celular para desprender las células y luego resuspenda las células en la solución de Accutane.Con una pipeta de cinco mililitros, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue cinco mililitros de un XPBS al tubo y centrifugue las células durante cinco minutos a 115 G. Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de un XPBS. Luego, filtre la suspensión celular a través de un filtro para células de 40 micrones para asegurar una suspensión de células individuales.Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Centrifugue nuevamente las células durante cinco minutos a 115 G y re suspenda las células a una concentración de 100.000 a 150.000 células por 10 microlitros de medio de diferenciación N2 suplementado. Utilice una pipeta repetidora para sembrar gotas de 10 microlitros de la suspensión celular en placas de cultivo de 15 centímetros que hayan sido previamente tratadas con poli-L-ornitina.Laminina uno y fibronectina. Deje que las gotas reposen a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Luego, agregue muy cuidadosamente 30 mililitros del medio de diferenciación N dos suplementado a la placa sin perturbar las gotas.Incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono. En el día 12, alimentar cuidadosamente las células con 20 mililitros de medio de diferenciación N2 que contenga 200 micromolares de ácido ascórbico, 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro, 100 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos 8 y 20 nanogramos por mililitro de sonic hedgehog por placa de 15 centímetros.Luego, desde el día 14 hasta el día 17, alimente las células cada dos o tres días con medio de diferenciación N2 que contenga únicamente 200 micromolares de ácido ascórbico, 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 100 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos ocho. Prepare placas con laminina poli-L-ornitina y fibronectina el día 16 y 17 para su uso en el resembrado de las células de la cresta neural.Después del análisis por fax el día 18, tras haber separado las células mediante clasificación de células por fluorescencia, cuente las células de la cresta neural y luego centrifúguelas a 115 G durante cinco minutos. Re suspenda el botón celular en medio de diferenciación N dos suplementado con 10 nanogramos por mililitro.FGF dos 20 nanogramos por mililitro de EGF y 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 dihidrocloruro a una concentración de 30.000 células por 10 microlitros. Seque completamente las placas de cultivo previamente preparadas con poli-L-ornitina, laminina uno y fibronectina. A continuación, siembre aproximadamente de 50 a 70 gotas de la suspensión celular por placa de 10 centímetros.Incubar las células a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos en 20 mililitros de medio de diferenciación N2 suplementado con 10 nanogramos por mililitro de FGF2, 20 nanogramos por mililitro de EGF y 10 micromolar de Y-27632 dihidrocloruro, en cada placa de 10 centímetros, sin perturbar las gotas.A continuación, incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono. Tras la incubación, mantener y pasar las células de cresta neural según el protocolo de texto adjunto; las células de cresta neural se obtuvieron a partir de células madre pluripotentes humanas en 18 días. Utilizando este nuevo protocolo de diferenciación in vitro libre de células alimentadoras.El análisis de fax realizado el día 18 identificó células positivas tanto para HNK-1 como para P75, lo que confirmó la presencia de células de la cresta neural. En ambos protocolos, el de diferenciación libre de células alimentadoras y el dependiente de células alimentadoras, las células de la cresta neural pasaron por una etapa de roseta neural. Además, las células separadas por citometría de flujo presentan morfología idéntica y expresan los marcadores de la cresta neural, HNK-1 y AP2. Una comparación de la expresión génica global de células de la cresta neural derivadas de estos dos protocolos de diferenciación reveló que ambos conjuntos de células se agrupan estrechamente. El análisis de la capacidad de migración de las células de la cresta neural derivadas mediante el protocolo libre de células alimentadoras mostró que las células migraron exitosamente hacia el área rayada tras 48 horas. Estas células también tienen el potencial de diferenciarse en células del sistema nervioso autónomo, tal como se confirmó mediante tinción positiva para mash one y touch one tras cuatro días adicionales de diferenciación. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo neuralizar células madre pluripotentes humanas y derivar células progenitoras de la cresta neural in vitro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para cultivar las células troncales de la cresta neural (NCSC) in vitro, un medio especial (NCSCM) es necesario. Parte esencial de NCSCM es el extracto de embrión de pollo (CEE). Se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE, incluyendo detalles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración.

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso...

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Este trabajo describe un protocolo de diferenciación in vitro para producir, melanocitos maduros pigmentadas a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una cresta neural y melanoblasto etapa intermedia usando un protocolo sin alimentador de 25 días.

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Presentamos un protocolo de diferenciación in vitro tridimensional (3D) que genera neuroesferas de tamaño reproducible para producir células de cresta neural craneal a partir de células madre embrionarias de ratón. Demostramos que esta metodología reduce la variabilidad en comparación con los protocolos anteriores y cómo se puede utilizar para el ensayo multiplexado para estudiar el desarrollo de las células de la cresta neural craneal.

Células de la cresta neural craneal Protocolo de diferenciación tridimensional in vitro para ensayos multiplexados

Aprende a derivar células progenitoras de la cresta neural a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo libre de alimentadores. Este método de 18 días utiliza moléculas pequeñas y clasificación por citometría de flujo para facilitar el estudio de enfermedades relacionadas con la cresta neural.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

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