Name: Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a analizar la dinámica transcripcional en el núcleo accumbens de ratones tras exposición a cocaína mediante qPCR. Este protocolo permite estudiar cambios génicos inducidos por experiencia conductual en neurociencia.

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Este trabajo ha sido financiado por la Beca de la Fundación de Ciencia de Israel (ISF # 393/12), la Beca de Excelencia de los Centros de Investigación de Israel (I-CORE 1796/12), la Beca de la Fundación Germano-Israel (GIF # 2299-2291.1/2011) y la Beca de Integración Profesional Marie Curie (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Los primeros pasos del proyecto fueron financiados por una beca postdoctoral de AXA para AC. Agradecemos los generosos fondos iniciales proporcionados por el Centro Edmond y Lily Safra para las Ciencias del Cerebro.
La lectura crítica por parte de los miembros del laboratorio Citri es muy apreciada.

NOTA: El protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad Hebrea de Jerusalén. 1 Preparación de la solución de ACSF <ol><li> Preparar la solución de ACSF como se describe en la Tabla 1. Hacer 1 L en ddH 2 O (&gt; 18 mW de pureza), con lo que la osmolaridad a ~ 300 mOsm / L con la adición apropiada de agua o NaCl. </li></ol> 2. Equipo y distribución de la habitación Los equipos para el monitoreo de la conducta locomotora inducida por la cocaína consiste en cámaras de comportamiento (50 x 45 cm) de cable con una fuente de luz interior, el ventilador y la cámara (o sensores infrarrojos), y equipado con una caja de plexiglás interior (30 x 30 cm) en que los ratones se les permite moverse libremente mientras su locomoción es monitoreado. La prueba de comportamiento se debe realizar entre 1 hora después de las luces a 1 hora antes de las luces, en un ciclo de luz / oscuridad regular. Los animales deben ser entrenados constantemente a la misma hora cada día. <ol><li&gt; Conecte la cámara o sistema de infrarrojos de un sistema adecuado para el seguimiento y registro de la conducta locomotora de los ratones. </li><li> Limpiar las cámaras después de cada ensayo con desinfectante proporcionada por las instalaciones del ratón y / o eliminación del olor de reactivo, con el fin de prevenir el sesgo de referencia olfativa y para asegurar una desinfección adecuada. </li></ol> IMPORTANTE: Si bien el manejo de los ratones sean tranquilo, tranquilo y cuidado. 3. Preparación de los animales <ol><li> Casa 5 C57BL6 ratones macho (6-12 semanas de edad; ~ 25-35 g de peso) por jaula, en una habitación con una luz de 12 h / oscuridad ciclo y el acceso libre a comida y agua, de acuerdo con las normas y requisitos de animales local Cuidado orientación y protocolos Comité. Antes de iniciar el experimento, sopesar los ratones y registrar los datos. La cocaína se administra después de acuerdo con el peso de los ratones. </li><li> Transferir todas las jaulas que contienen los ratones en el comportamiento piezas 30 min antes de iniciar el primer ensayo. </li><li> Habituar a toda lalos ratones utilizados en el experimento para experimentador manipulación, inyecciones y controlar la configuración de la conducta. Esto se logra mediante 3 inyecciones intraperitoneales diarias consecutivas de 250 l de solución salina como se describe a continuación. </li><li> Administrar una inyección intraperitoneal de 250 l de solución salina. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón en una cámara de comportamiento para supervisar la actividad locomotora durante 15 min. Repita esta acción durante 3 días consecutivos, a la misma hora cada día. </li><li> En el cuarto día, divida a los ratones en dos grupos. Preparar una solución madre de cocaína en 2 mg / ml en solución salina. Administrar una única inyección de solución de cocaína (final de 20 mg / kg) al grupo experimental de acuerdo con el peso del ratón (por ejemplo, para un ratón 25 g - inyectar 250 l, mientras que un ratón 30 g recibirá 300 l). Administrar solución salina al grupo de control. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón durante 20 min en una cámara de comportamiento para el seguimiento de la actividad locomotora (typicaliado, los primeros 15 min se supervisan). </li><li> Después de la inyección de cocaína, sacrificar los ratones en diferentes puntos de tiempo (0, 1, 2, 4, 8 y 24 h después de la inyección). Es importante destacar que, asegúrese de que los ratones de referencia (0 punto de tiempo) no recibirán ningún tipo de inyección en el día de hoy. Debido a su importancia, es imperativo incluir repeticiones del grupo de referencia. </li></ol> 4. Disección del núcleo accumbens <ol><li> Anestesiar a los ratones con isoflurano en el momento apropiado después de la inyección de cocaína / solución salina. El isoflurano se debe ventilar directamente fuera de la habitación. Por lo tanto, el procedimiento se debe realizar en una campana para vapores químicos. </li><li> Monitorear la profundidad de la anestesia probando el reflejo del pie trasero. Pellizcar la pata para provocar una respuesta de retirada por el animal. Un animal que muestra un reflejo no está a un nivel quirúrgico de anestesia y no en un estado de eutanasia. </li><li> Extracción del cerebro: <ol><li> La eutanasia el ratón por decapitación. </li> &lt;li&gt; Retire la piel por encima del centro del cráneo y cortó el cráneo con unas tijeras afiladas. </li><li> Insertar las tijeras en el punto donde la médula espinal entra en el cerebro (foramen magnum) y hacer dos cortes laterales. </li><li> Desde el mismo punto, hacer un corte sagital de largo a lo largo de la sutura sagital. Al alcanzar el bulbo olfatorio, clip hacia la izquierda y hacia la derecha. </li><li> Con unas pinzas, quite cuidadosamente el cráneo, agarrando cada mitad del cráneo con firmeza y tirando hacia un lado, teniendo cuidado de no presionar sobre o dañar el cerebro. </li><li> Retire el cerebro, mientras que la ruptura de los nervios craneales utilizando un micro espátula cuchara invertida. </li></ol></li><li> Coloque el cerebro en una solución ACSF helada durante 1-2 minutos para enfriar y endurecer. </li><li> Eliminar cerebro desde el ACSF, Wick exceso de líquido con una toalla de papel, crear un corte coronal entre el cerebelo y el resto del cerebro y pegar el cerebro, con la parte rostral hacia arriba, en el escenario vibratome. </li><li> Cortar el NAc: <ol&gt; <li> Mantener soluciones ACSF a temperaturas heladas en la cámara de corte del vibratome. Sección a 200 micras hasta que el núcleo accumbens (NAC) se identifica claramente de acuerdo con la Paxinos y Franklin cerebro de ratón Atlas (aproximadamente 1,8 mm anterior al bregma; prestar atención a la forma del cuerpo calloso, la ubicación y la forma de la comisura anterior y los ventrículos, así como la morfología general de la sección de cerebro). En este punto, crear dos secciones 400 micras, de las cuales se diseccionó el NAc. </li><li> Bajo un estereoscopio, utilice una fina lámina de diseccionar la zona NAc fuera de las rodajas. La definición de la NAC es de acuerdo con el atlas del cerebro del ratón Paxinos y Franklin, y convenientemente puede ser diseccionado en las secciones apropiadas por cuatro pases rápidos de la cuchilla en el tejido. (Figura 2). </li><li> Coloque las secciones NAC inmediatamente en 900 l Trizol reactivo de lisis en un tubo de microcentrífuga y almacenar a -80 ° C hasta el ARN extracción. </li></ol></li></ol> Transcripción 5. Extracción de ARN y ADNc inversa <ol><li> Descongelar los tubos que contienen núcleo accumbens secciones en Trizol reactivo de lisis a temperatura ambiente y homogeneizar el lisado con una jeringa de 1 ml conectada a la aguja 25 G hasta que el tejido es totalmente homogeneizada (por lo menos 15-20 veces). Las primeras rondas son difíciles, y requieren empujar el tejido contra la pared del tubo con el fin de romper en pedazos pequeños que podrían entrar en la punta de la aguja. </li><li> Para asegurar la homogeneización, pipetear el lisado en una columna de centrifugación QIAshredder Mini y centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. </li><li> Pipetear el lisado en un nuevo tubo de microcentrífuga y extraer el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Guarde el ARN a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Medir la concentración de ARN, analizar la integridad y la calidad mediante un Bioanalyzer o equipo equivalente. Utilice 100-500 ng de ARN para cada ronda de preparación de ADNc con rcebadores hexámeros Andom. </li></ol> 6. Diseño Primer y Pruebas Primer <ol><li> Elegir buenos cebadores: Para un par de cebadores óptimo para qPCR de transcripciones de ARNm, siga estos requerimientos (Figura 3): <ol><li> Cebadores de diseño ya no contienen de 17-28 bases. Evitar repeticiones de nucleótidos ya que promueven mispriming. </li><li> Cebadores de diseño con la temperatura de fusión (T m) entre 56-68 ° C (óptima 60-64 ° C). El T m dentro de la pareja de cebadores debe estar dentro de 1 ° C de la otra. </li><li> Tenga en cuenta que el tamaño del producto debe ser idealmente entre 80 y 150 pb. </li><li> Asegúrese de que al menos uno de los cebadores cubre una unión exón-exón, o el amplicón contiene un gran intrón (intrón-que abarca), para evitar la amplificación de contaminantes de ADN genómico. </li><li> Utilice un software fiable basado en Primer3 (para ejemplos véase el cuadro 2) con el fin de mejorar el diseño del cebador. </li></ol></li><li> Prueba de la prIMers: A fin de garantizar la especificidad y la eficiencia de los cebadores, una reacción de qPCR de control deben realizarse: <ol><li> Utilice una muestra positiva (que contiene cDNA plantilla para todos los pares de cebadores correspondientes) y valorar el ADNc (por ejemplo, ocho diluciones de tres veces a partir de una concentración inicial de ~ 10 ng) en reacciones paralelas duplicados. Incluir un control sin plantilla, que controla la contaminación dentro de las soluciones utilizadas para la reacción. </li><li> Calcular la eficiencia de imprimación mediante el uso de la fórmula: (10 (- 1 / pendiente) -1) × 100, de tal manera que la curva de la pendiente óptima es - 3.333 (es decir, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4). </li><li> Determinar la especificidad de la amplificación. Amplificación específica se demuestra por un único pico prominente común a todas las curvas de fusión de los productos amplificados, mientras que fuera del objetivo de amplificación aparecería como una desviación obvia from el pico individual grande. </li></ol></li></ol> 7. análisis qPCR <ol><li> Pre-amplificación: <ol><li> Análisis completo qPCR se basa en paralelo de consulta de limitar cantidades de ARN con un gran número de pares de cebadores. Por lo tanto, una etapa de pre-amplificación es esencial. En este paso, el ADNc se somete a 14-18 ciclos de pre-amplificación con una mezcla de todos los cebadores que se utilizarán para la consulta de la muestra en el futuro (hasta 800 pares de cebadores). </li><li> Diluir todos los cebadores en TE (bajo EDTA) a 50 m para Target Amplificación Específica (STA). </li><li> Piscina junto 1 ml de alícuotas de todo el primario 50 M establece para ser incluidos en la reacción de STA, de hasta 800 ensayos. </li><li> Preparar pre-mezcla y muestras para STA como se describe en la Tabla 3. Permitir para el error mediante la preparación de la mezcla para el 110% del número de muestras que deben ser amplificado. </li><li> Alícuota de 3,75 l STA pre-mezcla para cada muestra. Añadir 1,25 lde cDNA a cada uno. </li><li> Vortex para mezclar las reacciones y centrifugar durante 10 seg. </li><li> Colocar las reacciones STA en un ciclador térmico y el ciclo como se indica en la Tabla 4. </li></ol></li><li> Exonucleasa I (ExoI) de tratamiento: <ol><li> Diluir la Exo I como se indica en la Tabla 5. </li><li> Añadir 2 l de ExoI diluido (4 U / l) a cada reacción STA 5 l, vórtice, girar hacia abajo (&gt; 6.000 xg), y meterlo en un termociclador a 37 ° C durante 30 min y luego a 80 ° C durante 15 min. </li><li> Diluir los productos finales a una concentración apropiada para la prueba. Uso TE Buffer (añadir 43 l de tampón TE a la muestra TSA 7 l). </li><li> Almacene los productos STA diluidas a -20 ° C o utilizar de inmediato. </li></ol></li><li> Primer y configuración de ejemplo para qPCR: <ol><li> Preparar muestras como se muestra en la Tabla 6. Preparar la mezcla de acuerdo con el chip elegido para el experimento, y añadir muestras según sea apropiado. </li><li> Agilitar las soluciones Mezclar la muestra durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (&gt; 6.000 xg) durante al menos 30 seg. Reacciones preparados pueden almacenarse durante duraciones cortas a 4 ° C hasta que el chip está listo para la carga. </li><li> Preparar los ensayos tal como se describe en la Tabla 7. </li><li> Agite la mezcla de ensayo durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (&gt; 6.000 xg) durante al menos 30 segundos de girar todos los componentes. IMPORTANTE: Vortex y centrifugar a fondo todas las soluciones de muestras y ensayos antes de pipetear en las entradas de chips. El no hacerlo puede dar lugar a una disminución de la calidad de los datos. NOTA: La concentración final de cada cebador es 5 M en la entrada y 500 nM en la reacción final. </li></ol></li><li> Cebado y carga de la matriz dinámica IFC (circuito de fluido integrado) chip. El chip IFC tiene entradas para muestras y ensayos, así como entradas especificadas (acumuladores) para fluido de la línea de control (aceite mineral) que se utiliza para presurizar las cámaras de microfluidos (Figure 4A). <ol><li> Inyectar fluido línea de control en cada acumulador en el chip. </li><li> Retire y deseche la película protectora azul de la parte inferior de la ficha. </li><li> Coloque el chip en el controlador apropiado IFC (controlador MX para el 48,48 IFC matriz dinámica o la HX controlador de la CFI para la 96.96 matriz dinámica IFC), a continuación, ejecute la secuencia de comandos Prime (113x) para el 48,48 IFC matriz dinámica o el Prime (136x) guión de la 96.96 matriz dinámica IFC con el fin de preparar el chip. </li><li> Cuando el script haya finalizado, retire el chip imprimada desde el controlador de la CFI. </li><li> Pipetear 5 l de cada mezcla de ensayo y 5 l de cada Sample Mix en sus entradas. </li><li> Devuelva el chip para el controlador de la CFI. </li><li> Utilizando el software de controlador de la CFI, ejecutar la carga Mix (113x) guión para el 48,48 matriz dinámica IFC) o Cargar Mix (136x) guión para el 96.96 matriz dinámica IFC para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando el guión Mix carga ha terminado, quite la cargachip de ed desde el controlador de la CFI. </li><li> Cargue el chip en el termociclador, crear una nueva ejecución de chip (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), incluyendo análisis de la curva de fusión. Usando el software termociclador, asegúrese de que las cámaras de reacción se reconocen correctamente, y permiten que la reacción se ejecute por completo. </li></ol></li></ol> Análisis de datos 8. <ol><li> Aseguramiento de la calidad: Con el fin de garantizar la calidad de los datos, verificar la calidad de los cebadores al abordar curvas de dilución (como se describió anteriormente). Monitor de la especificidad de la amplificación mediante la visualización de las curvas de fusión de los amplificados, los picos de los cuales deben estar bien alineados de forma óptima 29. </li><li> Visualización: Para la visualización de grandes cantidades de datos obtenidos por el alto rendimiento de qPCR, el uso de software generó mapas de calor, en el que la expresión es un código de color por intensidad. Además, mostrar la dinámica de la transcripción de los genes individuales como diagramas de dispersión alineados. </li><li> Publicación: En la publicaciónlos resultados de la expresión génica, se aconseja seguir las Directrices para la publicación de MIQE cuantitativos en tiempo real información experimentos de PCR, que detalla la información mínima que debe ser informada para un experimento de qPCR para asegurar su pertinencia, precisión, interpretación correcta, y la reproducibilidad. </li></ol>

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<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Caracterización acertada de la expresión génica a partir de tejido cerebral después de paradigmas de comportamiento depende de: 1) El manejo cuidadoso de los ratones durante el paradigma de comportamiento; 2) la disección rápida y precisa de tejido de interés; 3) medidas de ARN de seguridad para garantizar la integridad de ARN; y 4) La planificación cuidadosa de los cebadores y el diseño experimental, así como la precisión y la atención al detalle en la preparación para el análisis qPCR. El ...

Organización dinámica del cerebro permite la flexibilidad cognitiva y conductual. Experiencias se codifican a través de modificaciones de la estructura y la fuerza de las conexiones entre las neuronas en el cerebro 3. Esta &quot;plasticidad dependiente de la experiencia&quot; es el resultado de la inducción de patrones específicos de expresión genética que proporciona las proteínas necesarias para la modificación de la estructura y la fuerza sináptica 4. La identificación de las redes reguladoras de genes mediar en la formación de recuerdos a largo plazo es un principio central de la neurociencia molecular, con la expectativa de que la identificación de los elementos dominantes de programas transcripcionales proporcionará información sobre los principios fundamentales que regulan la formación de la memoria, así como los objetivos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. Programas transcripcionales se desarrollan en ondas definidas temporalmente-, cada uno de los cuales codifica genes de distinto carácter, que son importantes para el detapas ifferent en la aplicación de los resultados del evento de señalización 1,2. Por tanto, es importante para hacer frente a la dinámica de la transcripción en una escala de tiempo temporal detallada, a fin de identificar el complemento completo de genes inducidos, y obtener una perspectiva de su función potencial de acuerdo con la dinámica de su inducción. La drogadicción es una forma sólida de experiencia plasticidad dependiente causada por los efectos a largo plazo de las drogas de abuso en los circuitos neuronales en el cerebro 5,6. , La exposición aguda inicial a las drogas puede conducir al desarrollo de la adicción y la transición hacia el uso crónico. La información contextual es un elemento crucial en el desarrollo de la adicción. Señales ambientales fármacos relacionados se asignan gran importancia en la mente de los consumidores de drogas. La información contextual recordando a un adicto a las drogas de la experiencia drogas en el pasado puede inducir la recaída en el deseo de droga, incluso después de largos periodos de abstinencia de la exposición al fármaco 7,8.De ahí el gran reto clínico en la adicción - la propensión de los adictos a la recaída, incluso mucho tiempo después de los síntomas de abstinencia han disminuido 9. Comportamiento de sensibilización a la cocaína es un modelo simple de la experiencia de cocaína útiles en el estudio de los mecanismos de adicción a las drogas. En este modelo ampliamente estudiado para la sensibilización de larga duración inducida por la exposición crónica a drogas de abuso, los roedores son primero habituaron a inyecciones de solución salina (intraperitoneal, IP) en un nuevo entorno (una cámara de campo abierto en el que se controla su actividad locomotora) ; entonces, que reciben inyecciones diarias de cocaína en las cámaras de campo abierto, mientras que su actividad es monitoreada 10 (Figura 1). Este paradigma de comportamiento típicamente resulta en una sensibilización robusta de comportamiento locomotor (8-12 veces por encima de la actividad de línea de base) 11, que se mantiene durante un período de meses tras el cese de las inyecciones de cocaína, lo que demuestra la formación de un pervhuella de la memoria ASIVE de experiencia de la droga. Los circuitos neuronales de la recompensa, que participan de forma natural en reforzar las conductas esenciales para el éxito de una especie (por ejemplo, la alimentación, el sexo), es explotado por las drogas de abuso para reforzar los comportamientos asociados con la droga 12,13. Los mecanismos moleculares y celulares por el cual la experiencia de las drogas de abuso se mejora parecen ser similares a los mecanismos que subyacen a la formación de la memoria declarativa o semánticas en otras estructuras cerebrales 14. Por lo tanto, la robustez del modelo de sensibilización de comportamiento hace que sea un sistema de modelo atractivo para estudiar los mecanismos de la plasticidad dependiente de la experiencia. El núcleo accumbens (NAC) es un integrador central del circuito de recompensa del cerebro, y ha sido ampliamente asociado con el desarrollo de la adicción a 5,6. La formación de la adicción depende de la transcripción de nuevas proteínas en el núcleo accumbens, y robusto enproducción de programas de transcripción claramente estructurados se observa en el NAc siguiente experiencia cocaína 15-19. La respuesta transcripcional aguda de exposición a la cocaína es probable que funcione a múltiples niveles con el fin de adaptarse al fuerte estímulo de inducción y para dirigir la producción de nuevas proteínas que son responsables de los cambios estructurales y electrofisiológicos inducidos por la exposición a la droga 6,19-22. Con el fin de promover el estudio de los mecanismos moleculares de la plasticidad dependiente de la experiencia en el cerebro, un protocolo se describe para el análisis completo de la dinámica de transcripción en las muestras de tejido cerebral después de la manipulación del comportamiento. El protocolo se ilustra en el contexto de la experiencia de comportamiento estudiados en el laboratorio Citri - la sensibilización de comportamiento a la cocaína, la utilización de matrices dinámicas de microfluidos para el análisis transcripcional. El protocolo descrito obviamente no se limita a estudiar tque el núcleo accumbens en el contexto de la sensibilización de comportamiento, pero podría aplicarse a un gran número de paradigmas de comportamiento y regiones del cerebro. De hecho, este protocolo se podría aplicar a los tejidos del cuerpo fuera del cerebro, y una variedad de experiencias o manipulaciones del organismo estudiado. El protocolo se divide a grandes rasgos en cuatro pasos. En el primer paso, el animal se somete al paradigma de comportamiento; en la segunda etapa el tejido es microdissected; en la tercera etapa - ARNm se purifica, inverso-transcrito y sondeó, y en la etapa final se analizan los datos. En el contexto del estudio de la dinámica de la transcripción, el momento preciso y la definición de la experiencia son probablemente los parámetros experimentales más importantes a controlar. Por esta razón, nuestro modelo de comportamiento de elección es el de la sensibilización de comportamiento a la cocaína, un sistema que permite alto nivel de control del experimentador sobre los parámetros de la experience. Paradigmas de comportamiento adicionales que permiten la sincronización exacta y abordan diferentes modelos de experiencia-dependiente de la plasticidad o formación de la memoria están disponibles. Estos modelos incluyen el condicionamiento del miedo 23, enriquecimiento ambiental aguda 24,25, novela objeto de exploración 26 y la experiencia visual después de la cría de oscuridad 27. Aún así, la sensibilización conductual a la cocaína es una manipulación del comportamiento sólido y coherente, creando un rastro de memoria altamente generalizado que dura meses siguientes experiencia cocaína 28. El cerebro se secciona, seguido por microdisección manual de los núcleo accumbens. Ha sido nuestra experiencia que microdisección manual desde cortes de cerebro preparadas rápidamente proporciona el método más fiable y rápida de extraer el tejido correspondiente al paradigma de comportamiento, y con la experiencia, los límites del tejido hecho evidente y fácilmente reconocido. Alternativamente, rebanadas finas podrían ser prepared, seguido por láser de microdisección de captura. Aunque este método permite altamente definida la delimitación de la zona de interés, es lento (arriesgando así la pérdida de mRNA lábil), tedioso y requiere equipo especializado costoso (un microscopio equipado con una configuración de láser captura). El protocolo definido en este documento también podría ser adaptado para el análisis transcripcional de una sola célula, por aspiración manual de citoplasma de las células identificadas visualmente utilizando pipetas de parche 29. Es importante señalar que el protocolo descrito proporciona un promedio de la población, mientras que es muy probable que en la mayoría de los casos, sólo una subpoblación de las células dentro del tejido son en realidad implicado en la respuesta a la experiencia. Es de interés para el perfil de transcripción de una manera selectiva desde dentro de las poblaciones de células específicas que responden a la experiencia, pero la discusión de estos enfoques está más allá del ámbito actual. Para la purificación de ARNm, transcripción inversa y qPCR consulta, el tejidose interrumpe al pasarla a través de agujas finas, seguido de la utilización de los kits disponibles en el mercado (para más información, véase el Cuadro 8). La elección es informado por la experiencia con estas metodologías, que aseguran la extracción fiable de ARN de alta calidad y resultados sólidos de las aplicaciones posteriores. Mientras que el protocolo se describe para alto rendimiento qPCR utilizando matrices dinámicas, las muestras pueden probaron para la expresión génica usando PCR de punto final, de bajo rendimiento qPCR, microarrays de expresión de genes o la secuenciación de profundidad. La preferencia por qPCR de alto rendimiento utilizando matrices dinámicas es debido al hecho de que el ARNm obtenido a partir de núcleos cerebrales después de paradigmas de comportamiento es a menudo de cantidades limitantes. Las matrices dinámicas proporcionan una plataforma que permite el análisis global eficiente de las transcripciones de un gran número de muestras paralelas en un solo experimento. Después de la adquisición inicial del sistema de microfluidos (comúnmente un pu institucionalrchase), los experimentos son relativamente baratos para funcionar. A raíz de este análisis, además de consulta de las muestras se puede realizar utilizando las plataformas más costosas para buscar nuevas transcripciones (por microarrays o RNAseq) con las matrices dinámicas que proporciona una referencia completa para el aseguramiento de la calidad. Finalmente, para el análisis de datos, se utilizan enfoques estándar. Punteros específicos relativos a cuestiones que puedan surgir serán discutidos en el texto del protocolo. Este protocolo es el más apropiado para los investigadores interesados ​​en una investigación a fondo de su sistema de interés, el estudio de múltiples condiciones y repeticiones. El protocolo también es la más adecuada para los investigadores que ya han perfeccionado en (a través de microarrays o RNAseq experimentos) en un subgrupo de 50 a 500 genes de interés, que están interesados ​​en la consulta de forma repetida.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP 100%</td><td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Mini Kit Universal</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Cámara de comportamiento Invitrogen</td><td>1355656</td><td></td></tr><tr><td>(MDF; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caja de metacrilato interior automontada (30 x 30 cm)</td><td></td><td></td>Cámara <td></td></tr><tr><td>y grabadora de vídeo</td> automontada <td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Software de grabación de medios</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>Bioanalizador 7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>El Bioanalizador</td><td></td>Agilent 2100</tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de microcuchara invertida</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic array Chip para la expresión génica 96.96</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis integral de transcripción dinámica del cerebro muestras siguiendo experiencia del comportamiento

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

La codificación de las experiencias en el cerebro y la consolidación de la memoria a largo plazo dependen de la transcripción de genes. La identificación de la función de genes específicos en la experiencia de codificación es uno de los principales objetivos de la neurociencia molecular. Por otra parte, la asociación funcional de genes definidos con conductas específicas tiene implicaciones para la comprensión de la base de los trastornos neuropsiquiátricos. Inducción de programas de transcripción robustos se ha observado en los cerebros de los ratones después de varias manipulaciones de comportamiento. Mientras que algunos elementos genéticos se utilizan recurrentemente siguiendo diferentes manipulaciones de comportamiento y en diferentes núcleos cerebrales, los programas transcripcionales son en general única a los estímulos que inducen la estructura y en el que se estudiaron 1,2. En esta publicación, se describe un protocolo para sólida y completa el perfil transcripcional de los núcleos cerebrales de ratones en respuesta a la manipulación del comportamiento. Elprotocolo se demuestra en el contexto del análisis de la dinámica de la expresión de genes en el núcleo accumbens siguiente experiencia aguda de cocaína. Con posterioridad a un definido en la experiencia vivo, el tejido neural objetivo se diseca; seguido por la purificación del ARN, transcripción inversa y la utilización de matrices de microfluidos para el análisis de qPCR integral de múltiples genes diana. Este protocolo está orientado a análisis exhaustivo (direccionamiento 50-500 genes) de limitar las cantidades de material de partida, tales como muestras de cerebro pequeñas o incluso células individuales. El protocolo es más ventajosa para el análisis paralelo de múltiples muestras (por ejemplo, células individuales, análisis dinámico siguiente farmacéutica, viral o perturbaciones de comportamiento). Sin embargo, el protocolo también podría servir para la caracterización y control de calidad de las muestras antes de los estudios de todo el genoma de microarrays o RNAseq, así como la validación de los datos obtenidos a partir de estudios de todo el genoma.

La calidad de los resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo depende de manera crucial de una serie de parámetros. Planificación experimental adecuado resultará en una mínima perturbación a los ratones experimentales, de tal manera que la experiencia probada (en este ejemplo, el de la exposición a la cocaína) será la experiencia más dominante en su historia reciente, y por lo tanto resultará en una transcripción robusta y específica programa. Figura 1 describe el plan experimental par...

Este manuscrito describe un protocolo que aplica un perfil exhaustivo para el análisis de programas transcripcionales inducidos en núcleos cerebrales específicos de roedores siguiendo paradigmas conductuales. En este trabajo, este enfoque se ilustra en el contexto del perfil de genes inducidos en el núcleo accumbens (NAc) de ratones después de una exposición aguda a la cocaína, utilizando matrices de qPCR microfluídicas.

Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la dinámica transcripcional y los núcleos cerebrales definidos en ratones tras una experiencia conductual. Esto se logra primero habituando a los animales y registrando su actividad locomotora tras la inyección de suero salino. Una vez habituados, se registra la actividad locomotora tras una dosis única de cocaína, se recolectan muestras del núcleo accumbens y luego se utilizan para el aislamiento de ARN y la preparación de ADNc.A continuación, se realiza un análisis de QPCR para estudiar la expresión génica inducida por el comportamiento. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la dinámica transcripcional tras la experiencia con cocaína. El protocolo será demostrado por el Dr. Hatu, el director del laboratorio, Dum Muer, un estudiante de posgrado del laboratorio, y Duran, un estudiante universitario del laboratorio. Durante tres días consecutivos, cada ratón se habitúa a los procedimientos de manipulación e inyección, organizándose los ratones en jaulas antes de iniciar el experimento, de modo que los ratones no sean transferidos entre jaulas en el futuro y nunca se dejen en aislamiento durante un período prolongado de tiempo.30 minutos antes del inicio de la prueba, todas las jaulas de ensayo deben trasladarse al cuarto de comportamiento para permitir que los animales se aclimaten al entorno. Administre una inyección intraperitoneal de 250 microlitros de solución salina; inmediatamente después de la inyección, coloque el ratón en una cámara de comportamiento para monitorear la actividad locomotora durante 15 minutos. El ratón podría permanecer en la cámara de comportamiento durante 20 minutos.Una actividad monitoreada desde los minutos dos hasta el 17. Repita estos pasos a la misma hora del día durante los dos días siguientes. En el cuarto día, administre una inyección única de cocaína o solución salina, según el grupo, y coloque inmediatamente al ratón en la cámara para monitorear la actividad motora local durante 20 minutos en puntos de tiempo seleccionados tras la exposición a la cocaína, extraiga el cerebro y colóquelo en una solución de LCR fría con hielo durante uno o dos minutos para enfriarlo y endurecerlo.Tras retirar el cerebelo y absorber el exceso de líquido, pegue el cerebro sobre la platina de un vibroslice con la parte rostral orientada hacia arriba. Llene la cámara con A CSF frío con hielo y corte secciones de 200 micrones hasta identificar claramente el núcleo accumbens. Preste especial atención a la forma del cuerpo calloso, la ubicación y forma de la comisura anterior y los ventrículos durante el corte.Una vez identificada la región correcta, corte dos secciones de 400 micrones de las cuales se disecará el núcleo accumbens bajo un estereoscopio. Utilice una hoja fina para separar el núcleo accumbens de las secciones. Cuatro pasadas rápidas de la hoja en la zona adecuada deben aislar inmediatamente el tejido apropiado.Coloque el tejido aislado en 900 microlitros de reactivo de lisis y almacénelo a menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ARN; comience por descongelar los tubos a 37 grados Celsius y homogenizar. Utilizando una aguja de 25 gauge, las primeras rondas pueden ser difíciles y requerir presionar el tejido contra la pared del tubo para homogenizarlo en fragmentos pequeños. Para asegurar una homogenización adecuada, aspire el lisado y colóquelo en una columna de giro mini kaya shredder y centrifugue.Transfiera el lisado a un nuevo tubo microcentrífugo y extraiga el ARN según las instrucciones del fabricante. Tras la purificación del ARN, se realiza la transcripción inversa a ADNc, así como la preamplificación específica del blanco de las muestras con cebadores dirigidos contra el grupo de genes seleccionados para el análisis. Estos procedimientos se describen en la versión textual del protocolo.Existen chips microfluídicos comerciales disponibles para análisis QPCR completo en formato 48 por 48, lo que permite analizar 48 muestras con 48 conjuntos de sondas, o en formato 96 por 96, en el cual se analizan 96 muestras con 96 sondas. En la mayoría de los casos, la elección del chip depende principalmente del número de muestras analizadas.Primero, prepare la mezcla de muestra según el chip elegido para el experimento. Tenga cuidado al pipetear el reactivo de carga de la muestra con colorante de unión a ADN 20 X. Agite las soluciones de la mezcla de muestra durante un mínimo de 20 segundos y centrifugue durante al menos 30 segundos.Las reacciones preparadas pueden almacenarse durante cortos períodos a cuatro grados Celsius hasta que el chip esté listo para la carga. A continuación, prepare la mezcla de ensayo, agite completamente la mezcla de muestra y centrifugue para precipitar todos los componentes. Como se mostró anteriormente, el chip IFC de matriz dinámica tiene entradas para muestras y ensayos, así como entradas especificadas para el fluido de la línea de control utilizado para presurizar las cámaras microfluídicas.Primero, inyecte el fluido de la línea de control en cada acumulador del chip. A continuación, prepare el chip colocándolo en el controlador IFC y ejecutando el script adecuado. Cuando el script haya finalizado, retire el chip preparado del controlador IFC y pipetee cinco microlitros de cada ensayo.Mezcle sobre el chip. Añada cinco microlitros de cada mezcla de muestra a sus entradas y devuelva el chip al controlador de IFC utilizando el software del controlador de IFC. Ejecute el script para cargar las muestras y los ensayos en el chip.Una vez que el script de mezcla de carga haya finalizado, retire el chip cargado del controlador IFC. A continuación, coloque el chip en el termociclador y cree una nueva corrida de chip que incluya un análisis de curva de desnaturalización. Mediante el software del termociclador, asegúrese de que las cámaras de reacción sean reconocidas correctamente y permita que la reacción se complete por completo.Un aumento en la actividad locomotora fue evidente tras una sola inyección aguda de cocaína. En esta sección coronal, líneas blancas gruesas marcaron la ubicación de los cortes realizados para definir los límites del núcleo accumbens. Durante la disección, las curvas de amplificación de los cebadores dirigidos contra CFOs y fosf B demuestran que los pares de cebadores amplifican su transcripción diana con una eficiencia aproximada del 100%.En cada ciclo, los resultados muestran que la expresión inducida por la cocaína de CFO y de B fosforilada en el núcleo accumbens fue máxima una y dos horas después de la exposición. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de nueva generación, con el fin de identificar transcritos novedosos no caracterizados.

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Investigación

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Behavior

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