Evaluación no invasiva de la cardiaca Anomalías en la miocarditis autoinmune experimental por Resonancia Magnética de imágenes de microscopía en el ratón

El objetivo general de este procedimiento es determinar las anomalías funcionales cardíacas mediante el análisis por imágenes de corazones en animales vivos afectados por una enfermedad cardíaca inflamatoria. Esto se logra primero induciendo la enfermedad, por ejemplo, miocarditis. El segundo paso consiste en preparar al animal para la imagen por microscopía de resonancia magnética y colocarlo en el soporte para animales.

A continuación, se coloca al ratón dentro del imán para obtener las imágenes cardíacas. El paso final consiste en analizar los parámetros funcionales cardíacos utilizando el software Segment. En última instancia, esta técnica se utiliza para calcular el volumen diastólico final y la fracción de eyección en ratones afectados por miocarditis autoinmune.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la histopatología es que es no invasiva y proporciona una vista tridimensional de alta resolución del corazón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cardiología relacionadas con el diagnóstico de enfermedades cardíacas inflamatorias. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la falta de familiaridad con la preparación de animales para la adquisición de imágenes por microresonancia magnética.

Por lo tanto, la demostración visual de este método es fundamental. Comience este protocolo preparando primero una solución peptídica para inducir miocarditis autoinmune: disuelva el péptido de cadena pesada de miosina cardíaca alfa 334-352 en solución salina tamponada con fosfato hasta una concentración final de dos miligramos por 1,5 mililitros. A continuación, prepare la toxina de la tos ferina añadiendo un mililitro de solución salina tamponada con fosfato estéril 1x a un vial que contiene 50 microgramos de toxina de la tos ferina liofilizada.

Para obtener una concentración stock de 50 nanogramos por microlitro. Luego, tome 20 microlitros del stock en un tubo estéril de 1,5 mililitros y agregue 980 microlitros de solución salina tamponada con fosfato estéril al 1x para obtener una concentración de trabajo de 1 nanogramo por microlitro. Prepare también el adyuvante completo de Freund o CFA añadiendo 40 miligramos de extracto de Mycobacterium tuberculosis H37RV o MTB a 10 mililitros de CFA para obtener una concentración final de 5 miligramos por mililitro.

Ahora prepare la emulsión de CFA con péptido para obtener una alícuota de 1,5 mililitros de emulsión: coloque 750 microlitros de la solución del péptido de la cadena pesada alfa de miosina cardíaca, péptido 3 34 a 3 52, en un tubo de 1,5 mililitros y alícuote un volumen igual de CFA suplementado con extracto de MTB en otro tubo de 1,5 mililitros. Luego, utilizando una jeringa de tres mililitros con cierre de encaje, aspire primero la solución de péptido, seguida del extracto de C-F-A-M-T-B. Fije la jeringa a una llave de paso de tres vías y conecte la otra salida de la llave a una jeringa vacía de tres mililitros.

Ajuste la abertura del embudo del grifo de cierre. De modo que la mezcla de CFA con el péptido fluya de una jeringa a la otra con una resistencia razonablemente buena. Mezcle empujando el contenido de una jeringa a la otra repetidamente durante aproximadamente un minuto, y luego coloque todo el conjunto sobre hielo durante unos tres minutos.

Repita este procedimiento un mínimo de 10 veces. Determine la consistencia de la emulsión colocando cuidadosamente una pequeña gota sobre agua quieta en un vaso de vidrio de 100 mililitros. La gota no debería dispersarse en el agua; si lo hace, continúe mezclando hasta alcanzar la consistencia deseada.

Transfiera el contenido de la emulsión desde jeringas de tres mililitros a una jeringa de un mililitro. Conecte la jeringa de un mililitro sustituyendo una de las dos jeringas de tres mililitros unidas al grifo de paso. Luego, coloque una aguja de calibre 27 y medio.

Injecte 150 microlitros de la emulsión de CFA con péptido en dosis divididas por vía subcutánea en las dos regiones inguinales de ratones hembras de seis a ocho semanas de edad. A continuación, administre 100 microlitros de suspensión de toxina de la pertusis por vía intraperitoneal a cada animal el día cero y el día dos después de la inmunización. Repita el procedimiento de inmunización el día siete administrando 150 microlitros de emulsión de CFA con péptido en dosis divididas por vía subcutánea en ambos lados del esternón.

Prepare esta emulsión fresca como se describe. Luego, el día 21, someta a los animales a imágenes por MRM para prepararlos para el estudio por imágenes. Primero, coloque cada ratón en una cámara de inducción anestésica que contenga una mezcla de aire con 2 % de ISO y una almohadilla calefactora para mantener el calor.

Luego transfiera el animal a un soporte para animales especialmente diseñado. Sujete la cabeza con una barra de mordida para inmovilizar al animal en posición prona. La trompa debe encajar en el cono nasal para mantener la anestesia.

Encienda el calentador de aire con su manguera de salida insertada en la tabla vertical del escáner para mantener la temperatura corporal del animal durante el experimento. Mantenga la anestesia al uno a 2% de isoflurano con un flujo de dos mililitros por minuto durante toda la sesión de imagen. Confirme la anestesia realizando una compresión del dedo del pie.

A continuación, configure un sensor neumático tipo almohada y una sonda de temperatura rectal para monitorear la respiración y la temperatura corporal durante toda la sesión de imagenología. También debe colocarse un sensor de oximetría de pulso de fibra óptica en el tobillo izquierdo, y el pie debe fijarse con un lazo de hilo y cinta adhesiva para mantener su posición. La obtención de imágenes se logrará mediante la sincronización con las señales respiratorias y cardíacas, sin utilizar agentes de contraste.

Se debe utilizar un imán vertical de 9,4 Tesla con orificio de gran diámetro para obtener imágenes tridimensionales de microscopía por resonancia magnética de alta resolución. Después de preparar el animal, coloque el ratón en el escáner con el corazón posicionado en el centro del campo de visión. A continuación, ejecute la interfaz de imagen y seleccione el tipo de estudio nuevo en la barra de comandos, abra la página de ajuste y luego seleccione iniciar sonda, ajuste y escala automática.

Utilice los controles de ajuste remoto situados al final de la bobina para sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia del protón de 400 megahercios. A continuación, vaya a la página de preescaneo. Para ejecutar la calibración de frecuencia y potencia, presione el botón rápido X, Y, Z para acceder a la página de ajuste de campos magnéticos.

Luego, seleccione todas las iteraciones y realice el ajuste automático del campo magnético. Seleccione una secuencia exploratoria. Cambie el campo de visión a 35 milímetros.

Mantenga los demás ajustes predeterminados y ejecute la secuencia. Si el corazón no está en el centro del campo de visión, ajuste la posición del soporte del animal, reajuste la bobina de RF y vuelva a adquirir la imagen preliminar. Luego, seleccione la secuencia gem.

Introduzca los parámetros de adquisición que se muestran aquí en la pestaña de adquisición para obtener dos planos ortogonales a lo largo de los ejes corto y largo del corazón. A continuación, seleccione la secuencia de cine para recopilar las imágenes de cine del eje corto con medición de oximetría de pulso y medir el ventrículo izquierdo, así como los parámetros anatómicos y funcionales. Introduzca los parámetros que se muestran aquí para obtener la secuencia de cine de eco de gradiente.

Ajuste la posición y el ángulo de los cortes de imagen según la vista del eje largo del corazón. Luego, ejecute la secuencia. Una vez que la adquisición de imágenes esté completa.

Convierta las imágenes adquiridas al formato DICOM utilizando la pestaña IO y transfiera los archivos correspondientes al centro de datos para su procesamiento. Al final del procedimiento de imagenología, permita que el animal recupere la conciencia de la anestesia dentro de una jaula con tapa filtrante. No deje al ratón sin supervisión hasta que recupere conciencia suficiente para mantenerse en posición esternal recostado.

Aquí, se utiliza software de segmentación para analizar los parámetros anatómicos y funcionales del ventrículo izquierdo. Comience cargando las imágenes en formato DICOM y secuencias cinematográficas en el software. Luego seleccione MRGE como la técnica de imagen, secuencia cinematográfica como tipo de imagen y eje corto medio ventricular.

Como plano de vista de la imagen, especifique los intervalos de tiempo que se utilizarán para el final de la diástole y el final de la sístole mediante las subopciones establecer intervalo de tiempo actual en final de diástole y establecer intervalo de tiempo actual en final de sístole del menú editar, respectivamente. A continuación, utilice el botón de comando VI y luego los botones de comando endo y EPI en el panel inferior derecho. Para dibujar manualmente el ventrículo izquierdo, el endocardio y el epicardio respectivamente, elimine los músculos papilares pulsando el botón de comando correspondiente.

Con el fin de aumentar la precisión de los cálculos, lea los parámetros cuantificados del ventrículo izquierdo, como el volumen diastólico, el volumen sistólico, el volumen de eyección y la fracción de eyección, en el panel superior derecho. Luego, utilice el botón de comando mis y a continuación el botón de comando del calibrador de mediciones para medir los parámetros del ventrículo izquierdo, tales como el grosor de la pared y el diámetro ventricular. Finalmente, asegúrese de usar la opción de guardar ambas pilas de imágenes y la segmentación para guardar las imágenes, incluyendo las segmentaciones en formato dot mat, con el fin de poder volver a procesar las imágenes según sea necesario.

El ángulo en el que se seccionó el corazón para la adquisición de imágenes en vista de dos cámaras puede observarse aquí. Aquí podemos ver un aumento aproximado de 1,5 veces en el grosor del ventrículo izquierdo, lo que indica defectos estructurales en los corazones de los ratones afectados por miocarditis autoinmune en comparación con los ratones sanos. El gasto cardíaco, medido en función del volumen diastólico y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, se redujo en los ratones afectados por miocarditis autoinmune en comparación con los ratones sanos.

Finalmente, los corazones de los grupos de tratamiento anteriores se evaluaron en cuanto a inflamación mediante hemat, in y tinción con eosina. La evaluación histológica de los corazones de ratones con miocarditis, pero no de ratones sanos, mostró infiltrados multifocales de linfocitos. Al realizar este procedimiento, es fundamental asegurarse de que la temperatura corporal del animal permanezca constante para que la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria no cambien significativamente durante los experimentos. Esto es fundamental para obtener resultados reproducibles.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la técnica microscópica de resonancia magnética para evaluar las anomalías funcionales de enfermedades cardíacas inflamatorias como la miocarditis y los ratones. Pero no olvide que trabajar con campos magnéticos altos puede ser extremadamente peligroso, por lo que el soporte para el animal y otros componentes deben ser no magnéticos.