Name: Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Aprenda a cuantificar en tiempo real la invasión de células de cáncer de ovario usando un analizador celular RTCA con placas CIM. Este método permite monitorear continuamente la metástasis peritoneal y estudiar la dinámica de invasión.

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Este trabajo fue apoyado por una Fundación CASS Ciencia y Medicina de subvención; (MB); un Health &amp; Medical National Research Council de Australia Project (KLS, 338516); y por el Programa Operacional de Apoyo a la Infraestructura del Gobierno de Victoria (Australia).

1. Preparación de las células, Medios y Reactivos <ol><li> Preparación del medio que contiene metilcelulosa- <ol><li> Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 100 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (sin aditivos) en un matraz de 250 ml. </li><li> Calentar la solución a bajo en el microondas durante 5 min; tener cuidado para evitar hirviendo sobre. </li><li> Una vez que el polvo de metilcelulosa es semi-disueltos, añadir un agitador magnético limpio y los medios de comunicación para tomar el volumen a 125 ml. </li><li> Mezclar, invertido, y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas, seguido de agitación a 4 ° C durante la noche. </li><li> Dividir la solución en partes iguales en cuatro tubos de 50 ml y centrifugar durante 1,5 horas a 2300 x g. </li><li> Recoger el sobrenadante transparente, de alta viscosidad (aproximadamente el 90-95% de las acciones), alícuota en tubos de 50 ml estériles, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Cultura y Etiquetado de las células <ol><li> Mantener las líneas celulares de cáncer de ovario en monocapa en un tiincubadora de cultivo ncidencia a 37 ° C, 5% de CO2 en medio de crecimiento apropiado (DMEM para las células KGN 17 y MCBD110: M199 para las líneas celulares OVCA429 y OVCA433 18) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L -glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina. </li><li> Mantener las células mesoteliales humanos LP9 en M199: Hams medio F12 que contiene 15% de FBS, 10 ng / ml de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y 400 ng / ml de hidrocortisona, en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Se siembran las células en el tamaño deseado frasco y crecen hasta aproximadamente el 75% de confluencia. Células de la cosecha por tripsinización utilizando 0,05% de tripsina / EDTA, centrifugado a 186 xg durante 5 min, y lavar sedimento de células dos veces con PBS. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. </li></ol></li><li> Método de etiquetado celular fluorescente opcional <ol><li> Resuspender las células cancerosas a una concentración final de 1 x 10 6 células / ml en 1 ml de precalentado PBS/0.1% de BSA. </li><li> Añadir 2 l de 5 mM de stock célula Trsolución CSFE as (u otra etiqueta celular preferida que está retenido a largo plazo) a las células a una concentración final de 10 mM y se incuba a 37 ° C durante 10-15 min en un baño de agua. </li><li> Se inactiva la reacción con 1 ml de medio frío de hielo que contienen 10% de FBS y de re-sedimento por centrifugación. Resuspender en 10 ml de medio de crecimiento precalentado adecuado (vea Paso 1.2.1). </li><li> Se siembran las células en un 75 cm2 de filtro con tapa el frasco y la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Compruebe células bajo un microscopio de fluorescencia para verificar que el nivel de fluorescencia de etiquetado es adecuada para la detección. Una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia, cosecha y cuentan que en los pasos 1.2.3 y 1.2.4 anteriores. </li></ol></li></ol> 2. Generación de esferoides en metilcelulosa <ol><li> Calcular el volumen de las células de cáncer de ovario de la sección 1 necesarias para la generación de esferoide (se requiere un total de 300.000 células por cada pleno experimento placa de 96 pocillos). Note: si el uso de diferentes líneas celulares que se presenta aquí, pueden necesitar ser optimizado para cada línea de las densidades de células de generación de esferoide uniforme. </li><li> Para calcular la dilución de las células en los medios de comunicación metilcelulosa, en primer lugar restar el volumen de la celda requerida (paso 2.1) a partir de 15 ml. </li><li> Añadir 3 ml de solución de metilcelulosa (para hacer 20% de metilcelulosa final) a un volumen de medio de cultivo apropiado para cada línea celular, igual a 15 ml, menos el volumen de la celda y se mezcla a fondo por inversión suave. </li><li> Añadir 300.000 células al medio que contiene metilcelulosa y mezclado a fondo por inversión suave. </li><li> Pipetear 150 l de la mezcla de células / metilcelulosa / media (para un total de 3000 células / pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos cóncava cultivo de fondo y de la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1-4 días o hasta esferoides uniformes forman (1 esferoide / pocillo se observa por lo general). </li></ol> 3. RTCA celulares Invasión ensayos NOTE: lecturas de impedancia se expresan como el Índice de Células (CI), un parámetro adimensional que es un cambio relativo en la impedancia de la pila medida que representa el estado de las células. Para el análisis, los datos de importación en una hoja de cálculo, como Microsoft Excel. <ol><li> Preparación Plate <ol><li> Trabajando en grupos de 4 pozos a la vez, añadir 50 l de matriz (diluido 1:10 en medio de cultivo libre de suero) a cada pocillo de la cámara superior de una placa de 16 pocillos RTCA CIM para asegurar que el área total de la superficie está cubierta . Retire 30 l de la matriz de inmediato, pero poco a poco, para deshacerse de cualquier exceso de líquido. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 4 horas antes de su uso en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Añadir 30 l de medio libre de suero (SFM) apropiados para cada línea celular de cáncer a la cámara superior y 160 l de los medios de comunicación con o sin suero (según su diseño experimental) a la cámara inferior. </li><li> Montar la placa CIM haciendo clic en la cámara baja en la cámara superior y equilibrcomió en una incubadora a 37 ° durante 1 hora en una incubadora de cultivo de tejidos. </li></ol></li><li> Programación del instrumento RTCA <ol><li> Abra el programa de RTCA y seleccione la pestaña &quot;Diseño&quot;. Resalte todos los pozos experimentales. </li><li> Haga clic derecho sobre pozos y seleccione &#39;Activar pozos&#39;; luego rellenar condiciones experimentales y nombres de celda si lo deseas. </li><li> Para agregar pasos o pasos secundarios para el programa, seleccione la pestaña &#39;Schedule&#39; y haga clic derecho en &#39;Agregar un paso&#39;. El primer paso es una preprogramada barrido de fondo, que se incorpora automáticamente en el programa una vez &#39;agregar un paso&#39; que se elija. </li><li> Introduzca los detalles del programa que desee para la Etapa 2 del programa de RTCA, que se registrarán las lecturas durante el establecimiento de la monocapa LP9. Agregar los intervalos de tiempo entre lecturas de impedancia seleccionando la pestaña &#39;Intervalo&#39; y entrar &#39;15 minutos &#39;. Agregar duración experimental seleccionando el &#39;Duración&#39; una pestañad entrar en un tiempo de entre 12 a 24 horas. </li><li> Para agregar pasos posteriores, seleccione la pestaña &#39;Schedule&#39; y haga clic derecho en &#39;Agregar un paso &quot;e introduzca los detalles de los pasos adicionales, como el anterior. Paso 3 del programa RTCA dirigirá el instrumento para tomar las lecturas durante la invasión esferoide; introducir min &#39;5 &#39;bajo la&#39; pestaña &#39;y &#39;48 horas&#39; de intervalo en la pestaña &quot;Duración&quot;. </li><li> Seleccione &#39;plato&#39; en la barra de menú y guardar. </li></ol></li><li> Generación de LP9 monocapa y medición del esferoide Invasión <ol><li> Coloque la placa de la CIM en el instrumento RTCA y programa abierto desde el paso 3.2 anterior. Antes de la adición de células, seleccione &#39;Ejecutar&#39; en la barra de menú y luego en &quot;Inicio&quot;. Un barrido de fondo se realizará automáticamente (paso 1 en las instrucciones del software RTCA). </li><li> Retire la placa de la CIM desde el instrumento tras el barrido de fondo y el lugar en una campana de cultivo de tejidos. </li><li> 50,0 Placa00 LP9 células suspendidas en 160 l SFM en la cámara superior de cada placa CIM también. </li><li> Colocar la placa en el instrumento RTCA y tomar lecturas cada 15 minutos, mientras que la monocapa LP9 está estableciendo durante la noche (Paso 2 del programa RTCA). </li><li> Cosecha esferoides cancerosas generan en la etapa 2 &#39;Generación de esferoides en metilcelulosa&#39;, arriba. <ol><li> Asépticamente, corte 1 mm de la parte superior de una punta de pipeta de 1 ml y utilizar para recuperar suavemente el contenido de cada pocillo. Transferir a un tubo estéril. </li><li> Se centrifuga a 120 xg esferoides durante 8 minutos, y retirar medio de metilcelulosa que contiene por aspiración suave. </li><li> Lave esferoides dos veces más con PBS, centrifugar a 120 xg durante 8 minutos para sedimentar esferoides después de cada lavado. </li><li> Para cada pocillo experimental, resuspender un total de 10 esferoides en 160 l de medio sin FBS. </li><li> Pausa el experimento RTCA seleccionando &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y la comprobación y# 8216; Pausa &#39;. Retire la placa de la CIM en el instrumento, y colocarlos en una campana de cultivo de tejidos. Aspirar los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con los medios de comunicación que contiene esferoide (10 esferas en 160 l) o medio fresco para los pocillos de control-LP9 solamente. </li></ol></li><li> Devuelva la placa al instrumento RTCA. Seleccione &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y comprobar &#39;Abortar paso&#39;. El programa se desplazará al siguiente paso automáticamente. Para reanudar el experimento, seleccione &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y comprobar &#39;Start / Continue&#39;. Paso 3 en el programa RTCA iniciará. </li></ol></li><li> Análisis de Datos <ol><li> Para determinar el nivel de invasividad de las células esferoide, restar los valores obtenidos para la monocapa LP9 sólo a partir de las lecturas individuales obtenidos para las líneas celulares de cáncer de ovario en cada punto de tiempo. </li><li> Para trazar &quot;invasión esferoide &#39;, normalizar todos los valores hasta el punto de tiempo en el que se añadieron los esferoides en la placa, por setting ese punto de tiempo a &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Tarifa de acceso abierto pagada por ACEA Biosciences, Inc. y el Instituto de Investigación Médica MIMR-PHI.

Invadir las células de cáncer de ovario interactúan con una variedad de tipos de células en la superficie del peritoneo, incluyendo fibroblastos, adipocitos, y células mesoteliales, y se cree comunicación bidireccional entre las células cancerosas y las células peritoneales para jugar papeles clave en la conducción del proceso metastásico 2. Una vez dominado, el protocolo descrito en el presente documento es fácilmente adaptable para el estudio de estas interacciones dentro del microambiente peritoneal, por ejemplo, a través de la adición de citoquinas exógenas, factores de crecimiento, o inhibidores específicos a las cámaras superiores o inferiores de la placa de la CIM bien o manipulación genética del cáncer o líneas de células peritoneales. Además, este método puede ser utilizado con células de tumor de ovario primarios recién cosechadas a partir de la ascitis maligna y / o células peritoneales primarios para obtener información directa en el señales reguladoras y las interacciones celulares que rigen el establecimiento de una lesión metastásica dentro de la cavidad peritoneal <shasta&gt; 2. El uso del instrumento RTCA para medir la capacidad invasiva de las células individuales o esferoides ofrece varias ventajas con respecto a los ensayos de punto final individuales convencionales y análisis de la imagen de lapso de tiempo. El instrumento RTCA mide la invasión celular a intervalos definidos de forma continua en el transcurso de un ensayo, que puede ser de horas o días. Esto permite la determinación de los cambios en la tasa de invasión a través del tiempo, lo que supera las limitaciones de los ensayos de punto final individuales. Por ejemplo, el examen de los datos de la invasión de las diferentes líneas celulares de cáncer en un solo punto final (Figura 2), por ejemplo, 3 horas, podrían haber llevado a la conclusión errónea de que KGN y OVCA433 células eran mucho más invasivo que OVCA429 células. Otra ventaja de esta tecnología es que el instrumento RTCA mide los cambios en la impedancia eléctrica. Esto significa que los ensayos se pueden ejecutar sin marcar las células con un agente exógeno, lo que podría tener efectos no deseados sobre phen celularotype o función. Esto se convierte en particularmente importante en el estudio de células de cáncer de ovario primarios derivados de ascitis maligna, con las que es imperativo mantener las manipulaciones a un mínimo con el fin de evitar la introducción de cambios moleculares y fenotípicos que no son un reflejo de su naturaleza in vivo 2. Además, el uso del instrumento RTCA permite la recogida de datos cuantitativos en tiempo real, que no sólo evita el tiempo de consumo de análisis asociados con la microscopía de lapso de tiempo sino que también permite la determinación rápida de ventanas experimentales clave para la optimización de ensayo. Esto es particularmente útil cuando se comparan los efectos de una variedad de factores sobre la invasión esferoide, ya que diferentes factores pueden ejercer sus efectos máximos en diferentes puntos de tiempo o con diferentes perfiles en gran medida con el tiempo. Aunque este protocolo puede ser objeto de modificaciones (por ejemplo, el uso de diferentes matrices ECM, diferentes líneas celulares de cáncer, o diferente cel objetivoLS), si al hacerlo, es importante tener en cuenta que las diversas condiciones experimentales primero se deben optimizar. Por ejemplo, antes de comenzar los estudios de invasión esferoide, el número óptimo de células de cáncer / placa de CIM bien debe en primer lugar ser determinado mediante el ensayo de las titulaciones número de células en cultivo en monocapa. El número óptimo de esferoides para usar por pocillo se basa entonces en este análisis. Por ejemplo, en el método actual, esferoides comprenden aproximadamente 3000 células cada uno cuando primero generada. Si titulaciones número de células iniciales indican que 30.000 células en monocapa son óptimas para la detección en la invasión de análisis, a continuación, se añaden 10 esferoides por placa CIM bien. Por otra parte, al llevar a cabo experimentos de co-cultivo, es importante estudiar los comportamientos del &quot;objetivo&quot; monocapa celular por separado con el fin de determinar si estas células son inherentemente invasivo, ya que esto podría confundir los resultados. En el ejemplo demostrado, esferoides cáncer se siembran en placa en la parte superior de un Monola celular LP9yer, con y sin FBS añadido a la parte inferior así como un quimioatrayente. En paralelo, las células se cultivaron LP9 solo, bajo cada condición de tratamiento. Del mismo modo, cuando el estudio de la capacidad invasiva de las células y los esferoides, también es importante examinar sus capacidades migratorias así con el fin de distinguir los dos comportamientos (es decir, la invasión requiere la digestión proteolítica de una barrera de ECM, mientras que la migración no lo hace). Para ello, omita la barrera ECM (Pasos 3.1.1 - 3.1.3) y llevar a cabo el ensayo en paralelo con la barrera de ECM en su lugar. La medida de &quot;invasión&quot; este último se puede corregir a la antigua medida «migración», si se desea. Finalmente, es importante señalar que la información obtenida a partir de medidas de impedancia eléctrica se limita en su alcance: una vez que las células han invadido a la cámara inferior, los cambios en su fijación, la difusión, y la proliferación en la parte inferior de la membrana pueden contribuir a los cambios en rea de impedanciaabolladuras. Por lo tanto, esta metodología es más informativo cuando se utiliza junto con otros ensayos de viabilidad de esferoides de células, la adhesión, la migración, y la morfología con el fin de evaluar globalmente comportamientos celulares esferoides. Por ejemplo, a ser posible, con el fin de comprender plenamente las interacciones esferoides mesoteliales, co-culturas diferentes también deben ser reflejados periódicamente con microscopía de fase estándar, de modo que las evaluaciones cualitativas de la morfología esferoidal y la salud se pueden hacer de forma paralela a los ensayos de RTCA cuantitativos de invasión. Si se realiza la etapa de etiquetado facultativo, a continuación, el comportamiento de las células individuales del cáncer se pueden determinar con microscopía fluorescente, ya que desagregan del esferoide e interactúan con las células mesoteliales sin etiquetar. Un beneficio adicional de etiquetado con fluorescencia de las células cancerosas cuando se co-cultivo con un segundo tipo de célula es que entonces es posible confirmar que sólo las células cancerosas han invadido a través de las barreras celulares y de ECM. <p class="jove_content"&gt; En resumen, este método representa un alto rendimiento de análisis cuantitativo de la invasión esferoide cáncer de ovario de mesoteliales y ECM barreras. A través de la adición de citoquinas exógenas, factores de crecimiento, o inhibidores específicos a las cámaras superiores o inferiores de la placa de la CIM así, este método permite un rápido, la determinación de los factores que regulan las interacciones entre las células de cáncer de ovario esferoides que invaden a través de mesotelial y las barreras de la matriz sobre tiempo.

El cáncer de ovario tiene la tasa más alta de mortalidad de todos los cánceres ginecológicos 1. A nivel mundial, hay ~ 230 000 casos y más de 100.000 muertes debido a la enfermedad cada año 1. La mayoría de los pacientes (&gt; 75%) se diagnostican después de que el cáncer ya se ha extendido por metástasis, cuando el tratamiento se complica aún más por el aumento de la resistencia a la quimioterapia y el pronóstico es pobre 2. Los pacientes en estadio III-IV de la enfermedad metastásica tienen tasas de supervivencia a 5 años de sólo el 30-40% 3. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una mejor comprensión de los comportamientos celulares que subyacen a la metástasis del cáncer de ovario con el fin de tratar eficazmente la enfermedad avanzada. El modelo actual de la metástasis del cáncer de ovario propone varios pasos en el proceso metastásico, cada uno de los cuales se produce en un microambiente distinto que los impactos en el comportamiento del tumor. Metástasis de células de cáncer de ovario inicialmente se desprenden de la localización del tumor primario y sobreviven en una no adherenciaEstado ENT dentro del fluido peritoneal como células individuales o estructuras multicelulares en tres dimensiones, denominado agregados o esferoides multicelulares 2,4,5. Las células que no forman esferoides en suspensión son más susceptibles a la anoikis 2,4,5. Esferoides también exhiben resistencia a la quimioterapia aumentó, lo que contribuye a la enfermedad residual y posterior recurrencia del cáncer 2,4,5. Un segundo paso crítico en la metástasis del cáncer de ovario es la transición de los agregados de grupos de libre flotación de tumores secundarios establecidos dentro de la pared peritoneal y el omento 5,6. Las interacciones célula-célula y célula-sustrato se han implicado en la formación de agregados, la supervivencia, y la adhesión a la matriz extracelular (ECM) producida por el revestimiento mesotelial del peritoneo 4-11. Como, sin embargo, estos procesos son poco conocidos. Para definir los mecanismos implicados en la diseminación de los cánceres de ovario, esferoides pueden ser generATED a partir de líneas celulares de cáncer establecidas utilizando métodos de cultivo no adherentes, el mantenimiento de las células en suspensión ya sea mediante la adición de metilcelulosa a los medios de cultivo de 12,13 o mediante el cultivo de células en placas de baja fijación 2,14. Cuando cultivadas de esta manera, las células de cáncer de ovario se ensamblan para formar agregados multicelulares o esferoides que presentan propiedades celulares, moleculares, y bioquímicas similares a las de los agregados tumorales encontrado in vivo 2,14. Después de la formación, esferoides pueden ser posteriormente cosechadas a partir del medio no adherentes y se volvieron a sembrar en una variedad de superficies sólidas para más estudios funcionales. Esto representa un avance sobre ensayos en cultivo en monocapa, que no modelar con precisión el comportamiento de células en metástasis de cáncer de ovario en un entorno no adherente tal como el líquido intraperitoneal. La capacidad invasiva de esferoides de cáncer puede ser evaluado en ensayos de punto final tradicional en Boyden cámaras 2 </sup&gt;, pero este enfoque puede ser engañoso, ya que la invasión de células de cáncer de ovario es un proceso dinámico en el tiempo. Un método reciente en tiempo real se ha elaborado utilizando time-lapse microscopía de vídeo del aclaramiento de células mesoteliales invadiendo esferoides con cáncer de ovario 15,16; Sin embargo, el análisis de los datos lapso de tiempo es mucho tiempo y puede ser subjetiva. En la presente memoria, se describe un método rápido, cuantitativo para la evaluación de los comportamientos invasivos de esferoides de cáncer de ovario en tiempo real. En primer lugar, se estableció un modelo de célula-esferoide mesotelial que representa la etapa de la metástasis del cáncer de ovario cuando esferoides multicelulares se unen a e invaden el revestimiento peritoneal para formar tumores secundarios. Entonces metodología para un analizador en tiempo real de la célula (RTCA; ver la tabla Materiales para detalles de la empresa) fue adaptado para llevar a cabo mediciones en tiempo real para la cuantificación de la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas como esferoides y probados en este modelo. En la RTCA eninstrumento, las respuestas celulares se monitorizan continuamente en el transcurso de un ensayo, sin la necesidad de etiquetas exógenas, mediante la medición de cambios en la impedancia eléctrica. Placas de cultivo especialmente diseñados tienen microelectrodos de oro recubiertas situadas debajo de una membrana microporosa en la interfaz entre las cámaras superior e inferior de un 2 septadas bien (placas &#39;CIM). La ubicación de los electrodos en la cámara inferior permite la medición de cambios en la impedancia eléctrica como células invaden a través de un ECM o ECM barrera / celular. La interfaz de membrana entre las 2 cámaras de cada placa de CIM está recubierto en primer lugar con el componente de ECM de interés. En el sistema modelo de la célula mesotelial-esferoide, la interfaz está recubierta con una capa de Matrigel (ver la tabla Materiales para detalles de la empresa), para imitar el complejo ECM subyacente el revestimiento mesotelial del peritoneo, seguido de una monocapa confluente de mesotelial humana &#39; células diana &#39;. Por último, preformadas esferoides de cáncer de ovario son added. Esferoidal células del cáncer de ovario deben invadir activamente a través de la capa de células diana y la matriz para llegar a la cámara inferior y alterar las lecturas de impedancia eléctrica. Las células diana en su propia también son evaluados para asegurarse de que no invaden a través de la capa de matriz y son adecuados para uso en este ensayo.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analizador</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Placas CIM&nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>Sondas moleculares</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa (4.000 centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-12 de Ham</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo cóncava de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Línea celular mesotelial humana</td><td>Instituto Coriell de Investigación Médica&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Matriz Matrigel reducida en factor de crecimiento</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de cáncer de ovario esferoide el apego y la invasión de células mesoteliales en tiempo real

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Los cánceres ováricos metastatizan al derramar en el líquido peritoneal y dispersando a sitios distantes dentro del peritoneo. Los cultivos monocapa no modelar con precisión el comportamiento de las células cancerosas dentro de un entorno no adherente, como las células cancerosas inherentemente agregan en estructuras multicelulares que contribuyen al proceso metastásico al unirse a y la invasión de la membrana peritoneal para formar tumores secundarios. Para modelar esta importante etapa de la metástasis del cáncer ovárico, agregados multicelulares, o esferoides, se pueden generar a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos mantenidos en condiciones no adherentes. Para imitar el microambiente peritoneal encontrado por las células tumorales in vivo, se estableció un modelo de co-cultivo-esferoide mesotelial en el que preformados esferoides se siembran en placa en la parte superior de una monocapa de células mesoteliales humano, formada a través de una barrera de matriz extracelular. Se desarrollaron métodos a continuación, utilizando un analizador de células en tiempo real para llevar a cabo real cuantitativamediciones de tiempo de la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas como esferoides. Este enfoque permite la medición continua de la invasión durante largos períodos de tiempo, lo cual tiene varias ventajas sobre los ensayos de punto final tradicionales y análisis de imagen de microscopía de tiempo real más laborioso. En resumen, este método permite una rápida, la determinación de los factores que regulan las interacciones entre las células de cáncer de ovario esferoides mesoteliales invasores a través de la matriz y las barreras en el tiempo.

Esferoides de cáncer de ovario puede ser generado a partir de muchos tipos de líneas celulares mediante el cultivo en suspensión o por la recolección de células tumorales primarias de la ascitis maligna 2,14. Aquí dos líneas celulares de cáncer de ovario epitelial, OVCA433 y OVCA429, y una línea de tumor de células de la granulosa del ovario, KGN, se han utilizado para generar esferoides (Figura 1A). En este método, las células son cultivadas en pozos de fondo en U mientras que está suspendido en los medios de comunicación que se ha hecho viscoso por la adición de metilcelulosa. En estas condiciones, muchas células de cáncer de ovario presentan una capacidad inherente a agregarse para formar esferoides 13. Tras el cultivo durante la noche en suspensión en metilcelulosa / medios de comunicación, todas las tres líneas celulares forman estructuras compactas esferoide de aproximadamente 400-500 m de diámetro (Figura 1A). Mientras tanto, se prepara la placa de RTCA CIM, en primer lugar, mediante el recubrimiento de la interfase de la membrana porosa con la matriz y luego una monocapa confluente de mes humanoscélulas othelial (Figura 1B). Una vez formados, los esferoides se transfieren luego a la placa de CIM preparado. Esferoides cáncer cosechadas se siembran en placa en la parte superior de la monocapa LP9 y evaluaron como se describe a continuación. Imágenes bajo microscopía de fase estándar (o bajo microscopía fluorescente, si se siguió el paso marcado de células opcional) de cultivos paralelos se toman periódicamente para ayudar en la interpretación de los datos RTCA (Figura 1C). Es informativo para evaluar tanto el nivel basal de la invasión de una línea celular de cáncer, así como la invasión inducida quimioatrayente-. Típicamente, la invasividad basal se mide por la adición de SFM a ambas las cámaras superior e inferior. Medio completo (10% de FBS), que contiene muchos factores quimiotácticos potenciales, se utiliza en el ejemplo actual para examinar invasión &#39;inducida quimioatrayente-&#39; (Figura 2). Estudios paralelos de células mesoteliales LP9 solos confirmaron que estas células son mínimamente eninvasiva más de 2 días bajo sea basal o &#39;quimioatrayente&#39; condiciones inducidas y por lo tanto eran un buen tipo de células para su uso en ensayos de co-cultivo con células de cáncer de ovario (Figuras 2A y 2B). En contraste, esferoides de cáncer de ovario generados usando cualquiera de las tres líneas celulares exhibieron la capacidad de invadir hacia un quimioatrayente (FBS) (Figuras 2A-2C). La principal ventaja de la utilización de los instrumentos en tiempo real RTCA sobre ensayos de punto final tradicionales es que los cambios en el comportamiento celular / esferoide se pueden cuantificar con el tiempo. Durante el ensayo de 2 días, el KGN, OVCA429 y líneas celulares OVCA433 todos mostraron la capacidad de invadir a un quimioatrayente (indicado mediante el aumento de los índices de glóbulos), pero los bajos niveles basales de la invasión (Figura 2 C). Las líneas celulares mostraron tasas similares de invasión, tal como se indica por las pistas paralelas de las curvas (Figura 2C); Sin embargo, la curva de OVCA429 exhibió una asíntota superior más alta,lo que indica un nivel máximo más alto de invasión en comparación con las otras líneas celulares. Además, las líneas celulares mostraron una diferencia en sus tiempos de inicio de la invasión, con las células KGN invadir rápidamente las barreras celulares y de la matriz y la OVCA433 y OVCA429 células que tienen 3 a 5 veces más largo para invadir, respectivamente (Figura 2D). Es importante destacar que, sus comportamientos en el inicio de la invasión no eran predictivos de su capacidad general para la invasión (Figuras 2C y 2D). Esto sugiere diferentes capacidades inherentes de las líneas celulares de cáncer, pero también puede indicar que diferentes factores pueden regular los comportamientos invasivos tempranos y tardíos de esferoides. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 generación esferoide y el modelo de juego experimental A:.. Imagos bajo un microscopio de contraste de fase de esferoides se forman en metilcelulosa / media (arriba) y de la línea celular correspondiente crecido como una monocapa (abajo) B:. Esquema que muestra el RTCA 2 recámara placa CIM bien establecido, en el que pre-formado el cáncer de ovario esferoides se colocan en la parte superior de una monocapa de una capa mesotelial barrera LP9 / matriz en la cámara superior y media ± FBS como quimioatrayente se añade a la cámara inferior. Los electrodos debajo de la interfaz de la medida 2 cámaras incrementando la impedancia eléctrica como más células invaden a través de las barreras a la cámara inferior C:. Imágenes de esferoides KGN en la parte superior de la monocapa LP9 bajo microscopía de contraste de fase (izquierda) o la microscopía de fluorescencia (derecha). Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> .. Figura 2 los datos de invasión esferoide cáncer de ovario en tiempo real A - B: Los resultados representativos de un ensayo de invasión RTCA llevado a cabo con y sin FBS en la cámara inferior de una placa de CIM bien. La invasión de células KGN se compara con las células mesoteliales LP9. Los resultados se muestran como media ± SD Índice de Células de tres pozos en el punto de tiempo de 24 horas (A) y durante un período de ensayo de dos días todo (B) C - D:. Una comparación de la capacidad invasiva de KGN, OVCA429 y célula OVCA433 líneas representadas en un período de 24 horas (C) y de manera más detallada en un período de tiempo de 2,5 h (d).

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar rápidamente, en tiempo real, la invasión de células de cáncer de ovario en un modelo de co-cultivo con células mesoteliales asteroides que simula la metástasis. Esto se logra en primer lugar generando células de cáncer de ovario a partir de líneas celulares mediante el cultivo de las células en condiciones no adherentes en metilcelulosa. El segundo paso consiste en preparar un analizador celular en tiempo real, una placa CIM, recubriendo la cámara superior del pozo de dos cámaras con Matrigel para imitar la membrana basal que se encuentra debajo del mesotelio de la cavidad peritoneal y el propio revestimiento mesotelial.A continuación, se cosechan los esteroides del cáncer de ovario y se añaden a las cámaras superiores de los pocillos de la placa del analizador en tiempo real. El paso final consiste en programar e iniciar el analizador celular en tiempo real, el cual tomará lecturas periódicas a intervalos predeterminados durante un período prolongado de ensayo. En última instancia, los resultados obtenidos representan el proceso continuo de invasión, que se utiliza para determinar los factores clave que regulan las células de cáncer de ovario mientras invaden barreras celulares y matriciales.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los ensayos estándar de invasión de células cancerosas, es que este enfoque permite mediciones continuas de la invasión de células cancerosas durante períodos prolongados de tiempo. A diferencia de un ensayo de punto final único, que no captura completamente la naturaleza dinámica de las metástasis del cáncer de ovario, aunque este método se utiliza para obtener información sobre el cáncer de ovario, también puede aplicarse para estudiar diferentes tipos de procesos metastásicos, como el cáncer de mama o la invasión de células cancerosas a través de una capa endotelial. Asimismo, puede utilizarse para estudiar la invasión celular normal, como la invasión de los trofoblastos durante la implantación del embrión. Para preparar células de cáncer de ovario para la marcación fluorescente de células.Primero, recolecte las células al 75 % de confluencia y resuspenda las células a una concentración final de un millón de células por mililitro en un mililitro de PBS precalentado por cada 0,1 % de BSA. Agregar la cantidad óptima de esteroide por pocillo y manipular el esteroide con cuidado son pasos fundamentales para el éxito de este procedimiento. A continuación, agregue dos microlitros de una solución stock de cinco milimolar de Cell Trace CSFE a las células hasta alcanzar una concentración final de 10 micromolar e incube a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. En un baño de agua, detenga la reacción con un mililitro de medio frío con hielo que contenga 10 % de FBS y vuelva a centrifugar para obtener el precipitado. Resuspenda en 10 mililitros del medio de crecimiento precalentado adecuado y siembre las células en un matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados con tapa filtrante a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono hasta que el nivel de marcado fluorescente sea adecuado para su detección.Comience este procedimiento midiendo el volumen de medio de cultivo adecuado para cada línea celular, que es de 15 mililitros menos el volumen de células necesario para la generación de esferoides. Añada tres mililitros de solución stock de metilcelulosa al medio de cultivo para obtener una concentración final de metilcelulosa del 20 % y mezcle bien mediante inversión suave. Añada 300 000 células al medio que contiene metilcelulosa y mezcle completamente mediante inversión suave. Pipete 150 microlitros de la mezcla de medio con metilcelulosa y células en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos con fondo cóncavo.Esto dará como resultado un total de 3000 células por cultivo en pocillo a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono durante uno a cuatro días o hasta que se forme una capa uniforme de PHE. Típicamente, se observa un esteroide por pocillo en el analizador celular en tiempo real o el ensayo de invasión celular RTCA utiliza una placa CIM de dos cámaras con 16 pocillos RTCA. Trabajando en grupos de cuatro pocillos a la vez, añada 50 microlitros de matriz a cada pocillo de la cámara superior de la placa para asegurar que se cubra toda el área superficial.Retire inmediatamente, pero lentamente, 30 microlitros de matriz para eliminar cualquier exceso de líquido. Incube la placa a 37 grados Celsius durante cuatro horas antes de su uso en un incubador de cultivo de tejidos. Después de cuatro horas, agregue 30 microlitros del medio libre de suero, apropiado para cada línea celular de cáncer, a la cámara superior y 160 microlitros de medio con o sin suero.Según el diseño experimental para la cámara inferior, ensamble la placa CIM haciendo clic con la cámara inferior en la cámara superior y equilibre en un incubador a 37 grados Celsius. Durante una hora en un incubador de cultivo celular, abra el programa RTCA y seleccione la pestaña de diseño. Resalte todos los pozos experimentales, haga clic derecho en los pozos y seleccione activar pozos.Luego complete las condiciones experimentales y los nombres de los ciclos según desee. Para agregar pasos o subpasos al programa, seleccione la pestaña de programación y haga clic derecho para añadir un paso. El primer paso es un barrido de fondo preprogramado, que se incorpora automáticamente al programa.Una vez seleccionado un paso, introduzca los detalles deseados del programa para el paso dos del programa RTCA, que registrará lecturas durante el establecimiento de la monocapa de nueve células mesoteliales humanas. Añada los intervalos de tiempo entre lecturas de impedancia seleccionando la pestaña de intervalo e introduciendo 15 minutos. Añada la duración del experimento seleccionando la pestaña de duración e introduciendo un tiempo entre 12 y 24 horas.Los pasos subsiguientes se agregan de la misma manera. El paso tres del programa RTCA dirigirá el instrumento para tomar lecturas durante la invasión de frid. Ingrese cinco minutos en la pestaña de intervalo y 48 horas en la pestaña de duración.Seleccione placa en la barra de menú y guarde. Para comenzar este procedimiento, coloque la placa CIM en el instrumento RTCA y abra el programa que se guardó anteriormente. Seleccione ejecutar en la barra de menú y luego inicie; se realizará automáticamente una exploración de fondo.Tras el barrido de fondo, retire la placa CIM del instrumento y colóquela en una cabina de cultivo celular. Suspenda 50 000 células LP nine en 160 microlitros de medio sin suero e introdúzcalos en la cámara superior de cada placa CIM. Coloque la placa en el instrumento RTCA y tome lecturas cada 15 minutos mientras la monocapa de células LP nine se establece durante la noche. Al día siguiente, corte asépticamente un milímetro del extremo superior de una punta de pipeta de un mililitro y utilícela para retirar suavemente el contenido de cada pocillo para cada línea celular.Reúna 10 esteroides en un tubo estéril y centrifugue. Centrifugue los esteroides a 120 ×g durante ocho minutos, y luego elimine el medio que contiene metilcelulosa mediante aspiración suave. Lave las esferas dos veces más con PBS centrifugando a 120 ×g durante ocho minutos para sedimentar los esteroides después de cada lavado.Para cada pocillo experimental, resuspenda un total de 10 esteroides en 160 microlitros de medio sin PBS. Pausar el experimento RTCA seleccionando ejecutar en la barra de menú y marcando pausa. Retire la placa CIM del instrumento y colóquela en una cabina de cultivo celular.Aspire el medio de cada pocillo y sustitúyalo por medio que contenga esteroides. Devuelva la placa al instrumento RTCA. Seleccione ejecutar en la barra de menú y marque el paso de interrupción.El programa pasará automáticamente al siguiente paso. Para reanudar el experimento, seleccione ejecutar en la barra de menú y marque inicio continuo. El paso tres del programa RTCA iniciará en este experimento dos líneas celulares de cáncer epitelial de ovario OVCA 4 33 y OVCA 4 29 y una línea de tumor de células granulosas ováricas.Las KGN se utilizaron para generar esteroides tras un cultivo nocturno y cavidades con fondo redondeado suspendidas en un medio que contenía metilcelulosa. Las tres líneas celulares formaron estructuras esteroides compactas de aproximadamente entre 400 y 500 micrómetros de diámetro. Los paneles inferiores muestran la línea celular correspondiente cultivada en escala de monocapa.Las barras representan 100 micrómetros una vez formadas. Los esteroides se cosecharon y sembraron sobre una monocapa de células mesoteliales LP9 en una placa R-T-C-A-C-I-M. Se tomaron periódicamente imágenes mediante microscopía de contraste de fases o microscopía de fluorescencia de cultivos paralelos para ayudar en la interpretación de los datos RTCA.Es informativo evaluar tanto la capa basal de invasión de una línea celular de cáncer como la invasión inducida por quimioatractantes. En este ejemplo, la invasividad basal se mide mediante la adición de medio sin suero o SFM a las cámaras superior e inferior. Se utiliza medio completo con 10 %FBS, que contiene muchos quimioatractantes potenciales, para examinar la invasión inducida por quimioatractantes.Se muestran aquí resultados representativos de una comparación de la invasión celular entre las células kgn y las células mesoteliales LP nine. El ensayo de invasión RTCA se realizó con y sin suero bovino fetal (FBS) en la cámara inferior de una placa CIM. Los resultados se presentan como el índice celular medio positivo menos la desviación estándar (SD) a partir de pocillos triplicados en el punto temporal de 24 horas y durante todo el período de ensayo de dos días.Estos resultados confirman que las células LP nine son mínimamente invasivas durante dos días bajo condiciones basales o inducidas por quimioatractantes, por lo que representan un buen tipo celular para utilizar en ensayos de cultivo conjunto con células de cáncer ovárico. En contraste, las células KG y los esteroides de cáncer ovárico mostraron la capacidad de invadir hacia un quimioatractante. Esta gráfica presenta los resultados de una comparación de la capacidad invasiva de las líneas celulares K-G-N-O-V-C-A 4 29 y OVCA 4 33 representadas durante un período de 24 horas dentro del ensayo de dos días.Las tres líneas celulares mostraron la capacidad de invadir hacia un quimioatractivo, tal como lo indica el aumento de los índices celulares. Las líneas celulares presentaron tasas similares de invasión, tal como lo indican las pendientes paralelas de las curvas. Sin embargo, la curva de OVCA 4 29 exhibe una asíntota superior más alta, lo que indica un nivel máximo de invasión mayor en comparación con las otras líneas celulares.En contraste, los niveles basales de invasión de todas las líneas celulares fueron bajos. Además, las líneas celulares mostraron diferencias en sus tiempos de inicio de la invasión, como lo muestra un análisis más detallado de los datos de invasión durante un período de 2,5 horas. Las células KGN invaden rápidamente las barreras celulares y matriciales, mientras que las células OVC 4 33 y OVC 4 29 tardan tres y cinco veces más, respectivamente, en invadir.Es importante destacar que sus comportamientos al inicio de la invasión no fueron predictivos de su capacidad general de invasión. Esto sugiere diferentes capacidades inherentes de las líneas celulares cancerosas, pero también puede indicar que diferentes factores regulan los comportamientos invasivos tempranos y tardíos de los esteroides. Una vez dominada, esta técnica es fácilmente adaptable para estudiar diversas moléculas de señalización y vías celulares dentro del microambiente peritoneal que afectan el comportamiento metastásico.Esto puede lograrse mediante la adición de factores de crecimiento exógenos, citocinas o inhibidores a la cámara inferior o superior del pocillo. Alternativamente, se pueden manipular genéticamente las propias células cancerosas o las células diana peritoneales.

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