Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar rápidamente en tiempo real la invasión de células de cáncer de ovario en un modelo de cocultivo de células mesoteliales de asteroides. Esto se logra generando, en primer lugar, cáncer de ovario a partir de líneas celulares mediante el cultivo de las células en condiciones no adherentes en metilcelulosa. El segundo paso es preparar un analizador de células en tiempo real, placa CIM, codificando la cámara superior del pozo de dos cámaras con matrigel para imitar la membrana basal que subyace al mesotelio de la cavidad peritoneal y al propio revestimiento mesotelial.

A continuación, se cosechan los esteroides para el cáncer de ovario y se añaden a las cámaras superiores de los pocillos de la placa del analizador en tiempo real. El paso final es programar e iniciar el analizador de células en tiempo real, que tomará lecturas periódicas a intervalos predefinidos durante un período prolongado de ensayo. En última instancia, los resultados obtenidos describen el proceso de invasión continua, que se utiliza para determinar los factores clave que regulan las células de cáncer de ovario a medida que invaden las barreras celulares y de la matriz.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos transmundiales estándar de invasión de células cancerosas, es que este enfoque permite mediciones continuas de la invasión de células cancerosas durante largos períodos de tiempo. A diferencia de un ensayo de criterio de valoración único, que no capta completamente la naturaleza dinámica de las metástasis del cáncer de ovario, aunque este método se utiliza para proporcionar información sobre el cáncer de ovario, también se puede aplicar para estudiar diferentes tipos de procesos metastásicos, como el cáncer de mama o la ación de células cancerosas a través de una capa endotelial. Asimismo, se puede utilizar para estudiar la invasión celular normal como la invasión de trofoblastos durante la implantación del embrión para preparar las células de cáncer de ovario para el marcaje de células fluorescentes.

Las células de la primera cosecha al 75% de la fluidez y la suspensión de las células resus a una concentración final de 1 millón de células por mililitro en un mililitro de PBS precalentado por 0,1%BSA La adición de la cantidad óptima de esteroides por pocillo y el manejo cuidadoso de los esteroides son fundamentales para el éxito de este procedimiento. A continuación, agregue dos microlitros de un stock de cinco milimolares de solución de CSFE de trazas celulares a las células a una concentración final de 10 micromolares e incube a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos En un baño de agua, apague la reacción con un mililitro de medio helado que contenga 10% de FBS y regranule por centrifugación. Reus. Gaste 10 mililitros del medio de crecimiento precalentado apropiado y las células de siembra en un cultivo de matraz con tapa de filtro de 75 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono hasta que el nivel de marcado de fluorescencia sea adecuado para la detección.

Comience este procedimiento midiendo el volumen de medio de cultivo apropiado para cada línea celular, que es de 15 mililitros menos el volumen de células necesario para la generación de esphe. Añada tres mililitros de solución madre de metilcelulosa al medio de cultivo para lograr una concentración final de metilcelulosa del 20% y mezcle bien mediante una inversión suave. Agregue 300, 000 células al medio que contiene metilcelulosa y mezcle completamente con una pipeta de inversión suave 150 microlitros de la mezcla de medios de metilcelulosa celular en cada pocillo de una placa de cultivo de fondo cóncavo de 96 pocillos.

Esto dará como resultado un total de 3000 células por cultivo de pocillo a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante uno a cuatro días o hasta que se forme PHE uniforme. Por lo general, se observa un esteroide por pocillo, el analizador de células en tiempo real o el ensayo de invasión celular RTCA utiliza una placa CIM de dos cámaras RTCA de 16 pocillos. Trabajando en grupos de cuatro pocillos a la vez, agregue 50 microlitros de matriz a cada pocillo de la cámara superior de la placa para asegurarse de que se cubra el área total de la superficie.

Retire 30 microlitros de matriz de inmediato pero lentamente para eliminar el exceso de líquido. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante cuatro horas antes de usarla en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de cuatro horas, agregue 30 microlitros de suero libre, medio apropiado para cada línea celular cancerosa a la cámara superior y 160 microlitros de medio con o sin suero.

Según el diseño experimental de la cámara inferior, ensamble la placa CIM encajando la cámara inferior en la cámara superior y equilibre en una incubadora a 37 grados centígrados. Durante una hora en una incubadora de cultivo de tejidos, abra el programa RTCA y seleccione la pestaña de diseño. Resalte todos los pozos experimentales, haga clic con el botón derecho en los pozos y seleccione activar pozos.

A continuación, rellene las condiciones experimentales y venda los nombres que desee. Para agregar pasos o subpasos al programa, seleccione la pestaña de programación y haga clic con el botón derecho en agregar un paso. El primer paso es un barrido de fondo preprogramado, que se incorpora automáticamente al programa.

Una vez que se elige agregar un paso, ingrese los detalles del programa deseado para el paso dos del programa RTCA, que registrará las lecturas durante el establecimiento de la monocapa de células mesoteliales humanas LP nueve. Agregue los intervalos de tiempo entre las lecturas de impedancia seleccionando la pestaña de intervalo e ingresando 15 minutos. Agregue la duración experimental seleccionando la pestaña de duración e ingresando un tiempo entre 12 y 24 horas.

Los pasos posteriores se agregan de la misma manera. El tercer paso del programa RTCA dirigirá al instrumento para que tome lecturas durante la invasión de frid. Introduzca cinco minutos en la pestaña de intervalo y 48 horas en la pestaña de duración.

Seleccione placa en la barra de menú y guarde. Para comenzar este procedimiento, coloque la placa CIM en el instrumento RTCA y abra el programa que se guardó anteriormente. Seleccione ejecutar en la barra de menú y luego iniciar un barrido de fondo que se realizará automáticamente.

Después del barrido de fondo, retire la placa CIM del instrumento y colóquela en una placa de cubierta de cultivo de tejidos. 50.000 LP nueve células suspendidas en 160 microlitros de medio libre de suero en la cámara superior de cada placa CIM. Coloque la placa en el instrumento RTCA y tome lecturas cada 15 minutos mientras la monocapa LP nine se establece durante la noche del día siguiente, corte asépticamente un milímetro de la parte superior de una punta de pipeta de un mililitro y utilícela para recuperar suavemente el contenido de cada pocillo para cada línea celular.

Piscina 10 esteroide en una centrífuga de tubo estéril. Esteroides a 120 GS durante ocho minutos, y luego eliminar el medio que contiene metilcelulosa mediante una aspiración suave. Lave sphe dos veces más con centrífugo PBS para usar a 120 GS durante ocho minutos para pellets esteroides después de cada lavado.

Para cada pozo experimental, Resus gasta un total de 10 esteroides en 160 microlitros de medio sin PBS. Para pausar el experimento RTCA, seleccione ejecutar en la barra de menús y marque la opción de pausa. Retire la placa CIM del instrumento y colóquela en una campana de cultivo de tejidos.

Aspire los medios de cada pocillo y reemplácelos con medios que contengan esteroides. Regrese la placa al instrumento RTCA. Seleccione ejecutar en la barra de menú y marque el paso de anulación.

El programa pasará al siguiente paso automáticamente. Para reanudar el experimento, seleccione ejecutar en la barra de menús y marque iniciar continuar. El tercer paso del programa RTCA iniciará en este experimento dos líneas celulares epiteliales de cáncer de ovario, OVCA 4, 33 y OVCA 4, 29, y una línea tumoral de células de la granulosa ovárica.

Se utilizaron KGN para generar esteroides después de un cultivo nocturno y permanencias en U suspendidas en medios que contenían metilcelulosa. Las tres líneas celulares formaron estructuras compactas de esteroides de aproximadamente 400 a 500 micrómetros de diámetro. Los paneles inferiores muestran la línea celular correspondiente cultivada en una escala monocapa.

Las barras representan 100 micrómetros una vez formadas. Los esteroides se cosecharon y se colocaron sobre una monocapa de células mesoteliales LP nueve en una placa R-T-C-A-C-I-M. Se tomaron periódicamente imágenes bajo microscopía de contraste de fase o bajo microscopía fluorescente de cultivos paralelos para ayudar en la interpretación de los datos de la RTCA.

Es informativo evaluar tanto la capa basal de invasión de una línea celular cancerosa como la invasión inducida por la quimioterapia. En este ejemplo, la invasividad basal se mide mediante la adición de medio libre de suero o SFM tanto en la cámara superior como en la inferior. Los medios completos con 10% de FBS, que contiene muchos atrayentes potenciales de quimioterapia, se utilizan para examinar la invasión inducida por atrayentes de quimioterapia.

Aquí se muestran los resultados representativos de una comparación de la invasión celular entre las células kgn y las células mesoteliales LP nueve. El ensayo de invasión RTCA se llevó a cabo con y sin FBS en la cámara inferior de la placa A CIM. Los resultados se muestran como un índice de células medio positivo menos SD de pocillos triplicados en el punto de tiempo de 24 horas y durante un período de ensayo completo de dos días.

Estos resultados confirman que las células LP nueve son mínimamente invasivas durante dos días en condiciones basales o inducidas por quimioatrayentes, y por lo tanto eran un buen tipo de célula para usar en ensayos de cocultivo con células de cáncer de ovario. Por el contrario, el KG y los esteroides para el cáncer de ovario mostraron la capacidad de invadir hacia un atrayente de quimioterapia. Este gráfico presenta los resultados de una comparación de la capacidad invasiva de las líneas celulares K-G-N-O-V-A 4 29 y OVCA 4 33 representadas durante un período de 24 horas durante el ensayo de dos días.

Las tres líneas celulares exhibieron la capacidad de invadir hacia un atrayente de quimioterapia, como lo indica el aumento de los índices celulares. Las líneas celulares exhibieron tasas similares de invasión, como lo indican las pendientes de las líneas paralelas de las curvas. Sin embargo, la curva OVCA 4 29 exhibe una mayor cantidad de asim superior, lo que indica un mayor nivel máximo de invasión en comparación con las otras líneas celulares.

Por el contrario, los niveles basales de invasión de todas las líneas celulares fueron bajos. Además, las líneas celulares mostraron diferencias en sus tiempos hasta el inicio de la invasión, como lo demuestra un análisis más detallado de los datos de invasión durante un período de tiempo de 2,5 horas. Las células KGN invaden rápidamente las barreras celulares y de la matriz, mientras que las células OVC 4, 33 y OVC 4, 29 tardan tres y cinco veces más en invadir, respectivamente.

Es importante destacar que sus comportamientos al inicio de la invasión no eran predictivos de su capacidad general para la invasión. Esto sugiere diferentes capacidades inherentes de las líneas celulares cancerosas, pero también puede indicar que diferentes factores regulan los comportamientos invasivos tempranos y tardíos de los esteroides. Una vez dominada, esta técnica es fácilmente adaptable para estudiar varias moléculas de señalización y vías celulares dentro del microambiente peritoneal que afectan el comportamiento metastásico.

Esto se puede lograr mediante la adición de factores de crecimiento exógenos, citocinas o inhibidores a la cámara inferior o superior del pocillo. Alternativamente, puede manipular genéticamente las propias células cancerosas o las células diana peritoneales.