Protocolo SIVQ-LCM para el Instrumento ArcturusXT

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el análisis de imágenes SIVQ o invariante espacialmente en combinación con la microdisección de captura láser o LCM para identificar las características tisulares de interés y realizar rápidamente la microdisección dirigida. Esto se logra capturando primero imágenes del tejido objetivo para SIVQ. A continuación, se realiza el análisis SIVQ y la anotación SIVQ se importa al dispositivo de microdisección para su procesamiento.

En última instancia, las células de interés pueden ser aisladas por S-I-V-Q-L-C-M para el análisis molecular posterior. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que S-I-V-Q-L-C-M agiliza el proceso de selección y microdisección de grandes áreas objetivo que, de otro modo, serían desafiantes y requerirían mucho tiempo con las técnicas tradicionales de microdisección de captura láser. La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Avi Rosenberg, miembro clínico de nuestro laboratorio, para obtener imágenes de las muestras de tejido de interés.

En primer lugar, cargue los portaobjetos en la platina motorizada del instrumento de microdisección e inicie el software relacionado. A continuación, seleccione las casillas de verificación adecuadas para designar las posiciones de las diapositivas cargadas y asegúrese de que los archivos de imagen capturados se guarden en formato JPEG. Ajuste el brillo y el enfoque de la imagen en la pantalla para optimizar la calidad de la imagen.

A continuación, utilizando la caja de herramientas de inspección, gire el difusor y establezca un brillo de lámpara de 60 y una ganancia de cámara de dos 20. En la ventana de información general, haga clic con el botón derecho para seleccionar, recordar la configuración y guardar. Capture una imagen general en miniatura de la diapositiva para proporcionar una hoja de ruta para el proceso de disección.

Ajuste una ampliación y encuentre el área de interés. A continuación, capture una imagen de la zona para el análisis del algoritmo de las imágenes capturadas. Comience transfiriendo las imágenes a la carpeta SIVQ.

A continuación, abra SIVQ y cargue la imagen capturada de interés. Desplácese hasta el área de interés y ajuste el tamaño de las ventanas de visualización cinco y seis de la ventanilla sin ajustar la ampliación de la imagen. A continuación, seleccione el tamaño del vector de anillo y el número de anillos que se utilizarán para el análisis.

Haga clic con el botón derecho en la característica de imagen predicada que se capturará en la ventana de la ventanilla seis, seleccione mapa de calor y, a continuación, haga clic en escanear a X para analizar la imagen. A continuación, utilice la parte superior de las dos barras deslizantes horizontales para ajustar la especificidad general del vector. Utilice la barra inferior para aumentar la sensibilidad después de la realización de la piel.

Para aumentar el área clasificada como coincidente, desmarque la casilla de opción del mapa de calor para asegurarse de que el mapa de calor SIVQ cambie a un color rojo uniforme y aumente el tamaño de la pintura. Guarde la imagen haciendo clic en el botón Guardar imagen. A continuación, convierta la salida BMP a un formato de archivo JPEG.

A continuación, utilice un editor hexadecimal para retomar las coordenadas posicionales encontradas entre el inicio del marcador de imagen y el primer marcador de la tabla de cuantificación definido en el encabezado del archivo JPEG posterior al análisis a partir de la imagen del instrumento de disección original antes de comenzar la microdisección. Coloque la tapa de captura láser MICRODISSECTION o LCM en el centro de la región de interés donde se capturaron las imágenes para el análisis SIVQ. A continuación, después de calibrar los láseres UV e infrarrojos, optimice los parámetros, incluida la duración de la potencia, las ubicaciones del láser y la velocidad de corte UV.

A continuación, abra el software de selección automática e importe la imagen analizada. Cree un nuevo archivo de análisis para entrenar al software de selección automatizada para que reconozca la anotación SIVQ. Ahora seleccione las áreas de fondo que están marcadas por los cuadrados azules de la imagen analizada por SIVQ.

A continuación, seleccione las regiones de interés o R OIS marcadas con los círculos rojos y haga clic en aprender para generar el archivo de entrenamiento. Copie las áreas seleccionadas en la imagen en vivo. Para comenzar la microdisección, seleccione la caja de herramientas de microdisección y elija los botones de captura infrarroja o corte UV adecuados.

Una vez completada la disección, mueva la tapa LCM a la estación de control de calidad y capture una imagen de la muestra disecada. Finalmente, si las muestras deseadas se han diseccionado con éxito, haga clic en el botón de etapa actual y retire la tapa del LCM para iniciar el procedimiento de extracción molecular para el análisis posterior. En este experimento representativo, una sección de tejido mamario humano incrustado en parafina fijada en formol fue inmunoteñida para citoqueratina AE uno, EA tres utilizando un protocolo de inmunohistoquímica estándar.

Dado que este tejido no se puede cubrir para la microdisección, las células teñidas con inmunohistoquímica pueden ser difíciles de apreciar visualmente. Por lo tanto, para proporcionar una mejor coincidencia de índices y una imagen mejorada, se agregaron xilenos a la sección de tejido para crear un pseudo cubreobjetos. A continuación, se capturó una imagen JPEG de la zona deslizada de la pseudo cubierta y se importó a SIVQ para el análisis del algoritmo.

El usuario seleccionó una característica de imagen predicada observada como una tinción DAB de color marrón oscuro y se inició el algoritmo SIVQ para el análisis de imágenes. A continuación, el mapa de calor SIVQ se convirtió en una pintura roja reconocida por el software de selección automatizada, y se permitió que los xilenos se evaporaran. A continuación, el mapa de calor SIVQ se importó al software de selección automatizada.

Finalmente, las células resaltadas se diseccionaron con el láser infrarrojo. A continuación, el tapón LCM se trasladó a la estación de control de calidad del instrumento de microdisección y se inspeccionó visualmente para evaluar el éxito de la disección. También se inspeccionó el tejido restante y se volvió a importar el mapa de calor del SIVQ.

Para confirmar aún más la eficiencia de la microdisección, una vez dominada, S-I-V-Q-L-C-M se puede realizar en cuestión de minutos por portaobjetos rápidamente, proporcionando rápidamente una entrada enriquecida para una variedad de técnicas analíticas posteriores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar S-I-V-Q-L-C-M en su flujo de trabajo de microdisección.