Name: Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas en cardiomiocitos neonatales de rata mediante transducción viral y microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite observar dinámicas celulares en tiempo real.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Alengo Nyamay'antu y a la Dra. Ilse Timmerman por sus consejos sobre el empaquetamiento lentiviral. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención de desarrollo científico de la American Heart Association 10SDG4170137.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Cardiomiocitos primarios aislados de ratas neonatales han sido utilizados para estudiar las funciones de cardiomiocitos in vitro. Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos neonatales de crías de rata utilizando un método de digestión de la enzima de dos pasos, primero la digestión con tripsina de O / N a 4 ° C y luego se colagenasa purificada. Una ventaja de emplear el paso de colagenasa purificada es que el mismo grado de enzima se utiliza para todos los aislamientos. Por lo tanto...

De rata cardiomiocitos neonatales primarios han sido utilizados para investigar la función de los cardiomiocitos in vitro 1. Son fáciles de aislar de las crías de rata por varios métodos bien establecidos 2-4. El método más común emplea colagenasa o tripsina para digerir tejido conectivo del corazón antes del aislamiento celular. Los investigadores también han desarrollado métodos para aislar los cardiomiocitos de los roedores adultos 5-8, así como los ratones neonatales 9,10. Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos a partir de crías de rata neonatales, el empleo de un procedimiento de digestión de la enzima de dos pasos. La tripsina se utilizó por primera vez O / N a 4 ° C, y luego colagenasa purificada a 37 º C. La incubación del tejido del corazón con tripsina O / N a 4 ° C reduce las medidas necesarias para las células de la cosecha en comparación con los métodos que utilizan las incubaciones secuenciales en una solución de enzima caliente 2. Además, mediante el uso de co purificadallagenase en lugar de las enzimas del crudo, la variabilidad de lote a lote puede ser eliminado, lo que proporciona una mayor reproducibilidad. Los estudios funcionales de una proteína particular, a menudo emplean un sistema de expresión de proteínas utilizando un adenovirus 11-13 y / o un lentivirus 14-16. [NOTA DE ADVERTENCIA] La producción viral y la manipulación deben llevarse a cabo de acuerdo con las directrices del NIH. El adenovirus no se integra en el genoma del huésped. Tiene una muy alta eficiencia de transducción en la mayoría de tipos de células, incluyendo células que se dividen y células que no se dividen, así como células primarias y líneas celulares establecidas. Esto hace que el adenovirus de un vector fiable para la expresión génica. Los altos niveles de la proteína codificada por el vector de adenovirus se desarrollan dentro de 48 horas después de la transducción, y pueden durar varias semanas 17. Sin embargo, un inconveniente a la utilización de un adenovirus para la expresión de proteínas es que el desarrollo de un ADE recombinantenovirus es complicado y lleva mucho tiempo. Este inconveniente se explica en parte por qué muchos investigadores han acudido a los lentivirus para la expresión de genes recombinantes. A diferencia de las construcciones adenovirales, generando un constructo lentiviral que es rápida y fácil. Aunque lentivirus generalmente tienen una menor eficiencia de la transducción de adenovirus que, en ambas células que se dividen y que no se dividen, que no integrarse en el genoma del huésped. En consecuencia, la expresión del gen transducido es más estable para los lentivirus que para adenovirus. Debido a los avances tecnológicos en el campo de la microscopía, es mucho más fácil para capturar imágenes de células vivas de las células que expresan proteínas recombinantes. Esto es cierto incluso a velocidades de tasa de vídeo de adquisición. Esto permite que el investigador para determinar cómo las alteraciones particulares en la proteína de interés funcionalmente impactan la célula en tiempo real. El microscopio confocal de disco giratorio tiene varias características clave que hacen que sea una técnica óptima para livde formación de imágenes e celular 18,19. El disco giratorio Yokogawa permite la adquisición de imágenes mucho más rápido, mientras que al mismo tiempo la utilización de mucha menos energía de láser que los microscopios confocales de barrido punto. Ambas características especiales se deben a la disco giratorio, que contiene numerosos agujeros confocal a través del cual el láser pasa simultáneamente a las muestras. Durante la adquisición, el propio disco gira rápida y continuamente 18-20. Al utilizar el sistema de enfoque automático del microscopio, el enfoque estable se mantiene durante largos períodos de tiempo. Esto permite a los investigadores a tomar imágenes de células vivas bien enfocadas. Las imágenes adquiridas se reproducen como un archivo de película. Las imágenes se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ 21,22, FIYI 23, u otro software disponible comercialmente.

<table><tbody><tr><td>1 Tijeras para la decapitación</td><td>WPI</td><td></td><td>501749 Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>1 Tijeras finas para el aislamiento del corazón y el corte</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>2 Pinzas finas (Dumont No. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>3 platos de plástico esterilizados de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para el aislamiento del corazón</td></tr><tr><td>3,5 cm Fondo de vidrio placas de cultivo</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Para la siembra final de cardiomiocitos para futuras imágenes de células vivas. Los Micro-Platos de ibidi son una alternativa aceptable.</td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de cristal de 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Para TIRF o imagen de alta resolución</td></tr><tr><td>Solución de etanol, 70% (v/v) en agua</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Plato de plástico esterilizado de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para tripsinización</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Dos placas de cultivo celular de plástico de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para la selección</td></tr><tr><td>Autopipeta</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Para la trituración</td></tr><tr><td>Contador</td><td></td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>Celómetro, contador de células automatizado</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Para comprobar y contar células</td></tr><tr><td>Microscopio y hematocitómetro</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para comprobar y contar células</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0.4%</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora orbital agitadora</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Para agitar el tejido cardíaco con colagenasa a 37 & deg; C a 170-200 rpm</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU solución</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>invitrogen</td> de alta glucosa <td>41965039</td><td>Mezcle el medio como se indica en el protocolo y caliente antes de usar</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Mezcle el medio como se indica en el protocolo y caliente antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>invitrogen 26140079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sección 2 Transducción</td><td></td><td></td><td></td>lentiviral</tr><tr><td>3 Empaquetamiento de</td><td></td><td></td><td></td>plásmidos</tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>El vector de transferencia lentiviral, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (medio sin suero)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td>de transfección</tr><tr><td>polietileneimina" máx.", (MW 40.000) - PEI lineal de alta potencia (equivalente a mw 25.000 en forma de base libre)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Se puede sustituir por X-tremeGENE 9 de Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>sustituto del PEI como reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Cloroquina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Disolver en agua y hacer una solución madre de 100 mM. La inhibición de la acidificación endosomal se puede lograr con 10-100 &mu; M Cloroquina.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jeringa Luer-Lok, esterilizada</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtros</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Utilice únicamente filtros de acetato de celulosa o polietersulfona (PES) (baja unión a proteínas). No utilice filtros de nitrocelulosa. La nitrocelulosa se une a las proteínas de superficie de la envoltura lentiviral y destruye el virus.</td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Disolver en agua y hacer una solución madre de 8 mg/ml, luego filtrarla para esterilizar.</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sección 3 Transducción</td><td></td><td></td><td></td>adenoviral</tr><tr><td>Células HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Unas placas de cultivo celular de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos con tapa, fondo plano, cultivo de tejidos, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Para la valoración</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal, 10-100 &mu; l, 8 canales</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sección 4 Adquisición de imágenes</td><td></td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>vivas Disco giratorio microspopy confocal</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Una cámara con control de temperatura</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para mantener la temperatura a 37 °C; C</td></tr><tr><td>A Sistema ambiental CO2</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Opcional para mantener una concentración óptima de CO2</td></tr><tr><td>CO2 Medio independiente, sin glutamina</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Para imágenes de lapso de tiempo prolongado</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, HEPES, invitrogen rojo sin fenol</td><td></td><td>21063-029</td><td>Para imágenes de lapso de tiempo prolongado</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos siguiendo adenoviral y lentiviral transducción usando confocal spinning disco microscopía

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primarios de rata cardiomiocitos neonatales son útiles en básica en la investigación cardiovascular in vitro, ya que pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades en un único procedimiento. Debido a los avances en la tecnología de microscopio que es relativamente fácil de capturar imágenes de células vivas con el fin de investigar los eventos celulares en tiempo real con una mínima preocupación con respecto a la fototoxicidad a las células. Este protocolo se describe cómo tomar imágenes timelapse células vivas de rata primaria cardiomiocitos neonatales con un microscopio confocal de disco giratorio tras la transducción lentiviral y adenoviral para modular las propiedades de la célula. La aplicación de dos tipos diferentes de virus hace que sea más fácil de conseguir que la tasa de expresión y la transducción de los niveles adecuados de dos genes diferentes. Imágenes de células vivas bien enfocadas pueden ser obtenidos usando el sistema de enfoque automático del microscopio, que mantiene el enfoque estable durante largos períodos de tiempo. La aplicación de este método, las funciones del ingeniero exógenamenteproteínas ed expresadas en células primarias cultivadas pueden ser analizados. Además, este sistema puede ser usado para examinar las funciones de los genes a través del uso de siRNAs, así como de los moduladores químicos.

Para ilustrar la técnica, un lentivirus EGFP codificación (proteína fluorescente verde potenciada)-etiquetados Cx43 (connexin43) o un Cx43 mutado 32 se utilizó para expresar proteínas EGFP-etiquetados en las células, y un adenovirus que codifica FGFR1DN (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 negativo dominante ) se utilizó para apagar la señalización de FGF en la celda 33 a 35. Tres días después de la aislamiento de los cardiomiocitos, los cardiomiocitos aislados fueron transducidas ...

Este protocolo describe un método de obtención de imágenes de células vivas utilizando cardiomiocitos neonatales primarios de rata después de la transducción lentiviral y adenoviral utilizando microscopía de disco giratorio confocal. Esto permite observaciones detalladas de los procesos celulares en cardiomiocitos vivos.

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de lapso de tiempo de cardiomiocitos primarios neonatales de rata tras la transducción con lentivirus y adenovirus, utilizando microscopía confocal de disco giratorio. Esto se logra primero mediante la obtención de cardiomiocitos de crías de rata y el sembrado de las células en placas con fondo de vidrio. El siguiente paso consiste en realizar la transducción de la conexina 43 marcada con EGFP mediante lentivirus, seguida de la transducción del receptor tirosina quinasa fgfr dominante negativo mediante adenovirus en los cardiomiocitos.El paso final consiste en obtener imágenes de lapso de tiempo mediante microscopía confocal de disco giratorio. En última instancia, se puede obtener una película que se reproduce a partir de las imágenes de lapso de tiempo adquiridas. Esto muestra la distribución de la proteína marcada con EGFP expresada por genes lentivirales en cardiomiocitos primarios vivos bajo condiciones celulares alteradas por una proteína expresada por adenovirus, dominante negativa para fgfr1.Una de las principales ventajas de esta técnica es que se puede realizar imágenes de lapso de tiempo en células vivas media

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Investigación

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Biology

Biología

Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

El aislamiento de cardiomiocitos de rata neonata es un procedimiento lento e impredecible.  Este estudio describe métodos para la criopreservación y descongelación de cardiomiocitos de ratas neonatas que permiten un uso más eficiente de las células. Los NRCM descongelados se pueden utilizar para varios experimentos sin necesidad de realizar aislamientos cada vez.

El aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos

Este protocolo describe un método paso a paso para el aislamiento reproducible y el cultivo a largo plazo de cardiomiocitos de ratón adultos con alto rendimiento, pureza y viabilidad.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Describimos un protocolo para obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones embrionarios y postnatales intactos. Utilizando métodos de limpieza de tejidos en combinación con la tinción de montaje completo, se pueden obtener imágenes claras y precisas de células marcadas con proteínas fluorescentes individuales dentro de un corazón embrionario o posnatal.

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Aprende a realizar imágenes de células vivas en cardiomiocitos neonatales de rata mediante transducción viral y microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite observar dinámicas celulares en tiempo real.

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía (Video) | JoVE Journal

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

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