Name: La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la actividad antifúngica de macrófagos alveolares aislados mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar el control del crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitadas en modelos murinos.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de Grant R01AI079253 (a BHS) y por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de subvención de apoyo CA016056 al Instituto del Cáncer Roswell Park.

Todos los procedimientos realizados en animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto del Cáncer Roswell Park y cumplan con todo el estado, federal, y los Institutos Nacionales de la normativa de salud. 1. In vivo de macrófagos Etiquetado Nota: PHK26 es un colorante lipófilo que se tomará por las células fagocíticas, tanto en la circulación y en los tejidos cuando se administra por vía intravenosa (iv). PKH26 se utilizó para el etiquetado in vivo para minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha de los macrófagos. PKH-26 tiene la ventaja de acumular de manera estable en los macrófagos alveolares durante periodos prolongados. Esperar 10 días después de la administración permite la limpieza de todas las células de la etiqueta de la circulación dejando sólo macrófagos alveolares de forma estable marcada con PKH26 8, 9. PKH26 es un fluorocromo rojo que tiene de excitación (551 nm) y emisión (567 nm) características compatiblescon los sistemas de detección de rodamina o ficoeritrina. Cualquier procedimiento de etiquetado puede introducir artefactos, incluyendo la pérdida de viabilidad. Sin embargo, puesto que utilizamos el mismo enfoque para el etiquetado de los macrófagos en diferentes genotipos de ratón (por ejemplo, WT frente a la NADPH-oxidasa deficiente), los efectos de estos artefactos serían uniforme. <ol><li> Diluir la solución madre de PKH26 (1 x 10 -3 M en etanol) 1:05 en diluyente C proporcionada por el fabricante. </li><li> De carga 100 l de PKH26 diluida en una jeringa de 1/2 ml de insulina (29 g x 1/2 &quot;) para cada ratón. </li><li> Administrar a los ratones por inyección iv (vena de la cola o bien retro-orbital) al menos 10 días antes de la cosecha. </li></ol> 2. Recolección de los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar (BAL) El número de ratones a utilizar para un experimento puede variar. Un rendimiento típico de un ratón no estimulada está en el intervalo de 3-5 x 10 5 macrófagos alveolares, sin embargo este número puede variar en gran medida based de factores tales como el tamaño del ratón, la experiencia de la persona que realiza el lavado, y el número de instilaciones de líquido de lavado y el volumen retirado de los pulmones. En este protocolo de lavado pulmonar se realiza con una cavidad torácica cerrada que junto con repetidos lavados de 1 ml ayuda a aumentar el rendimiento de células. <ol><li> La eutanasia del ratón mediante la administración de una dosis letal de anestésico Avertin (12,5 mg) por vía intraperitoneal (IP) usando condiciones asépticas para mantener la solución estéril. </li><li> Pulverizar ratón a fondo con etanol al 70%. </li><li> Retire la piel desde el extremo craneal de animales exponiendo el tórax (Figura 1A). <ol><li> Hacer un pequeño corte en la piel justo debajo del diafragma. </li><li> Inserte el dedo en el corte y tire de la piel lejos del extremo craneal del animal (Figura 1A). </li><li> Empuje ligeramente hacia arriba en la cabeza, que se extiende la parte ventral del cuello (fig. 1A). </li></ol></li><li> Corte un pequeño agujero a través de la caja torácicaen el lado derecho del tórax para desinflar los pulmones y también permitir la visualización de los pulmones durante los siguientes pasos. </li><li> Busque la tráquea, y cuidadosamente diseccionar el tejido circundante. <ol><li> Retire las glándulas salivales, los músculos esternohioideo y laringe, etc con pinzas curvas. </li><li> Levante con cuidado con unas pinzas curvas y cortar con tijeras el tejido delgado que cubre la tráquea (adventicia) que revela la estructura del cartílago anillado subyacente. </li></ol></li><li> Inserte catéter en la tráquea. <ol><li> Con unas pinzas curvas, colocar una sutura detrás (dorsal a) la tráquea y tirar de una longitud de 10 cm a través de la abertura. </li><li> Comenzando por encima del cricoides (el anillo engrosado del cartílago) guiar cuidadosamente el catéter 22 G por la tráquea parando donde la tráquea se desaparece detrás del esternón. </li><li> Firmemente atar sutura alrededor de la tráquea y el catéter para un ajuste perfecto. Retire la aguja del catéter. </li></ol></li><li> Ensamble de 4 vías llave de paso. <ol><li> Llenaruno 6 ml de jeringa con DPBS, 1% de FBS y se unen a 4 vías llave de paso tal como se indica en la Figura 1B. </li><li> Adjuntar un vacío 6 ml jeringa en la posición indicada en la 4 vías llave de paso (Figura 1B). </li><li> Conecte el puerto abierto en el 4 vías llave de paso para catéter (Figura 1B). Tenga cuidado de no desconectar el catéter de la tráquea. </li></ol></li><li> Recoger el líquido del lavado de los pulmones. Nota: Los investigadores pueden optar por usar menores volúmenes de líquido de lavado para reducir al mínimo la posibilidad de daños en el tejido. Es importante que el mismo enfoque puede aplicarse de manera coherente en todos los grupos de ratones. <ol><li> Gire la manija de la llave de paso por lo que la jeringa vacía se cierra y se inyecte lentamente ~ 1 ml de DPBS, 1% de SFB para inflar los pulmones. Observar la inflación de pulmón a través del agujero en el paso 2.4. </li><li> Tenga cuidado de no inflar demasiado los pulmones. </li><li> Gire la manija de la llave de paso para que la jeringa llena se cierra, y retirar con cuidado la gripe<html> Identificación de los pulmones. </li><li> Observar los pulmones se desinflan a través del agujero cortado en el paso 1.4. El catéter puede necesitar ser movido ligeramente hacia atrás o hacia delante para conseguir un buen sorteo. Tomar la precaución especial para mantener el catéter dentro de la tráquea. </li><li> Repetir los pasos 2.8.1-2.8.4 5-6x hasta que todo el DPBS, 1% de FBS ha sido inyectado y retirado de los pulmones. Nota: la recuperación del líquido pulmonar no será del 100% del fluido inyectado. </li></ol></li><li> Vaciar la jeringa con el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 ml. Mantener las células a temperatura ambiente. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se vierte el sobrenadante. Esto puede ser guardado para el análisis de citoquinas si se desea. </li><li> Resuspender las células en 1-5 ml de RPMI 1640 con 10% de FBS y contar en un hemocitómetro. En el ratón sin estimular,&gt; 95% de las células recogidas por BAL se espera que sean los macrófagos, que pueden ser confirmados mediante citología. </li></ol> 3. El cultivo y cosecha Hongo &quot;&gt; El Aspergillus fumigatus utilizada en este protocolo expresa GFP en todas las etapas de su ciclo de vida:. Esporas, hifas y esporofitos Esta cepa fúngica fue proporcionada por el Dr. Margo Moore, de la Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, Canadá. <ol><li> Placa de conidios de una cepa de Aspergillus fumigatus que expresan GFP en Sabouraud infusión de cerebro corazón (BHI) agar tubos inclinados con cloranfenicol (0,05 g / L) y gentamicina (0,5 g / L). </li><li> Incubar en la oscuridad taparon sin apretar durante 7 a 10 días a temperatura ambiente. </li><li> Cosecha conidios por inclinación lavado con 10 ml de 0,01% de Tween 20 en DPBS. Ligeramente raspar el hongo con el STRIPETTE para aflojar. Enjuague la inclinación varias veces para aumentar el rendimiento. </li><li> Pase suspensión de conidios a través de un filtro de células de 100 micras en una cónica 50 ml. </li><li> Pellet conidios por centrifugación a 400 xg durante 10 min. </li><li> Conidios Resuspender en 50 ml de DPBS y contar utilizando un hemocitómetro. </li><li> Lavar dos veces con DPBS y diluir a concentraciones deseadastración. </li></ol> 4. Fungal Challenge y microscopía confocal Para investigar el papel de la NADPH oxidasa de los macrófagos en la defensa del huésped, se evaluó la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratones de tres genotipos para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados. Los genotipos utilizados en este estudio incluyen; 1) ratones de tipo salvaje, 2) NCF1 * / * Mn-ratones con una mutación NCF1 de origen natural (NCF1 codifica para p47 phox, un componente necesario de la NADPH oxidasa de los fagocitos) dejándolos deficiente de NADPH oxidasa, y 3) NCF1 * / * Mn + ratones transgénicos (MN indica la transgén albergar NCF1 de tipo salvaje bajo el control del promotor de CD68 humano), donde la actividad de la NADPH oxidasa se ​​ha reconstituido en la población de monocitos / macrófagos 10, 11. La microscopía confocal es el más adecuado para este ensayo debido a la presenciay el crecimiento de los conidios no fagocitado en las diapositivas. El microscopio confocal permitirá la visualización de los planos individuales dentro del eje Z, y permitir la diferenciación entre hongo que crece alrededor en lugar de en el interior de los macrófagos. Todas las imágenes de confocal se adquieren utilizando una lente de inmersión en aceite de 63X. Z-pilas se adquieren con un factor de zoom electrónico de 2,5. El espesor de una pila Z se determina utilizando DAPI y las imágenes de campo claro para localizar la parte superior y la parte inferior del campo. Z-pilas variaron de 14 a 24 micras con rodajas individuales ~ 1 m de espesor. Para la cuantificación de los macrófagos, las exploraciones individuales de zoom electrónico 1X se realizaron en 10 campos por genotipo. Se identificaron macrófagos intacta en virtud de PKH26 y tinción DAPI de la membrana y el núcleo, respectivamente. Los conidios fueron identificados sobre la base de la expresión FITC y la imagen de campo brillante. <ol><li> Preparar cubreobjetos y placas estériles <ol><li> En virtud de una cabina de seguridad biológica, remoje 22 x 22 mm cubreobjetos de vidrio en el 70% etanol durante 5-10 min. </li><li> Enjuague cubreobjetos en PBS estéril. </li><li> Usando una pinza estéril, coloque suavemente un único portaobjetos en la parte inferior de cada pocillo de una placa de 6 pocillos estériles envasados ​​individualmente. </li></ol></li><li> Semilla ~ 1 x 10 6 cosechado PKH26 etiquetado macrófagos alveolares en suspensión en 300 l de RPMI 1640, 10% de FBS a cada cubreobjetos. El número exacto puede variar dependiendo del rendimiento de la cosecha. </li><li> Permitir que los macrófagos se adhiera mediante la incubación a 37 ° C con 5% de CO 2 durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente, añadir aproximadamente 1 x 10 7 GFP-expresando A. fumigatus conidias suspendió en 100 l pre-calentado (37 ° C) de RPMI 1640, 10% de FBS. </li><li> Placa de Regreso a 37 ° C incubadora con 5% de CO 2. </li><li> Las células deben ser fijados por un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. A los 3, 7, y 14 hr células de arreglo mediante la adición de un volumen igual de 2% de formaldehído a cada pocillo (concentración final 1% de formaldehído). Coloque las placas para elmomentos de la hora temprana a 4 ° C durante la noche. Para el punto de tiempo final (14 horas), fijar las células a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Después de la fijación, retire suavemente cubreobjetos con unas pinzas y enjuague en DPBS. </li><li> Eliminar el exceso de líquido colocando el borde del cubreobjetos sobre un Kimwipe doblado. </li><li> Aplicar medio de montaje 6 l de fluorescencia con DAPI a un portaobjetos de microscopio de vidrio. </li><li> Coloque un borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos y colocar suavemente con las células hacia abajo en el medio de montaje. Medio de montaje se extienda y formar una capa uniforme debajo del cubreobjetos. No hay necesidad de presionar sobre el cubreobjetos. </li><li> Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y dejar secar al aire. </li><li> Tienda prepara diapositivas en una caja de diapositivas (protegido de la luz) a temperatura ambiente hasta que se vaya a analizar por microscopía confocal. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de este enfoque para el análisis ex vivo de la actividad antifúngica de los macrófagos junto con in vivo de exposición fúngica, Hemos demostrado anteriormente que la NADPH oxidasa en macrófagos desempeña un papel importante en la defensa contra A. fumigatus 4. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos permite centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células inmunes (por ejemplo, los neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus...

Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran con microbios inhalados. Los macrófagos reconocen motivos Aspergillus por los receptores de reconocimiento de patógenos, ingieren y limitan el crecimiento de las esporas inhaladas (conidios), e inician la respuesta inflamatoria. La NADPH oxidasa de los fagocitos convierte oxígeno molecular para el anión superóxido y intermediarios reactivos del oxígeno aguas abajo (Rois). La enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones bacterianas y fúngicas graves y por las respuestas inflamatorias excesivas. Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 - 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. Estudios anteriores han demostrado que los macrófagos alveolares ingerir y destruir las esporas de Aspergillus, mientras que los neutrófilos se dirigen principalmente a la etapa de las hifas 5. Sin embargo, ha habido Resul en conflictoTS como para el papel de la NADPH oxidasa en macrófagos en el control del crecimiento de A. fumigatus esporas 6, 7. El objetivo de este método era para delinear el papel específico de la NADPH oxidasa en los macrófagos en la mediación de la defensa del huésped frente a A. esporas fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Para modelar más de cerca la respuesta del huésped a los hongos inhalados, utilizamos los macrófagos alveolares cosechadas por lavado broncoalveolar de los ratones estimulados inmediatamente después del sacrificio. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos ha permitido centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células del sistema inmune (por ejemplo, neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus in vivo. En este método, los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo antes de la cosecha a fin de minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha. &lt;/ P&gt; Otra ventaja de este protocolo es el uso de un GFP-expresando A. cepa fumigatus. Este hongo expresa GFP desde la etapa de conidios por la etapa de hifas y no tiene necesidad de una mayor tinción. Para obtener imágenes con mayor detalle, se optó por la microscopía confocal, que permite la reconstrucción de las estructuras tridimensionales a partir de las imágenes obtenidas. Reconstrucción tridimensional da la capacidad de diferenciar entre las hifas en crecimiento alrededor en lugar de en o a través de un macrófago. Las conidias también puede ser precisamente distingue como intracelular frente extracelular.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Utilizado para hacer AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Utilizado para hacer AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Solución salina tamponada con fosfato (sin calcio ni magnesio)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Se utiliza para fabricar tampón de lisis de glóbulos rojos ACK</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Se utiliza para fabricar tampón de lisis de glóbulos rojos ACK</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Se utiliza para fabricar tampón de lisis de glóbulos rojos ACK</td></tr><tr><td>de 22 G x 1,00 pulgadas i.v. catéter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>Jeringas</td><td></td><td></td><td></td>de insulina</tr> aladas <tr><td>Jeringas de 6 ml Llave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de paso de 4 vías</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Rosca de sutura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de centrífuga cónicos</tr><tr><td>esponjas de gasa (cuadrado de 4 pulgadas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td> Juego de manchas Hema 3 <td>inactivado por calor</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar con Cloranfenicol y Gentamicina Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous cepa que expresa proteína</td><td></td><td></td> verde fluorescente <td>proporcionada por la Dra. Margo Moore, Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, Canadá</td></tr><tr><td>100 &mu; m Filtros de células</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica Clase II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrífuga con rotor</td><td></td><td></td><td></td>de cuchara oscilante</tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>óptico Leica DM1000</tr><tr><td>Hemotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Cytospin 2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de</td><td></td><td></td> cultivos celulares <td>37 &deg; C, 5%&nbsp; CO2</td></tr><tr><td>22 x 22 mm microcubreobjetos</td> de <td>vidrio</td><td>VWR</td><td>48366-227</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield con DAPI Sistema Leica</td> TCS SP2 <td>H-1200</td><td></td>de <td>Vector Laboratories</td></tr><tr><td>con escáner de punto láser</td><td></td><td></td><td>Montado en el microscopio de fluorescencia DMIRE2</td></tr></tbody></table>

la evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

El pulmón es una interfaz donde células huésped están expuestos rutinariamente a los microbios y productos microbianos. Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran los hongos y otros microbios inhalados. Los macrófagos y otras células inmunes reconocen motivos de Aspergillus por receptores de reconocimiento de patógenos e iniciar respuestas inflamatorias aguas abajo. La oxidasa NADPH fagocítica genera intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y es fundamental para la defensa del huésped. Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 - 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. El objetivo de este estudio fue definir el papel específico de la NADPH oxidasa en macrófagos en la mediación de la defensa del huésped contra A. fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Aquí se describe un método para evaluar la capacidad de un ratónmacrófagos lveolar (AMS) para controlar el crecimiento de las esporas de Aspergillus fagocitados (conidios). Los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo y diez días después aisladas de ratones por lavado broncoalveolar (BAL). Los macrófagos se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio, y luego sembraron con la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan A. esporas fumigatus. En momentos determinados, las células se fijan y el número de macrófagos intactas con esporas fagocitados se evaluaron por microscopía confocal.

<html> Recogida de los macrófagos alveolares por BAL de ratones no estimulados se traducirá en una población&gt; 95% de pureza basado en citología. El 3 y 7 horas (Figura 2) puntos de tiempo preceden a la etapa de hifas de crecimiento de hongos y permiten una comparación de la eficiencia fagocítica de los conidios entre los genotipos. El punto de tiempo de 14 horas es donde genotipos se pueden comparar con respecto a la capacidad para inhibir la transición de conidios fagocitado a la etapa de hifas invas...

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

El objetivo general de este procedimiento es comparar la capacidad de los macrófagos para controlar el crecimiento del hongo ceto candida ex vivo. Esto se logra primero etiquetando los macrófagos alveolares in vivo con un colorante lipofílico PKH 26. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener macrófagos alveolares de los ratones inoculados mediante lavado broncoalveolar.El tercer paso consiste en cultivar y recolectar esporas fúngicas positivas para GFP. Los pasos finales son desafiar a los macrófagos con Candida positiva para GFP y células fijadas en puntos de tiempo predeterminados. En última instancia, con una manipulación celular ex vivo mínima, la microscopía confocal puede revelar la capacidad de los macrófagos alveolares para controlar el crecimiento de los fagocitados.Primero, diluya el colorante lipofílico P HK 26, de 1 a cinco en el diluyente C; el colorante será absorbido por las células ácidas de FOC. Cargue 100 microlitros del P HK 26 diluido en una jeringa de un medio cc e inyecte el colorante por vía intravenosa retroorbital o por la vena caudal.Estime que cada ratón proporcionará de tres a 500.000 macrófagos marcados después de 10 días. Sacrifique a los r

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Fuente: Barbero, A. M., et.al. Ensayos de fluorescencia para el estudio de la interacción de Mycobacterium tuberculosis con el receptor inmunitario SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Este vídeo muestra un ensayo basado en fluorescencia para estudiar la interacción entre un receptor de macrófagos y antígenos de Mycobacterium tuberculosis . Los antígenos marcados con fluorescencia en un abrigo se incuban con extractos de proteínas de macrófagos, se reticulan, se marcan con anticuerpos y se visualizan...

Ensayo basado en fluorescencia para investigar las interacciones de los receptores de macrófagos con antígenos bacterianos

Este video muestra imágenes de células vivas para el análisis de la actividad antifúngica en neutrófilos humanos utilizando conidios fluorescentes reporteros de Aspergillus. Inicialmente, tanto la fluorescencia roja como la magenta se detectan dentro de los neutrófilos, mientras que la fluorescencia roja disminuye con el tiempo, lo que indica la degradación de los conidios y confirma la actividad antifúngica de los neutrófilos.

Evaluación en tiempo real de la actividad antifúngica de las células inmunitarias humanas primarias

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Aquí, demostramos cómo citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con células huésped en cultivo. Esta técnica se puede utilizar como una alternativa a la CFU enumeración.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Aquí, se describe un protocolo para evaluar la actividad antifúngica de las células inmunes humanas primarias en tiempo real utilizando fluorescente conidias de Aspergillus reportero en conjunción con microscopía de vídeo en vivo de células y citometría de flujo. Los datos generados proporcionan la penetración en hospedantes de célula interacciones de Aspergillus tales como actividad fungicida, la fagocitosis, la migración celular y la inhibición de crecimiento de hongos.

Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em&gt; A. fumigatus</em

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Este protocolo proporciona un método rápido y fiable para medir cuantitativamente la fagocitosis de Aspergillus fumigatus conidia por los fagocitos primarios humanos utilizando citometría de flujo y para discriminar la fagocitosis de la conidia de la mera adhesión a los leucocitos.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.

Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .

Ensayo de viabilidad de conidios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana

Aprende a evaluar la actividad antifúngica de macrófagos alveolares aislados mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar el control del crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitadas en modelos murinos.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

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