Name: Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende a extraer ADN genómico de alta calidad a partir de saliva mediante lisis celular, eliminación de ARN y precipitación. Este protocolo optimizado garantiza muestras adecuadas para PCR y secuenciación de próxima generación.

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Este trabajo fue financiado por un R01 de los Institutos Nacionales de Salud (DC009453 apoyo a CWB).

NOTA: Antes de proporcionar muestras de saliva todos los sujetos dieron su consentimiento informado se ajuste a las directrices para el tratamiento de los sujetos humanos en Hospital Nacional de Niños. 1. Saliva Collection y Almacenamiento <ol><li> Antes de la toma de saliva, asegúrese de que la boca del sujeto es libre de alimentos u otras sustancias extrañas al tener el tema enjuague su boca con agua y evitando comer o beber durante 30 minutos antes de recoger la muestra. </li><li> Abrir un tubo de centrífuga de 15 ml con 2,5 ml de tampón de ADN estabilización 2 asegurándose de no tocar la parte interior de la tapa o tubo, y haga que el sujeto escupió 2,5 ml de saliva en la solución tampón. Nota: Recogida de más de 2,5 ml de saliva puede conducir a la degradación de la muestra a partir de una relación insuficiente de la muestra a un tampón de estabilización de ADN. Recopilación demasiado poco de saliva reducirá los rendimientos esperados de protocolo. Para evaluar los volúmenes de recogida, utilice los gradientes numerados en el lado de tél tubo. </li><li> Reemplace la tapa y mezclar por inversión hasta que se homogeneiza la mezcla. Agitación vigorosa no es necesario. Almacenar las muestras a temperatura ambiente para el almacenamiento a corto plazo o 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo (&gt; 3 meses). </li></ol> 2. Preparativos iniciales y lisis celular <ol><li> Antes de iniciar la extracción, calentar un baño de agua a 37 ° C, y preparar un cubo de hielo. Se necesitan tres tubos de 15 ml de centrífuga cónicos para cada muestra extraída. Los tres tubos se utilizan para mantener la célula y la proteína de pellets, la final gDNA extraídos, y los sobrenadantes isopropanol y etanol. </li><li> Recuperar las muestras de almacenamiento, e invertir las muestras varias veces luego vórtice a velocidad media durante 15 segundos. </li><li> Dispense 2.5 ml de muestra en un tubo de centrífuga de 15 ml limpio, y añadir 5 ml de solución de lisis celular. Mezclar la muestra 50 veces por inversión, e incubar a TA durante 30 min. </li></ol> Remoción 3. ARN <ol><li> Añadir 40 l de RNasa A de Solution a 100 mg / ml, y se incuba a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Sacar la muestra del baño a 37 ° C y enfriar en hielo durante 3 min. <ol><li> Después de la incubación RNasa A, aumentar la temperatura del baño de agua a 65 ° C para la etapa de rehidratación ADN del protocolo. </li></ol></li></ol> 4. Proteína y extracción de lípidos <ol><li> Añadir 50 l de solución de proteinasa K a 20 mg / ml, mezclar varias veces por inversión, y se incuba a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 min. Nota: Este es un posible punto de pausa para el protocolo. Después de la adición de la solución de proteinasa K, la muestra puede ser almacenada a 4 ° C hasta la extracción puede ser completada. El almacenamiento a 4 ° C durante un máximo de 24 horas no ha demostrado tener un efecto significativo en los rendimientos de extracción o la calidad del ADN. El almacenamiento a largo plazo en esta etapa no ha sido evaluada. </li><li> Añadir 1,7 ml de solución de Precipitación de Proteínas y agitar vigorosamente durante 20 segundos a alta velocidad, y el lugar en hielo durante 10 min. </li&gt; <li> Una vez que las muestras se han enfriado en hielo durante 10 min, se centrifuga durante 10 min a 3.000 xg y 4 ° C. Las proteínas precipitadas deben formar una bolita apretada para continuar. Si la pastilla no es apretado o la solución es aún turbia, las muestras se pueden enfriar en hielo durante 5 min más y centrifugación repetida. Las muestras deben mantenerse en hielo para asegurar una bolita apretada. </li></ol> 5. Aislamiento y purificación de ADNg <ol><li> En un tubo de centrífuga de 15 ml limpio, pipeta de 5 ml de isopropanol y 8 l de solución de glucógeno puro a 20 mg / ml. </li><li> Verter el sobrenadante que contiene el ADNg de la etapa 4.3 en el tubo que contiene la solución de isopropanol y el glucógeno, dejando atrás el sedimento de proteína precipitada. Una vez que el sobrenadante se ha añadido, mezclar suavemente la muestra 50 veces por inversión y centrifugar durante 30 minutos a 3.000 xg y 4 ° C. </li><li> Verter lentamente el sobrenadante en un tubo de 15 ml limpio. Después de la eliminación del sobrenadante, añadir 1 ml de etanol al 70% alavar el pellet oscilando lentamente y moviendo suavemente el etanol sobre el sedimento precipitado varias veces. Conservar el etanol en el tubo. </li><li> Después del lavado inicial, centrifugar la muestra durante 1 min a 2.000 xg y 20 ° C. Esta etapa de centrifugación se puede hacer en cualquiera de 4 ° C o 20 ° C. Ningún efecto significativo de la temperatura se ha demostrado para este paso. </li><li> Después del lavado y la centrifugación inicial de la pastilla, verter lentamente el lavado con etanol del tubo y desechar, a continuación, realizar un segundo lavado repitiendo los pasos 5.3 y 5.4. </li><li> Después de la eliminación del sobrenadante del segundo lavado, permitir que el pellet se seque al aire durante 15 min. <ol><li> Si la muestra no se ha secado completamente, secar al aire durante otros 15 min. </li></ol></li></ol> 6. rehidratación de gDNA <ol><li> Una vez que la muestra se ha secado, añadir 300 l de Tris-EDTA para rehidratar el sedimento gDNA seca. </li><li> Vortex la muestra durante 5 segundos a velocidad media y el lugar en un65 ° C baño de agua caliente durante 1 hora. </li><li> Retire las muestras del baño de agua y se incuban O / N a temperatura ambiente. NOTA: Todos los productos y reactivos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales, así como la Tabla 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente procedimiento es un protocolo de extracción de ADN optimizada que ha mejorado considerablemente el rendimiento de ADN de alto peso molecular en comparación con métodos estándar, sin comprometer la calidad del ADN. El paso crítico con el mayor efecto sobre el rendimiento más fue paso 5.2, que incluye una etapa de centrifugación ya durante la precipitación de etanol que cualquier protocolo publicado revisado aquí, excepto que no estaba ampliamente distribuido 11. No se detectaron cambios en la calid...

La obtención de ADN de alta calidad para los estudios genéticos humanos es esencial en el proceso de descubrimiento de genes de enfermedades. Blood, aunque requiere un procedimiento invasivo y también de ser más caro que la recolección de saliva, se ve favorecida por la creación de líneas celulares inmortalizadas como una fuente infinita de ADN, o iPSCs para estudios funcionales, y algunas veces de ADN de sangre se utiliza cuando las líneas celulares no están disponibles. Sin embargo, la obtención de la sangre requiere un flebotomista capacitado y la sangre tiene una vida media más corta que la saliva 1. ADN de la saliva es menos costoso y más fácil de obtener, ya que puede ser recogida y enviada a través del correo electrónico sin la necesidad de un flebotomista, aumentando de este modo posibles piscinas temáticas mucho más allá de la zona de influencia de los hospitales y los laboratorios 2. Estudio de inscripción puede ser mejorado cuando los sujetos tienen la opción de dar una muestra de saliva en lugar de sangre 3, 4. Las preocupaciones sobre la cantidad y calidad del ADN de la saliva pueden haber limitado su nos generalizadae pesar de numerosos estudios estudios recientes que demuestran la idoneidad de la saliva total, con un promedio de 4,3 x 10 5 células por mililitro, para pruebas de ADN a través de los métodos de hisopos bucales mayores que no obtuvieron cantidades significativas de saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mientras que existe una literatura modesta que muestra la idoneidad de ADN derivado de la saliva entera para aplicaciones de genotipificación incluyendo métodos basados ​​en microarrays 8, 9, la secuenciación de próxima generación 10, ningún estudio ha examinado (NGS). El objetivo de la optimización de este protocolo de extracción de ADN de la saliva entera era maximizar la cantidad y calidad de las aplicaciones de la genética en una manera rentable que se implementa fácilmente en laboratorios con reactivos y consumibles comunes. Extracción de ADN de la saliva requiere de varios procedimientos: 1) la recolección y almacenamiento, 2) la lisis celular, 3) tratamiento con RNasa, 4) la precipitación de proteínas, 5) la precipitación con etanol, 6) rehidratación ADN. La solución de ADN de Estabilización de Buffer, se describe2 anteriormente, las funciones adecuadamente sin alteración. No se hizo ningún intento de optimizar el tratamiento con RNasa y medidas de rehidratación de ADN. Para cada paso restante, se identificaron diversas variables que pueden afectar el rendimiento. Cada variable fue manipulado de forma individual y la mejora en el rendimiento y la calidad se evaluó estadísticamente. Para las variables que se mostraron para mejorar el rendimiento y / o calidad del ADN, se incluyeron los valores óptimos en el protocolo final.

<table><tbody><tr><td>15 ml Tubos de centrífuga</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisis celular</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Solución de precipitación de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol al 70%</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) Solución</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice analógico</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

recolección y extracción de adn de la saliva de next generation sequencing

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

La fuente preferida de ADN en la investigación genética humana es la sangre, o líneas celulares derivadas de la sangre, ya que estas fuentes producen grandes cantidades de ADN de alta calidad. Sin embargo, la extracción de ADN de la saliva puede producir ADN de alta calidad con poca o ninguna degradación/fragmentación que es adecuado para una variedad de ensayos de ADN sin el gasto de un flebotomista e incluso se puede adquirir por correo. Sin embargo, en la actualidad, no se han presentado en la literatura protocolos de recolección/extracción de ADN en saliva para la secuenciación de próxima generación. Este protocolo optimiza los parámetros de recolección/almacenamiento de saliva y extracción de ADN para que sean de calidad y cantidad suficientes para ensayos de ADN con los más altos estándares, incluido el genotipado de microarrays y la secuenciación de próxima generación.

Para determinar los parámetros óptimos para la extracción de ADN se realizó una serie de extracciones de ADN emparejados. Una sola muestra de saliva se dividió y cada porción probado con uno de dos valores posibles para una variable dada. Se realizaron al menos ocho repeticiones de cada prueba de pares (por ejemplo, una sola muestra de saliva se dividió en alícuotas para probar la extracción con y sin inicial 50 ° C de incubación). Optimización se basó en cuatro métricas estándar: rendimiento total del ADN, el ...

extracción de ADN de la saliva puede proporcionar una fuente fácilmente disponible de ADN de alto peso molecular, con poca o ninguna degradación/fragmentación. Este protocolo proporciona parámetros optimizados para la recolección/almacenamiento de saliva y la extracción de ADN para que sean de calidad y cantidad suficientes para ensayos de ADN posteriores con requisitos de alta calidad.

Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer ADN genómico de alta calidad de saliva completa. Esto se logra primero lisando las células para liberar el ADN. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar las impurezas de ARN y proteínas.El tercer paso consiste en precipitar el ADN genómico y eliminar cualquier contaminante o impureza residual. El paso final es rehidratar el ADN genómico para aplicaciones posteriores, como la PCR y la secuenciación. En última instancia, la espectrofotometría y la amplificación pueden demostrar que el ADN genómico colectivo es de alta calidad.La principal ventaja de esta técnica frente a los kits de recolección es que los costos se reducirán significativamente sin ninguna pérdida en el rendimiento. Media hora antes de recolectar la saliva, los sujetos deben enjuagarse la boca con agua y luego abstenerse de comer o beber hasta que se tome la muestra. Para obtener la muestra, pida al sujeto que escupa exactamente 2,5 mililitros de saliva en un tubo de 15 mililitros que contenga 2,5 mililitros de tampón de estabilización de ADN.No toque el interior del tubo ni el interior de la tapa. Durante este proceso, tape el tubo y homogenice la mezcla mediante inversiones, no agitándolo. Luego, almacene la muestra a temperatura ambiente a corto plazo o a cuatro grados Celsius durante hasta tres meses.Los preparativos incluyen calentar un baño de agua a 37 grados Celsius y tener listos tres tubos de 15 mililitros. Comience invirtiendo la muestra varias veces, luego vortexee a velocidad media durante 15 segundos. Transfiera 2,5 mililitros de la muestra a uno de los tubos.Agregue cinco mililitros de solución de lisis celular al alícuota y mezcle la solución de lisis en la muestra invirtiendo el tubo 50 veces. Una vez mezclada la muestra, déjela incubar durante 30 minutos. A temperatura ambiente, después de media hora, agregue 40 microlitros de ARN A a 100 miligramos por mililitro a la solución de células lisadas.Luego invierta rápidamente el tubo cinco veces. Incube la reacción de ARN a 37 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, enfríe el tubo en hielo durante tres minutos.En este momento, aumente la temperatura del baño de agua a 65 grados Celsius. A continuación, retire el tubo del hielo. Añada 50 microlitros de proteinasa K y mezcle; deje que la reacción incube a temperatura ambiente durante 30 minutos o de 16 a 24 horas a cuatro grados Celsius.Luego, agregue 1.7 mililitros de solución de precipitación de proteínas y vortexee el tubo durante 20 segundos a alta velocidad. A continuación, deje enfriar la muestra en hielo durante 10 minutos. Una vez enfriada, centrifugue una muestra durante 10 minutos a 3000 G y a cuatro grados Celsius.Si el pellet no está compacto, enfríe la muestra durante cinco minutos más y centrifugue nuevamente durante cinco minutos. Repita este proceso hasta obtener un pellet compacto. Mantenga siempre la muestra fría.Comience la aislamiento del ADN preparando un tubo limpio de 15 mililitros con cinco mililitros de isopropanol y ocho microlitros de solución de glicógeno al 20 miligramos por mililitro. Luego vierta el agente sobrenadante de la muestra centrifugada en este tubo. Descarte el precipitado y mezcle la muestra invirtiéndola 50 veces.A continuación, centrifugue la muestra a 3000 Gs y a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Vierta el sobrenadante en otro tubo limpio de 15 mililitros, dejando el precipitado. Añada un mililitro de etanol al 70 % y agite manualmente de lado durante 30 segundos.Luego, centrifugue la solución de etanol durante un minuto a 2000 Gs y a cuatro grados Celsius o a 20 grados Celsius. Deseche el sobrenadante vertiéndolo lentamente y, a continuación, agregue más etanol al precipitado. Agite suavemente la mezcla a mano y repita la centrifugación.Luego, vierta lentamente el etanol nuevamente. Durante el lavado, el precipitado puede soltarse. Si se desprende, asegúrese de que permanezca en la solución de etanol y no se adhiera a las paredes o a la tapa del tubo.No invierta el tubo durante este lavado. Después de los lavados con etanol, deje el tubo al aire durante 15 a 30 minutos. Luego, rehidrate el pellet de ADN genómico agregando primero 300 microlitros de tampón tris EDTA.Luego, vortexe una muestra a velocidad media durante cinco segundos y transfiera la muestra a un baño de agua a 65 grados Celsius durante una hora. Después de calentarla en el baño, deje que la muestra incube durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, el ADN estará listo para su uso. La electroforesis en gel de muestras de saliva y extracción de ADN muestra bandas de alto peso molecular adecuadas, sin halos que indiquen degradación del ADN. El paso de eliminación de ARN es necesario y muy eficaz.Después de la digestión de ARN, la relación entre 260 nanómetros y 280 nanómetros tiene un promedio de 1,74. Es importante destacar que el ADN es adecuado para secuenciación de alto rendimiento. Se aplicó un kit de enriquecimiento de dianas a 24 muestras que apuntaban a 2,6 megabases de ADN; se secuenciaron 12 muestras con códigos de barras por carril.Todos los 24 muestras presentaron datos de NGS de alta calidad y se pudieron identificar polimorfismos de un solo nucleótido raros. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer ADN genómico de alta calidad de saliva completa.

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Investigación

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Medicina

Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.

Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

Metagenómica se utilizó para investigar el microbioma de la alimentación del ganado ensilado. El análisis se realizó por secuenciación con escopeta. Este enfoque se utilizó para caracterizar la composición de la comunidad microbiana dentro de la alimentación del ganado.

Análisis metagenomic de ensilaje

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Aquí describimos un protocolo simple para generar perfiles de huellas dactilares de ADN mediante la amplificación del locus VNTR D1S80 de ADN de células epiteliales.

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Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

Este protocolo detalla un enfoque integral para el cultivo, la secuenciación y el ensamblaje del genoma híbrido de novo de las bacterias urinarias. Proporciona un procedimiento reproducible para la generación de secuencias completas y circulares del genoma útiles en el estudio de elementos genéticos cromosómicos y extracromosómicos que contribuyen a la colonización urinaria, la patogénesis y la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos.

Ensamblaje híbrido del genoma de novo para la generación de genomas completos de bacterias urinarias utilizando tecnologías de secuenciación de lectura corta y larga

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Aprende a extraer ADN genómico de alta calidad a partir de saliva mediante lisis celular, eliminación de ARN y precipitación. Este protocolo optimizado garantiza muestras adecuadas para PCR y secuenciación de próxima generación.

Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing

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