Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las estructuras de la piel, como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas, en su totalidad sin seccionar físicamente la muestra. Esto se logra recolectando primero piel de varias regiones del cuerpo, incluida la parte trasera, la pata trasera y la cola. El segundo paso es aplanar y limpiar las muestras de piel.

A continuación, las muestras de piel se someten a una fijación adecuada. El paso final es realizar la tinción inmunológica o histoquímica en las muestras de piel. En última instancia, las imágenes con un microscopio de disección o confocal se utilizan para visualizar la geometría de varias estructuras de la piel.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la preparación de la montura de hormonas epidérmicas, es que se puede aplicar a la piel en cualquier lugar del cuerpo y no requiere la separación de la epidermis de la dermis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la polaridad de las células plantares. Dado que la geometría bidimensional de la piel y la extraña disposición de los folículos pilosos hacen de la piel el sistema ideal para estudiar este proceso, este método no solo puede proporcionar información sobre la polaridad de las células vegetales, sino que también se puede aplicar para estudiar otros aspectos del desarrollo de la piel, como la definición de tipos de neuronas somatosensoriales basadas en la visualización directa de actos individuales en morfologías superiores.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección de la piel de algunas regiones, como los pies y la cola, es difícil de aprender, aplanarlas perfectamente y evitar las arrugas y el estiramiento excesivo. En esta demostración, se recolectará piel dorsal de P tres ratones sacrificados con isof flúor. Inhalación: use cuchillas para hacer un corte horizontal desde la base de la cola a lo largo de cada flanco, pasando por el lado dorsal de la base de cada extremidad, procediendo lateralmente a las orejas y terminando en la nariz.

Se pela suavemente la piel del tejido subyacente que va de posterior a anterior sosteniendo la piel entre los dedos enguantados para que no sea pellizcada por las pinzas. Al pelar primero la piel a nivel de las orejas, corte las orejas con unas tijeras y proceda especialmente lentamente, ya que la piel puede desgarrarse en este lugar. A partir de este punto, orienta la piel con el interior hacia arriba.

Sujete la piel a S Guard con unos 20 alfileres de insectos espaciados uniformemente alrededor de la periferia. No estire demasiado la piel. Cubra la piel con 10 a 20 mililitros de PBS usando pinzas en ángulo o curvas.

Diseccionar la grasa y el tejido conectivo asociados a la piel. Coloque horizontalmente el extremo puntiagudo de las pinzas para minimizar el riesgo de que las pinzas penetren en la piel. Extruya las burbujas de aire que hayan quedado atrapadas debajo de la piel enrollando suavemente un aplicador con punta de algodón sobre la superficie de la piel.

El siguiente paso es fijar la piel del alfiler. Si la piel se va a utilizar para la obtención de imágenes de melanina o la histoquímica de la fosfatasa alcalina, agregue 20 mililitros por plato de cigarro de 10 centímetros de formina recién preparada al 4% P-F-A-P-B-S o al 10% tamponada. Si la piel se va a utilizar para la tinción inmunológica o la visualización de una queratina transgénica, KRT 17 GFP añadir 20 mililitros por cada 10 centímetros de placa sogar de 2%P-F-A-P-B-S recién preparada girar suavemente durante la noche en una habitación fría al día siguiente, lavar en PBS durante más de 10 minutos.

El procedimiento para la histoquímica de la fosfatasa alcalina no se demostrará en este video. Para obtener imágenes de melanina, deshidrate la piel a través de una serie de etanol graduada un día para cada paso con una rotación horizontal suave a temperatura ambiente. Tres días después, elimine los tejidos conectivos residuales de la piel deshidratada con la piel en etanol 100%.

Retire los alfileres de insectos y transfiera la piel a un plato de vidrio de 10 centímetros de diámetro. Para el éxito de este procedimiento, la muestra de piel debe recogerse como una pieza intacta y aplanarse perfectamente. Coloque dos portaobjetos de microscopio de vidrio sobre la piel para aplanarla y evitar que se enrosque.

Agregue 20 mililitros de benzoilo benzoato y alcohol benzoilo o BBBA, lo que endurecerá rápidamente el tejido durante las próximas horas. Levante los portaobjetos de la piel durante unos segundos para permitir que el BBBA se lave sobre la piel. La piel del pie para el análisis del patrón del folículo piloso generalmente se disecciona de P uno a P ocho a los animales. Después de la eutanasia, corte los pies por encima de la articulación del tobillo y haga un solo corte recto a lo largo de la superficie ventral a través de las plantas de los pies.

Retire suavemente la piel del tejido subyacente procediendo en dirección proximal a distal. Corta los dedos para liberar la piel y sujeta la piel con alfileres con la superficie interior hacia arriba. El tejido conectivo en el pie es mínimo.

Piel transgénica. La piel KRT 17 GFP ya está lista para la obtención de imágenes de melanina. Fije y procese la piel como se demostró anteriormente para la piel dorsal Después de la eutanasia del animal P 21, retire el vello frotando el removedor de vello.

Aplicar gel sobre la superficie de la piel con un dedo y un pulgar enguantados y esperar 10 minutos. Lave la superficie de la piel con agua del grifo. Posteriormente, diseccione y fije la piel del pie a la protección S como se muestra anteriormente.

Fijar con 1%P-F-A-P-B-S durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar en PBS. Para preparar la piel de la cola, haga un corte circular alrededor de la base de la cola y luego una hendidura longitudinal que recorra la longitud de la cola a lo largo de su cara ventral. Pegue la piel de la cola comenzando por la punta agarrando firmemente la punta del coxis o el tejido conectivo con un par de pinzas y la piel con un segundo par de pinzas.

Fije la piel de la cola a la protección SIL para el análisis de la distribución de la melanina y la orientación del folículo piloso. Fije y procese la piel como se ha demostrado para la piel dorsal para el análisis de las glándulas sebáceas antes de la fijación. Corte la piel de la cola en una serie de segmentos de aproximadamente 0,5 a un centímetro de largo e incube los trozos de piel en PBS cinco milimolares EDTA durante la noche a 37 grados centígrados.

Para debilitar la adherencia de la dermis epidermis al día siguiente, pele suavemente la epidermis de la dermis. Sujete la interfaz de la epidermis hasta la protección S y fíjela en 4%P-F-A-P-B-S durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lavar la epidermis con PBS y teñir con aceite rojo O como se describe en el texto del protocolo.

Se utiliza un microscopio de disección para obtener imágenes de las pieles dorsales del pie o de la cola que están sumergidas en BBBA, aplanadas debajo del portaobjetos de vidrio y aún en el plato de vidrio. Este enfoque minimiza la contaminación BBBA del microscopio. Ilumine el plato desde abajo para minimizar la variación espacial en la intensidad de la luz en todo el campo de visión.

Eleve la placa de vidrio a una altura de unos 10 centímetros por encima de la superficie de trabajo estándar del microscopio de disección y coloque una placa difusora de plástico o vidrio sobre la fuente de luz. Una vez finalizadas las imágenes, vuelva a colocar la piel en etanol al 100% para almacenarla a largo plazo a 20 grados centígrados negativos. Para preparar la piel teñida con fosfatasa alcalina para la obtención de imágenes, colóquela entre dos platos de vidrio del tipo que se usa para pequeños geles de proteínas.

Teniendo cuidado de evitar introducir burbujas de aire entre las placas y la piel. Absorba con cuidado cualquier exceso de BBBA con una toalla de papel. Coloque este sándwich de placa de piel en una platina de microscopio.

Utilice iluminación de campo claro o DIC con un objetivo de 10 x y pasos Z de dos micrómetros o cinco micrómetros. Utilice una etapa XY mecanizada para capturar un montaje de imágenes XY que se unen para crear un único conjunto de datos tridimensional en escala de grises. Realice el trazado semiautomatizado de los ejes de los axones con cualquiera de los diversos paquetes de software.

Las imágenes de campo claro de monturas planas de piel se pueden utilizar para obtener imágenes de un solo árbol sensorial cutáneo que se muestra aquí con su imagen trazada. Las imágenes de campo claro también permiten la visualización de los patrones de los folículos pilosos en función de la pigmentación de la melanina. Estas imágenes muestran la piel P uno de seis ratones knockout de tipo salvaje y Frizzleled y la piel P seven de seis ratones knockout Frizzleled.

Las imágenes de microscopía óptica de las monturas planas de la piel se pueden utilizar para definir la geometría de las glándulas sebáceas y las colas. La piel visualizada con glándulas sebáceas de color rojo aceite O está desorganizada en un ratón noqueado de seis encrespados en comparación con un pie dorsal de tipo salvaje. Piel extraída de tipo salvaje y encrespada seis ratones knockout portadores de queratina KRT 17 GFP marcada con A GFP y teñida con aceite.

Red O reveló que la piel del nocaut tiene un remolino de cabello en su centro. Las imágenes confocales de los montajes planos de la piel también pueden definir la geometría de los folículos pilosos visualizados con la píldora KRT 17 GFP y anti GFP inmunoteñida y erectora. Músculos oculares visualizados con inmunotinción de actina anti smoo muscular.

Los grupos de células de Merkel se visualizan con anticitoqueratina ocho o con absorción de colorante am 1 43 y su folículo piloso central se visualiza con KRT 17 GFP En lugar de estar abierto hacia la parte anterior, el grupo de células de Merkel Frizzled six knockout forma un círculo cerrado Una vez dominado, una disección se puede realizar en aproximadamente 30 minutos si se realiza correctamente, y se pueden hacer diferentes clasificaciones en unos pocos días a una semana. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar piel de varias regiones del cuerpo y cómo pararlas para visualizar diferentes estructuras de la piel en el formato hormonal. Las imágenes de espesor completo y alta resolución de las estructuras de la piel se pueden recopilar mediante microscopía estándar de alta luz y microscopía confocal.

No olvide que trabajar con aldehído paraforme y BBBA puede ser extremadamente peligroso. La inhalación de vapores debe minimizarse manteniendo estas soluciones en recipientes tapados y se debe evitar el contacto con la piel. No permita que BBBA entre en contacto con el plástico.