Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

El objetivo general de este procedimiento es visualizar estructuras cutáneas como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas en su totalidad, sin necesidad de seccionar físicamente la muestra. Esto se logra primero recolectando piel de diversas regiones del cuerpo, incluyendo la pata trasera y la cola. El segundo paso consiste en aplanar y limpiar las muestras de piel.

A continuación, las muestras de piel se someten a una fijación adecuada. El paso final consiste en realizar tinción inmunohistoquímica o histología química sobre las muestras de piel. En última instancia, se utiliza la imagenología mediante un microscopio estereoscópico o confocal para visualizar la geometría de diversas estructuras cutáneas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la preparación de montajes hormonales epidérmicos es que puede aplicarse a la piel en cualquier ubicación del cuerpo y no requiere la separación de la epidermis de la dermis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la polaridad celular plantar. Dado que la geometría bidimensional de la piel y la disposición particular de los folículos pilosos convierten a la piel en un sistema ideal para estudiar este proceso, no solo puede este método aportar información sobre la polaridad celular en plantas, sino que también puede aplicarse para investigar otros aspectos del desarrollo cutáneo, como la definición de tipos de neuronas somatosensoriales basada en la visualización directa de actos individuales en morfologías superiores.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección de la piel de ciertas regiones, como los pies y la cola, es difícil de aprender; es importante aplanarla perfectamente y evitar arrugas y estiramientos excesivos. En esta demostración, se recogerá la piel dorsal de tres ratones sacrificados mediante isoflurano. Mediante inhalación, utilice hojas de bisturí para realizar un corte horizontal desde la base de la cola a lo largo de cada flanco, pasando por el lado dorsal de la base de cada extremidad, avanzando lateralmente hacia las orejas y terminando en la nariz.

Se retiró suavemente la piel del tejido subyacente avanzando de posterior a anterior, sosteniendo la piel entre los dedos enguantados para que no quedara pellizcada con la pinza. Al desprender la piel a la altura de las orejas, primero corte las orejas con un par de tijeras y proceda especialmente despacio, ya que la piel puede rasgarse en esta zona. A partir de este momento, coloque la piel con la cara interna hacia arriba.

Fije la piel al S Guard con aproximadamente 20 alfileres de insecto espaciados uniformemente alrededor del perímetro. No estire excesivamente la piel. Cubra la piel con 10 a 20 mililitros de PBS utilizando fórceps angulados o curvos.

Disecar la grasa asociada a la piel y el tejido conectivo. Orientar el extremo puntiagudo de la pinza en forma horizontal para minimizar el riesgo de que penetre la piel. Expulsar cualquier burbuja de aire atrapada debajo de la piel rodando suavemente un aplicador de algodón sobre la superficie de la piel.

El siguiente paso consiste en fijar la piel del espécimen. Si la piel se utilizará para imágenes de melanina o histoquímica de fosfatasa alcalina, añada 20 mililitros por placa de cigarro de 10 centímetros de PFA al 4% recién preparado en PBS o formaldehído tamponado al 10%. Si la piel se utilizará para inmunomarcación o visualización de una queratina transgénica, KRT17 GFP, añada 20 mililitros por placa de cigarro de 10 centímetros de PFA al 2% recién preparado en PBS y rote suavemente durante la noche en una cámara fría; al día siguiente, lave con PBS durante más de 10 minutos.

El procedimiento de histoquímica de fosfatasa alcalina no se demostrará en este video. Para la obtención de imágenes de melanina, deshidrate la piel mediante una serie graduada de etanol, un día por cada paso, con rotación horizontal suave a temperatura ambiente. Tres días después, elimine los tejidos conectivos residuales de la piel deshidratada con la piel en etanol al 100 %.

Retire los alfileres entomológicos y transfiera la piel a un recipiente de vidrio de 10 centímetros de diámetro. Para el éxito de este procedimiento, la muestra de piel debe recolectarse como una pieza intacta y aplanarse perfectamente. Coloque dos portaobjetos de vidrio sobre la piel para aplanarla y evitar que se enrolle.

Añada 20 mililitros de benzoato de bencilo y alcohol bencílico o BBBA, que endurecerá rápidamente el tejido durante las próximas horas. Levante las láminas de la piel durante unos segundos para permitir que el BBBA fluya sobre la piel. La piel del pie para el análisis del patrón de los folículos pilosos se diseca típicamente desde P1 hasta P8 de los animales. Después de la eutanasia, corte las patas por encima de la articulación del tobillo y realice un único corte recto a lo largo de la superficie ventral a través de las plantas de los pies.

Retire suavemente la piel del tejido subyacente avanzando en dirección proximal a distal. Corte los dedos para liberar la piel y sujétela sobre una superficie con la cara interna hacia arriba. Existe un tejido conectivo mínimo en el pie.

Transgénico de piel. La piel KRT 17 GFP ya está lista para la obtención de imágenes para la visualización de melanina. Fije y procese la piel como se demostró anteriormente para la piel dorsal. Tras la eutanasia del animal P21, elimine el pelo frotando con un removedor de vello.

Aplicar el gel sobre la superficie de la piel con el dedo índice y el pulgar enguantados y esperar 10 minutos. Lavar la superficie de la piel con agua del grifo. Posteriormente, diseccionar y fijar la piel del pie al soporte S como se mostró anteriormente.

Fije con PFA-PBS al 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lave con PBS. Para preparar la piel de la cola, realice un corte circular alrededor de la base de la cola y luego un corte longitudinal que recorra toda la longitud de la cola a lo largo de su cara ventral. Retire la piel de la cola comenzando desde la punta, agarrando firmemente la punta del hueso de la cola y/o el tejido conectivo con un par de pinzas y la piel con un segundo par de pinzas.

Fije la piel de la cola al soporte de SIL para el análisis de la distribución de melanina y la orientación del folículo piloso. Fije y procese la piel tal como se demostró para la piel dorsal para el análisis de las glándulas sebáceas antes de la fijación. Corte la piel de la cola en una serie de segmentos de aproximadamente 0,5 a un centímetro de longitud e incube los trozos de piel en PBS con EDTA 5 mM durante la noche a 37 grados Celsius.

Para debilitar la adhesión entre la dermis y la epidermis al día siguiente, desprenda suavemente la epidermis de la dermis. Fije la interfaz de la epidermis hacia arriba sobre S guard y trate con PFA al 4 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, lave la epidermis con PBS y tiña con rojo de aceite O según se describe en el texto del protocolo.

Se utiliza un microscopio estereoscópico para obtener imágenes de la piel del dorso del pie o de la cola que están sumergidas en BBBA, aplanadas bajo la lámina de vidrio y aún dentro del recipiente de vidrio. Este enfoque minimiza la contaminación del microscopio con BBBA. Ilumine el recipiente desde abajo para minimizar la variación espacial en la intensidad de la luz a través del campo de visión.

Eleve el recipiente de vidrio a una altura de aproximadamente 10 centímetros por encima de la superficie de trabajo estándar del microscopio estereoscópico y coloque una placa difusora de plástico o vidrio sobre la fuente de luz. Cuando finalice la obtención de imágenes, devuelva la piel al etanol al 100 % para su almacenamiento a largo plazo a menos 20 grados Celsius. Para preparar la piel teñida con fosfatasa alcalina para la obtención de imágenes, colóquela entre dos placas de vidrio del tipo utilizado para geles pequeños de proteínas.

Teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire entre las placas y la piel. Retire cuidadosamente cualquier exceso de BBBA con una toalla de papel. Coloque este sándwich de placa-piel-placa sobre la platina de un microscopio.

Utilice iluminación en campo claro o DIC con un objetivo de 10x y pasos Z de dos micrómetros o cinco micrómetros. Use una platina XY mecanizada para capturar un mosaico de imágenes XY que se unen para crear un conjunto de datos tridimensional en escala de grises. Realice el trazado semiautomático de arborizaciones axónicas con cualquiera de varios paquetes de software.

La imagen en campo claro de montajes planos de piel puede utilizarse para visualizar un solo arbor sensorial cutáneo, mostrado aquí con su imagen trazada. La imagen en campo claro también permite la visualización de los patrones de folículos pilosos en función de la pigmentación por melanina. Estas imágenes muestran piel de P uno de ratones tipo salvaje y de ratones con nulificación del gen frizzled seis, y piel de P siete de ratones con nulificación del gen Frizzled seis.

La imagen obtenida mediante microscopía óptica de preparaciones planas de piel puede utilizarse para definir la geometría de las glándulas sebáceas y los folículos pilosos. La piel teñida con rojo de aceite muestra que las glándulas sebáceas están desorganizadas en un ratón con nulificación del gen frizzled seis en comparación con un pie dorsal de tipo silvestre. La piel se obtuvo de ratones de tipo silvestre y de ratones con nulificación del gen frizzled seis que portaban una queratina KRT17-GFP marcada con GFP y se tiñó con rojo de aceite.

Red O reveló que la piel con el gen eliminado presenta un remolino capilar en su centro. La imagen confocal de preparaciones planas de piel también puede definir la geometría de los folículos pilosos visualizados con KRT 17 GFP y tinción inmuno fluorescente anti-GFP y músculo erector del pelo. Los músculos oculares visualizados con tinción inmuno fluorescente anti-actina de músculo liso.

Los grupos de células de Merkel se visualizan con anticuerpo anti-citokeratina 8 o mediante la absorción del colorante AM 1-43, y su folículo piloso central se visualiza con KRT 17 GFP. En lugar de estar abiertos hacia la parte anterior, los grupos de células de Merkel en el knockout de Frizzled seis forman un círculo cerrado. Una vez dominado, un procedimiento de disección puede realizarse en aproximadamente 30 minutos si se lleva a cabo correctamente, y pueden realizarse diferentes preparaciones en unos pocos días hasta una semana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar piel de diversas regiones del cuerpo y cómo prepararlas para visualizar diferentes estructuras cutáneas en el formato de hormona. Imágenes completas de espesor y alta resolución de estructuras dérmicas pueden obtenerse mediante microscopía óptica convencional y microscopía confocal.

No olvide que trabajar con paraformaldehído y BBBA puede ser extremadamente peligroso. Debe minimizarse la inhalación de vapores manteniendo estas soluciones en recipientes tapados y debe evitarse el contacto con la piel. No permita que el BBBA entre en contacto con plástico.