Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo generar un cultivo primario de neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de ratones embrionarios. Esto se logra recolectando primero embriones de ratón E 13.5. El segundo paso es diseccionar los cerebros embrionarios de ratón y aislar el mesencéfalo.

A continuación, se aplica una disociación enzimática y una disociación mecánica al mesencéfalo recogido. El paso final es la colocación de placas en las células neuronales disociadas. En última instancia, la tinción inmunofluorescente se utiliza para mostrar la presencia de neuronas dopaminérgicas en el cultivo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos neurológicos y psiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad y la enfermedad de Parkinson. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección y disociación celular son difíciles de aprender porque se requiere un gesto preciso y una identificación anatómica de la estructura, la demostración del procedimiento se le dará a un ingeniero de mi grupo para comenzar este procedimiento. Después de sacrificar una rata embarazada E 13.5, limpie su abdomen con etanol al 70%.

A continuación, abra la pared del abdomen y recoja los cuernos uterinos. Diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos y extraer las membranas amnióticas. A continuación, transfiera los embriones a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga P-B-S-G-A-B estéril.

Lavarlos transfiriéndolos en tres baños sucesivos idénticos. Después de eso, transfiera los embriones a una placa de Petri estéril de 60 milímetros para su disección. Coloque la placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico.

A continuación, extirpa el cerebro con unas tijeras Vanna. Retire y deseche con cuidado las cuatro regiones del cerebro y la parte posterior del cerebro. Haga un corte cerca de la región talámica en el lado rostral, y otro corte en la región del ssus en el lado mimoso.

A continuación, retire el colo superior. Una vez aislado el mesencéfalo ventral, se retiran cuidadosamente las meninges con pinzas ultrafinas, se recogen los segmentos disecados sin las meninges en un tubo estéril de 13 mililitros lleno de P-B-S-G-A-B. Limpie a fondo el tubo que contiene el mesencéfalo con etanol al 70%.

Luego colóquelo debajo del capó en este paso. Lave el mesencéfalo tres veces con P-B-S-G-A-B estéril. Permita que los fragmentos de cerebro se asienten entre cada lavado y evite alterar el tejido después del último lavado.

Retire con cuidado la mayor cantidad de solución posible e incube los segmentos cerebrales en tres mililitros de tripsina EDTA durante 15 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Mientras tanto, pulir al fuego las pipetas para maximizar la supervivencia de las neuronas, ya que el extremo de una pipeta de vidrio no pulido es afilado y puede dañar ligeramente las células durante los pasos de disociación. Reduzca el diámetro de la extremidad de la pipeta de PE mientras la pule al fuego.

Ahora retire con cuidado la mayor cantidad posible de solución de tripsina EDTA. Luego agregue 10 mililitros de medio de cultivo, 10% IFBS, y lave los segmentos del cerebro tres veces con él. Usando la pipeta de PEs pulida al fuego, comience la disociación del mesencéfalo en seis mililitros de cultivo.

Medio, 10%IFBS trier califica 10 veces y trata de evitar las burbujas de aire. Luego, deje que los trozos se asienten después. Recoja el medio en un nuevo tubo estéril de 13 mililitros.

Agregue seis mililitros de cultivo, medio y tri tasa 10 veces más. Deje que los trozos se asienten y recojan el medio que contiene las células disociadas en el mismo tubo de 13 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 160 Gs durante cinco minutos.

Después de eso, deseche el sobrenadante y resus. Suspender las células en un medio de cultivo suplementado con hormona al 10%. Mezcle las células de recuento en suspensión en una celda de masa y ajuste el volumen del medio a una concentración de 600, 000 células por mililitro.

En general, se pueden obtener alrededor de 1.700.000 células de un mesencéfalo de ratón. Ahora retire el medio de recubrimiento que contiene FBS de una placa de 24 pocillos. Agregue un mililitro de suspensión celular a cada uno.

Pues bien, entonces incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono 95% de aire, las neuronas dopaminérgicas maduran después de unos cinco a siete días in vitro y las células se pueden mantener en cultivo hasta 15 días sin medio de reemplazo. El día antes de la disección, agregue 10 mililitros de HCL molar en una placa de Petri. Coloque de 12 a 15 cubreobjetos de vidrio sobre la superficie líquida y espere 15 minutos.

A continuación, presione la tapa y se deslice en el líquido y espere otros 15 minutos. A continuación, retire el HCL y lave la cubierta Slips tres veces con agua, seguido de un lavado rápido con etanol puro. Luego agregue etanol puro al plato y espere 30 minutos bajo el capó.

Retire los cubreobjetos limpios del etanol. Posteriormente, transfiera los cubreobjetos a una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Lave los cubreobjetos dos veces con agua estéril y, a continuación, lávelos una vez con PBS estéril.

Luego retire el PBS y agregue dos XPLO a 500 microlitros por pocillo, incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados en la incubadora de dióxido de carbono después de cuatro horas. Retire la solución de PLO y lave tres veces con PBS estéril. Después de eso, retire el PBS y agregue 500 microlitros de laminina 20% IFBS a un microgramo por mililitro a cada pocillo incubado durante la noche a 30 grados centígrados en la incubadora de dióxido de carbono.

Para inmunofluorescencia. Retire el medio de recubrimiento de la placa de 12 pocillos. Agregue dos mililitros de células a 900, 000 células por pocillo y hágalas crecer en la incubadora a 37 grados centígrados.

Las células se pueden mantener en cultivo hasta 15 días sin reemplazo del medio. Mostrado. Aquí están las imágenes de contraste de fase de la cultura en diferentes etapas de desarrollo. Esta figura muestra la tinción de tirosina hidroxilasa de las neuronas dopaminérgicas en DIV, se detectaron ocho neuronas D utilizando anticuerpos anti TH.

El número de neuronas TH positivas en el cultivo de mesencéfalo es una función de la edad del cultivo. Aquí están las neuronas y astrocitos representativos en el cultivo. En la DIV cuatro, las neuronas dopaminérgicas se detectaron utilizando anticuerpos anti DAT o anti TH y las neuronas GABAérgicas.

Las neuronas serotoninérgicas y los astrocitos se detectaron utilizando anticuerpos anti GAD 67, anti serotonina y anti GFAP, respectivamente. Las células neuronales se tiñeron con un anticuerpo anti mapa dos. Aquí está la tinción representativa de varias poblaciones celulares del cultivo de mesencéfalo.

Se detectó una neurona dopaminérgica mediante tinción DAT en DIV nine y estas neuronas GABAérgicas se visualizaron mediante tinción GAD 67 en DIV nine. La neurona serotoninérgica se tiñó con un anticuerpo antiserotonina en DI nueve. Las neuronas fueron identificadas por mapa a tinción después de su desarrollo a principios de los años ochenta.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran el desarrollo de células dopaminérgicas en cultivo primario y se puede emplear para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a los estados fisiológicos y patológicos de las neuronas dopaminérgicas. La falta de un video que presente la delicada disección puede haber frenado a los investigadores a desarrollar este modelo de cultivo de ratones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar con precisión el cerebro funcional del cerebro de ratón embrionario y realizar pasos de disociación específicos para obtener un buen cultivo primario de dopaminérgicos de ratón.