Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar a nivel ultraestructural los compartimentos endosomales de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esto se logra preparando levaduras en esferoplastos, que luego realizan la captación endocítica de partículas de oro nanométrico con carga positiva. Como segundo paso, la muestra se fija y secciona para obtener cortes criogénicos ultradelgados de las células.

A continuación, los cortes criogénicos se someten a la reacción de amplificación con plata. Con el fin de aumentar y visualizar las partículas de oro nano cargadas positivamente que han sido endocitadas, se obtienen resultados que muestran la morfología de los diferentes compartimentos endosomales de levadura basándose en la marcación específica de este procedimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la marcación con inmunooro en cortes, es que no depende de anticuerpos que a menudo no funcionan en preparaciones para microscopía electrónica.

Aunque este método puede ofrecernos información sobre el sistema lisosomal de la levadura sarchi ESIS vei, también puede aplicarse a otros modelos eucariotas, como otras levaduras y células de mamífero. Las levaduras a partir de las cuales se preparará el Esferoplasto se incuban primero durante la noche a 30 grados Celsius en 10 mililitros del medio adecuado, según lo determine el diseño del experimento para el día siguiente. Después de medir la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros, diluya las células en el mismo medio de cultivo hasta una DO 600 de 0,2 a 0,4.

Cultive las células hasta la fase de crecimiento exponencial con una DO 600 de uno a dos, transfiera 10 equivalentes de DO 600 de células a un tubo de 50 mililitros y centrifugue a 2100 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en cinco mililitros de pipes 100 milimolares y ditiotreitol 10 milimolares a pH 7,3. Incube a 30 grados Celsius durante 10 minutos. Recopile las células mediante centrifugación.

Después de desechar el sobrenadante Resus, suspenda las células en cinco mililitros de medio que contenga un molar de sorbitol y cinco miligramos de enzima lítica. Incube la mezcla a 30 grados Celsius con agitación suave durante 30 minutos. Centrifugue la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos para recoger una fracción de pellet que corresponde a las esferoplasmas.

Deseche el sobrenadante y re suspenda los esferoplastos en 960 microlitros de medio frío que contenga sorbitol uno molar. Transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros frío. Para comenzar el procedimiento de absorción de nano oro, use una pipeta y mezcle suavemente los esferoplastos con cuatro de partículas de nano oro cargadas positivamente.

Resuspender en 40 microlitros de agua. El volumen final de la mezcla debe ser un mililitro. Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 minutos.

Transfiera la suspensión a temperatura ambiente e incube durante el tiempo necesario para permitir la internalización de oro nano mediante endocitosis. Cuando se complete la absorción deseada de oro nano, detenga la reacción agregando un mililitro de fijador de doble concentración que contenga sorbitol uno molar a la suspensión celular. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Invierta suavemente el tubo de microcentrífuga manualmente varias veces durante los 30 minutos para mantener la suspensión y el plasto de PHE. A continuación, centrifugue dos veces a 1700 G durante 25 segundos, deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de fijador fresco de concentración estándar que contenga sorbitol uno molar. Incube durante dos horas a temperatura ambiente en una rueda giratoria lenta. Posteriormente, las células se procesan y secciones criogénicas según lo descrito en el protocolo de texto. Antes de comenzar este procedimiento, retire el kit de realce de plata del congelador y deshiélelo en un incubador a 37 grados Celsius. Coloque el kit descongelado en un incubador de banco a 24 grados Celsius previamente colocado en la sala oscura hasta su uso.

Coloque una placa calefactora en una habitación oscura y caliéntela hasta una temperatura final de 24 grados Celsius. Cubra la parte superior de la placa calefactora con una superficie de recubrimiento para banco, colocando el protector con el lado brillante hacia arriba, y sujételo con cinta adhesiva. Coloque una película de parafina sobre el protector de superficie y marque los bordes con un rotulador negro para permitir la visualización en la oscuridad.

Colete un termómetro en la parte superior del protector de superficie. Para monitorear la temperatura de la placa calefactora, ajuste gradualmente la temperatura. Si no es de 24 grados Celsius, coloque un tubo de 50 mililitros que contenga agua doblemente destilada.

Dentro del incubador, llene una pequeña placa de Petri con agua doblemente destilada, previamente calentada a 37 grados Celsius. Coloque dos rejillas de níquel con las secciones criogénicas en el agua, con el lado del espécimen hacia abajo, durante 30 minutos. Después de 30 minutos, llene una segunda placa de Petri con agua doblemente destilada previamente calentada y coloque las mismas dos rejillas de níquel en el agua durante otros 30 minutos.

Lave nuevamente las rejillas pasándolas, con el lado del espécimen hacia abajo, sobre varias gotas de agua doblemente destilada a 24 grados Celsius colocadas sobre el parafina fijada en la placa calefactora. Asegúrese de que otras nueve gotas adicionales de agua doblemente destilada estén preparadas sobre la parafina para el lavado posterior a la reacción de realce con plata. En este punto del procedimiento, todas las luces de la habitación oscura deben apagarse y debe encenderse la luz roja.

Sin embargo, únicamente con fines de filmación, la luz permanecerá encendida. En esta demostración, retire las soluciones a y B del kit de amplificación de plata del incubador a 24 grados Celsius en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros: seis gotas de la solución A, seguidas de seis gotas de la solución B, y mezcle bien con una pipeta de vidrio Pasteur, evitando la formación de burbujas. Agite la solución en vórtex.

Devuelva brevemente las soluciones a y B al incubador a 24 grados Celsius y retire la solución C. Añada seis gotas de la solución C a la mezcla AB. Vuelva a mezclar con una pipeta Pasteur seguido de vortex, y evite formar burbujas.

Utilice esta mezcla final inmediatamente. Coloque gotas sobre el portaobjetos con un par de pinzas limpias y antimagnéticas. Coloque las rejillas sobre la mezcla.

Esta es la reacción de realce con plata. Deje las rejillas durante seis a quince minutos, dependiendo del grado de realce deseado para el experimento. Retire las rejillas de la mezcla y páselas rápidamente a través de una serie de seis gotas de agua doblemente destilada colocadas sobre Perfil a 24 grados Celsius durante los tres últimos lavados.

Deje las rejillas durante siete minutos por cada gota de agua. Si realiza un experimento real, encienda nuevamente las luces cuando termine el lavado. Posteriormente, los resultados se visualizan mediante marcado con ImmunoGold o tinción de membrana para una investigación en microscopía electrónica.

Se pueden marcar diferentes tipos de compartimentos endosomales de levadura con nano oro aumentado con plata y visualizar mediante microscopía electrónica. Una incorporación de cinco minutos de nano oro marca la membrana plasmática y los compartimentos endosomales tempranos, como vesículas individuales, que posiblemente sean vesículas endocíticas, y estructuras tubulares, que muy probablemente sean endosomas tempranos. Una incubación de 30 minutos con nano oro conduce a la marcación de endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares.

La potencia de resolución al combinar un procedimiento de microscopía electrónica inmunológica con este protocolo de realce con plata de oro nano queda evidenciada por la conservación y calidad de la morfología de los orgánulos mostrados, en particular, las vesículas internas de los cuerpos multivesiculares. Antes de utilizar el método de realce con plata, es necesario realizar un experimento piloto para determinar los tiempos óptimos de incubación necesarios tanto para el tamaño como para la uniformidad de estas partículas de plata. Siga este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la marcación inmunológica para responder preguntas como la localización de una proteína particular en un compartimento marino específico.