Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar a nivel ultra estructural los compartimentos endosomales de la levadura Saccharomyces cei. Esto se logra mediante la preparación de levadura Sphera plast, que luego se somete a la absorción endocítica de partículas de nano oro cargadas positivamente. Como segundo paso, la muestra se fija y se secciona para obtener secciones criogénicas ultrafinas de las células.

A continuación, las secciones criogénicas se someten a la reacción de mejora de la plata. Con el fin de ampliar y visualizar las partículas de nano oro cargadas positivamente por endocitos, se obtienen resultados que muestran la morfología de los diferentes compartimentos endosomales de la levadura en base al marcaje específico de este procedimiento. La principal ventaja de esta técnica de nuestros métodos existentes, como el marcaje de sección ImmunoGold, es que no se basa en anticuerpos que a menudo no funcionan en la preparación de electromicroscopía.

Aunque este método puede mostrarnos información sobre el sistema lisosomal de la levadura sarchí ESIS vei, también se puede aplicar a otros modelos eucariotas como otras levaduras y células de mamíferos. La levadura a partir de la cual se preparará el Sphero Plast se incuba primero durante la noche a 30 grados centígrados en 10 mililitros del medio apropiado, según lo determine el diseño del experimento al día siguiente. Después de medir la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros, diluya las células en el mismo medio de cultivo hasta un OD 600 de 0,2 a 0,4.

Hacer crecer las células hasta una fase de crecimiento exponencial con un OD 600 de una a dos transferencias, 10 D 600 equivalentes de células a un tubo de 50 mililitros y centrifugar a 2100 Gs durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de tubos de 100 milimolares y 10 milimolares dihi tres en Hall incubar a 30 grados centígrados durante 10 minutos. Recoger las células por centrifugación.

Después de desechar el sobrenadante Resus, suspenda las células en cinco mililitros de medio que contenga un molar de sorbitol y cinco miligramos de enzima lítica. Incubar la mezcla a 30 grados centígrados agitando suavemente durante 30 minutos. Centrifugar la suspensión de la célula a 300 Gs durante cinco minutos para recoger una fracción de pellets que corresponda a las placas de Sphero.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las salpicaduras en 960 microlitros de hielo en medio frío que contenga un molar de sorbitol. Transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros helado. Para comenzar el procedimiento de absorción de nano oro, use una pipeta y mezcle suavemente el Sphero plast con cuatro de partículas de nano oro cargadas positivamente.

Resus suspendido en 40 microlitros de agua. El volumen final de la mezcla debe ser de un mililitro. Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 minutos.

Transfiera la suspensión a temperatura ambiente e incube durante el tiempo requerido para permitir la internalización del nano oro por endocitosis. Cuando se complete la absorción deseada de nano oro, detenga la reacción agregando un mililitro de fijador de doble fuerza que contenga un molar de sorbitol a la suspensión celular. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Invierta suavemente el tubo de microcentrífuga manualmente varias veces durante los 30 minutos para mantener el PHE plast y la suspensión Next centrífuga dos veces a 1700 Gs durante 25 segundos, deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de fijador fresco de fuerza estándar que contenga una incubación de sorbitol molar durante dos horas a temperatura ambiente en una rueda que gire lentamente. Posteriormente, las células se procesan y se seccionan criogénicamente como se describe en el protocolo de texto antes de comenzar este procedimiento, se retira el kit de mejora de plata del congelador y se descongela en una incubadora a 37 grados centígrados. Coloque el kit de descongelación en una incubadora de banco a 24 grados centígrados previamente colocada en la habitación oscura hasta su uso.

Coloque una placa calefactora en una habitación oscura y caliéntela hasta una temperatura final de 24 grados centígrados. Cubra la parte superior de la placa calefactora con una superficie de capa de banco, con el protector hacia arriba y asegúrela con cinta adhesiva. Coloque la película para en el protector de superficie y marque los bordes con un marcador negro para permitir la visualización en la oscuridad.

Pega un termómetro en la parte superior del protector de superficies. Para controlar la temperatura de la placa calefactora, ajuste gradualmente la temperatura. Si no está a 24 grados centígrados, coloque un tubo de 50 mililitros que contenga agua destilada doble.

Dentro de la incubadora, llene una pequeña placa de Petri con agua destilada doble, pre-advertida a 37 grados centígrados. Coloque dos rejillas de níquel con las secciones criogénicas en la muestra de agua con el lado hacia abajo durante 30 minutos. Después de 30 minutos, llene una segunda placa de Petri con agua doble destilada precalentada y coloque las mismas dos rejillas de níquel en el agua durante otros 30 minutos.

Enjuague nuevamente las rejillas pasándolas con la muestra hacia abajo sobre varias gotas de agua bidestilada a 24 grados centígrados colocadas sobre el perfume que se ha fijado en la placa calefactora. Asegúrese de que nueve gotas de agua destiladas dobles adicionales estén listas en el perfume para el enjuague después de la reacción de mejora de la plata. En este punto del procedimiento, se deben apagar todas las luces de la habitación oscura y encender la luz roja.

Sin embargo, solo para fines de filmación, la luz permanecerá encendida. En esta demostración, saque las soluciones A y B del kit de mejora de plata de la incubadora a 24 grados Celsius en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con seis gotas de la solución A, seguidas de seis gotas de la solución B y mezcle bien con una pipeta de vidrio pasti evitando la formación de burbujas. Vortex, la solución.

Regrese brevemente las soluciones A y B a la incubadora a 24 grados Celsius y saque la solución C. Agregue seis gotas de la solución C a la mezcla AB. Mezcle de nuevo con una pipeta más pastosa seguida de vórtice y evite hacer burbujas.

Utilice esta mezcla final inmediatamente. Coloque las gotas en la forma con un par de pinzas antimagnéticas limpias. Coloca las rejillas sobre la mezcla.

Esta es la reacción de mejora de la plata. Deje las cuadrículas durante seis a 15 minutos, dependiendo de la mejora deseada para el experimento. Retire las rejillas de la mezcla y páselas rápidamente por una sucesión de seis gotas de agua bidestilada colocadas sobre Perfil a 24 grados centígrados durante los últimos tres lavados.

Deje las rejillas durante siete minutos por gota de agua. Si vas a realizar un experimento real, vuelve a encender las luces cuando termines de lavarlas. Posteriormente, los resultados se visualizan mediante el marcaje de ImmunoGold o la tinción de membrana para una investigación de EM.

Diferentes tipos de compartimentos endosomales de levadura pueden marcarse con plata, nano oro, y visualizarse mediante microscopía electrónica. Una absorción de cinco minutos de nano oro marca la membrana plasmática y los compartimentos endosomales tempranos, como vesículas individuales, que posiblemente son vesículas endocíticas y estructuras tubulares, que muy probablemente sean endosomas tempranos. Una incubación de 30 minutos con nano oro conduce al marcaje de endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares.

El poder de resolución de la combinación de un procedimiento de microscopía electrónica inmunológica con este protocolo de mejora de nano oro y plata se subraya por la preservación y la calidad de la morfología de los orgánulos mostrados, en particular, las vesículas internas de los cuerpos multivesiculares. Antes de utilizar el método de mejora de plata, es necesario realizar un experimento piloto para determinar los tiempos óptimos de incubación necesarios tanto para el tamaño como para la uniformidad de estas partículas de plata. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como el etiquetado inmunológico, para responder a preguntas como la localización de una proteína particular a una específica debajo del compartimento mar.