Name: Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a visualizar compartimentos endosomales en levadura Saccharomyces cerevisiae mediante nanogold cargado positivamente y microscopía electrónica. Este protocolo supera las limitaciones de los métodos basados en anticuerpos.

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Los autores agradecen a René Scriwanek para la asistencia en la preparación de la figura. FR es apoyada por ECHO (700.59.003), Programa ALW abierta (821.02.017 y 822.02.014), la cooperación DFG-NWO (DN82-303) y ZonMW VICI (016.130.606) subvenciones.

1. Preparación Esferoplasto <ol><li> Incubar la levadura durante la noche a 30 ° C en 10 ml del medio apropiado determinado por el diseño del experimento. </li><li> El día después, medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) usando un fotómetro, Diluir las células en el mismo medio de cultivo hasta una DO 600 de 0,2-0,4 y crecer a una fase de crecimiento exponencial a menos que el diseño de la experimento requiere una condición diferente. Las células se encuentran en la fase exponencial cuando la cultura tiene un OD 600 de 1-2. </li><li> Recoger 10 OD 600 equivalentes de células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min en un tubo de 50 ml. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 5 ml de tubos de 100 mM (pH 9,6), ditiotreitol 10 mM y se incubaron a 30 ° C durante 10 min. </li><li> Recoger de nuevo las células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células in 5 ml de medio (determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y 5 mg de enzima lítica, e incubar la mezcla a 30 ° C con agitación suave durante 30 min. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min para recoger la fracción de sedimento, que se corresponde con los esferoplastos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender los esferoplastos en 960 l de hielo frío medios (medio determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y transferir la mezcla en un frío de hielo 2 ml tubo de microcentrífuga. </li></ol> 2. Nanogold captación <ol><li> Con una pipeta, mezclar suavemente el esferoplasto con 4 nmol de partículas con carga positiva Nanogold resuspendieron en 40 l de agua. El volumen final de la mezcla tiene que ser de 1 ml. </li><li> Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 min. </li><li> Transferir la suspensión a temperatura ambiente y se incuba durante el tiempo necesario para permitir la internalización nanogold por correondocytosis. NOTA: A la recaptación de 5 min dirigirá principalmente al etiquetado de vesículas endocítica y endosomal compartimentos tempranos, mientras que la absorción de 15 minutos permitirá a marcar todo el sistema endosomal (a principios y finales de endosomes). Tiempos de incubación más largos (más de 30 min) también permitirá etiquetar la vacuola. NOTA: los experimentos de pulso-caza de etiquetado no se pueden realizar con este método. Por lo tanto, cuando el etiquetado para el análisis de LE, nanogold también puede encontrar en el PM y el INEE. </li></ol> 3. La fijación y seccionamiento <ol><li> Detener la absorción nanogold mediante la adición de 1 ml de fijador doble fuerza [4% de paraformaldehído (PFA), 0,4% de glutaraldehído (GA) en tampón PHEM 0,1 M (TUBOS 20 mM, HEPES 50 mM, pH 6,9, 20 mM de EGTA, 4 mM de MgCl 2)] que contiene 1 M de sorbitol a la suspensión celular. Se mantuvo el tubo a temperatura ambiente. </li><li> Invertir suavemente manualmente los tubos micocentrifuge varias veces durante 30 min (esto permitirá mantener los esferoplastos ensuspensión) y centrifugar dos veces a 1.700 xg durante 25 s. </li><li> Reemplazar el fijador descartando el sobrenadante y mediante la adición de 1 ml de fijador estándar de la fuerza fresco (2% de PFA, 0.2% GA en tampón PHEM 0,1 M) que contiene 1 M de sorbitol y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente en una rueda que gira lentamente. </li><li> Procesar las células para la crio-seccionamiento como se describe anteriormente 6. NOTA: Para los procedimientos de mejora de captación nanogold y plata, no tiene que realizarse el tratamiento con ácido periódico describe en el protocolo indicado. El tratamiento con ácido periódico es mejor para permeabilizar la pared de la célula 26, pero esta estructura ha sido eliminado durante la generación de esferoplastos. </li><li> Cortar 50 cryosections delgadas nm a -120 ° C con un cuchillo de diamante en seco utilizando un ultramicrotomo UCT como se describió previamente 8 y colocarlos en carbono Formvar recubierto 50 mallas de rejillas de níquel. </li></ol> 4. Silver Enhancement para Nanogold partículas Visualización NOTA: El procedimiento para preparar las mezclas de reacción es, básicamente, la indicada por el fabricante. Adaptaciones prácticas que utilizan este protocolo, hace que el procedimiento de mejora de la plata eficaz y fiable sobre cryosections. <ol><li> Retire el kit de mejora de la plata del congelador y descongele en un 37 ° C incubadora o baño de agua. Cuando descongelado, coloque el kit en una incubadora de 24 ° C se coloca en un cuarto oscuro hasta su uso (ver 4.7). </li><li> Coloque la placa de calefacción en la habitación oscura y deje que se caliente a la temperatura final de 24 ° C. </li><li> Cubra la parte superior de la placa de calentamiento con el protector de la superficie, el lado brillante hacia arriba, y seguro que con una cinta. </li><li> Coloque el Parafilm sobre la Benchkote y marcar los bordes con un marcador negro para poder ver los bordes de Parafilm en la oscuridad. </li><li> Cinta de un termómetro en la parte superior de la Benchkote para controlar la temperatura de la placa de calentamiento. Poco a poco ajustar la temperatura si no es 24 ° C. </li><li> PlaCE El tubo de 50 ml con agua bidestilada y el kit de mejora de plata dentro. </li><li> Llene las pequeñas cajas de Petri con agua doblemente destilada, previamente calentada a 37 ° C. Coloque las rejillas en el agua, espécimen lado de abajo, durante 30 minutos. </li><li> Repita este paso 4.7 una vez más. </li><li> Transfiera las rejillas en la caja de almacenamiento y llevarlos a la sala oscura. </li><li> Enjuague las rejillas de nuevo pasándolos (con el lado de la muestra hacia abajo) en varias gotas de agua doble destilada a 24 ° C colocados en el Parafilm que se ha fijado en la placa de calentamiento. </li><li> Asegúrese de que 9 gotas de agua destilada dobles adicionales están dispuestos en el Parafilm, para el enjuague después de la reacción mejora plata. </li><li> Apaga la luz y asegúrese de que todas las luces están apagadas. Encienda la luz roja. </li><li> Sacar las soluciones A y B del kit de mejora de la plata de la incubadora 24 ° C. </li><li> Ponga primero 6 gotas de la solución A y luego 6 gotas de la solución B en un 1,5 mtubo de microcentrífuga de L, y mezclar bien con una pipeta Pasteur de vidrio evitando para hacer burbujas. La solución es bastante gruesa y tiene que ser mezclada manualmente con una pipeta antes de que finalmente vórtex brevemente. </li><li> Poner las soluciones A y B de nuevo en la incubadora de 24 ° C y retirar la solución C. </li><li> Añadir 6 gotas de la solución C a la mezcla A / B. A continuación, mezclar de nuevo en primer lugar con una pipeta Pasteur y luego por agitación, evite hacer burbujas. </li><li> Utilizar inmediatamente la mezcla final mediante la colocación de gotas (~ 20 l / gota) en el Parafilm. </li><li> Con unas pinzas limpias, anti-magnético, colocar las rejillas en la mezcla (por ejemplo., Reacción mejorar plata) para 6 a 15 min dependiendo de la mejora (es decir. Tamaño de las partículas de oro) deseado a obtener. </li><li> Retire las rejillas de la mezcla y pasarlos en la parte superior del agua doblemente destilada cae a 24 ° C para el lavado. En primer lugar, el uso en la sucesión rápida 6 gotas y luego 3 gotas con 7 min tiempo de incubación por gota, Antes de encender las luces. </li><li> Continúe con el siguiente paso, ya sea etiquetado inmuno-oro o tinción de la membrana 27 con el fin de visualizar el resultado de una investigación de EM. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inmuno-microscopía electrónica es una técnica que permite la combinación de localización de las proteínas con la resolución ultraestructural de los portadores y orgánulos donde residen estas proteínas. Esto es especialmente importante cuando se estudia el sistema endosomal levadura porque sus compartimentos aparecen como estructuras puntiformes en la microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, es difícil distinguirlas. Por esta razón el uso de una sonda detectable por EM y de entrar en la ruta endocítica de una manera d...

El sistema endosomal es un aparato de clasificación de membrana importante que desempeña múltiples funciones celulares importantes, incluyendo el tráfico de la enzima lisosomal receptores de clasificación y el reciclaje de la membrana plasmática (PM), los receptores 1,2. Endosomes se dividen en tres compartimentos diferentes, es decir. los endosomas tempranos (EE), a finales de los endosomas (LE) y los endosomas de reciclaje. Esta clasificación se basa en el tiempo que toma para el material endocytosed para llegar a ellos, en las proteínas marcadoras específicas y en su morfología. Las membranas, es decir, proteínas y lípidos bicapa, interiorizadas del PM pueden o bien ser entregados a través de endosomas lisosomas para la degradación o se reciclan de nuevo. Las membranas también son transportados a los endosomas de el aparato de Golgi y de manera similar, ya sea seguir a los lisosomas o ser recuperada de nuevo a los de Golgi. Además, las proteínas se pueden clasificar en vesículas luminales en ciernes hacia el interior de la membrana endosomal limitación, un proceso que conduce a la formación deuna subcategoría de LE, los cuerpos multivesiculares. El sistema endosomal levadura es relativamente menos compleja que la de las células eucariotas altos. Endosomas levadura se dividen en EE y LE. En contraste con las células de mamífero que no contienen los endosomas de reciclaje, sino también orgánulos relacionados con los lisosomas-específicos de tejido. En consecuencia, tienen una red de menor complejidad de las rutas de tráfico endosomal 3,4. Por lo tanto, la levadura ha representado y sigue representando un sistema experimental ventajosa para estudiar algunos de los principios del tráfico de membrana subyacente en el sistema endosomal. Esta ventaja se acentúa por el hecho de que numerosos genes implicados en las vías de endosomal se han aislado inicialmente con pantallas genéticas en la levadura 5. Mientras que el sistema endosomal levadura en las células de tipo salvaje y mutantes se ha estudiado ampliamente el uso de enfoques de microscopía de fluorescencia y bioquímicos, su investigación en el nivel ultraestructural sólo ha sidomínimo. Los análisis morfológicos son particularmente relevantes en la levadura porque la mayoría de los orgánulos endosomales son detectados como estructuras puntiformes por microscopía de fluorescencia, lo que hace difícil su identificación inequívoca 6. Desgraciadamente, sólo un número limitado de antisueros reconocimiento de los marcadores de proteínas endosomal levadura está trabajando en inmuno-microscopía electrónica (IEM) preparaciones 7-10. Para algunas proteínas, este problema se ha eludido por el etiquetado endógena del gen de interés y el uso de un anticuerpo que reconoce la etiqueta para detectar que 7,11,12. A menudo, sin embargo, las proteínas son indetectables por IEM debido a sus bajos niveles de expresión. Su sobreexpresión no es una solución, porque este enfoque puede inducir mis-localizaciones y / o alteraciones en los orgánulos morfología / funciones. Así, el etiquetado de los compartimentos endocítica con una sonda detectable por microscopía electrónica de EM es una opción efectiva. Esta es una solución óptima sobre todo si la PRobe está entrando en la ruta endocítica de una manera dependiente del tiempo, lo que permite saber cuándo va a marcar un orgánulo específico 6. La captación de nanogold cargado positivamente por esferoplastos de levadura (es decir. De levadura donde la pared celular se ha eliminado enzimáticamente) con éxito ha sido utilizado para identificar el endosomal levadura compartimentos 10. Estas partículas se unen fuertemente a los lípidos cargados negativamente que componen las membranas biológicas. Por lo tanto los asociados Nanogold cargados positivamente con la PM, penetra en la célula por endocitosis y pasa a través de la EE y LE antes de llegar a la vacuola. Estas pequeñas partículas de oro, sin embargo, no tienen un tamaño adecuado para ser visto por EM. Para hacerlos visibles, su tamaño se puede ampliar por reacciones químicas que conducen a la deposición de plata o de oro alrededor de la sonda de oro 13-15. Hemos desarrollado y aplicado con éxito un enfoque IEM basado en el método Tokuyasu para realizar subcelularlocalización estudia 8,16. Este método permite realizar inmunomarcaje sobre los preparativos de la levadura con una excelente resolución de la morfología 8,17-24. También hemos establecido un procedimiento que combina este protocolo IEM con el etiquetado nanogold del sistema endosomal levadura compartimentos 6. Con este enfoque hemos caracterizado morfológicamente diferentes subclases de endosomas y ultraestructuralmente examinado mutantes con un tráfico endosomal defecto 6,25. Por otra parte, hemos demostrado que este etiquetado nanogold se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje proporcionar la posibilidad de explorar la distribución de una proteína de interés en las diferentes subpoblaciones endosoma. Aquí presentamos cómo se realiza prácticamente el etiquetado del sistema endosomal levadura con nanogold cargado positivamente.

<table><tbody><tr><td>TUBOS (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.102.200.250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>391.340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Nanogold Nanosondas cargadas</td><td>positivamente, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>HQ-silver&trade; kit de mejora</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 8% grado EM</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>tienda a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Enzima lítica</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td></td><td>153526 tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 mallas rejillas de níquel&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Reino Unido</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante crio-inmuno 35&deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Suiza</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotomo&nbsp;</td><td>Leica, Solms, Alemania</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Resina Formvar 15/95</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 mallas rejillas de níquel&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Reino Unido</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, San Luis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de rejillas</td><td>Leica, Solms, Alemania</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Placa de Petri</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas capilares Pasteur de 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Róterdam, Países Bajos</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de 1,5 ml&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 50 ml</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, Países Bajos</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Protector de superficie Benchkote</td><td>Whatman, Maidstone, Reino Unido&nbsp;</td><td></td><td></td>1159201</tr></tbody></table>

nanogold etiquetado del sistema endosomal levadura de análisis ultraestructurales

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Los endosomas son uno de los principales puntos de control de clasificación de membrana en células eucariotas y regulan el reciclado o la destrucción de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática y el aparato de Golgi. Como resultado, el sistema endosomal juega un papel central en el mantenimiento de la homeostasis celular, y las mutaciones en los genes que pertenecen a esta red de orgánulos interconectados por el transporte vesicular, causan patologías graves como el cáncer y trastornos neurobiológicos. Por lo tanto, de primordial importancia es entender los mecanismos subyacentes a la biogénesis y la organización del sistema endosomal. La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido fundamental en esta tarea. Para etiquetar y analizar a nivel ultraestructural el sistema endosomal de este organismo modelo en concreto, presentamos aquí un protocolo detallado para la captación nanogold cargado positivamente por esferoplastos seguido de la visualización de estas partículas a través de una reacción en la mejora de plata. Este método es también una valiosa demasiadol para el examen morfológico de mutantes con defectos en el tráfico endosomal. Por otra parte, no sólo es aplicable para los exámenes ultraestructurales pero también se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje para investigaciones de localización de proteínas.

De acuerdo con el protocolo presentado, la morfología del sistema endosoma de la levadura puede ser el acceso por EM de transmisión. Figura 1 muestra diferentes tipos de compartimientos endosomal que han sido alcanzados y por lo tanto marcadas con nanogold. El nanogold mejorada de plata se puede ver claramente como partículas densas de electrones. Los ajustes óptimos establecidos para la reacción mejora la plata permite tener partículas de oro en un intervalo de tamaño homogéneo entre 5 y 15 nm, que no ...

La levadura, Saccharomyces cerevisiae, ha sido un modelo de organismo clave para identificar y estudiar los genes que regulan la biogénesis y funciones del sistema endosomal. Aquí se presenta un protocolo detallado para el etiquetado específico de los compartimentos endosomal para estudios ultraestructurales.

Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar a nivel ultraestructural los compartimentos endosomales de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esto se logra preparando levaduras en esferoplastos, que luego realizan la captación endocítica de partículas de oro nanométrico con carga positiva. Como segundo paso, la muestra se fija y secciona para obtener cortes criogénicos ultradelgados de las células.A continuación, los cortes criogénicos se someten a la reacción de amplificación con plata. Con el fin de aumentar y visualizar las partículas de oro nano cargadas positivamente que han sido endocitadas, se obtienen resultados que muestran la morfología de los diferentes compartimentos endosomales de levadura basándose en la marcación específica de este procedimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la marcación con inmunooro en cortes, es que no depende de anticuerpos que a menudo no funcionan en preparaciones para microscopía electrónica.Aunque este método puede ofrecernos información sobre el sistema lisosomal de la levadura sarchi ESIS vei, también puede aplicarse a otros modelos eucariotas, como otras levaduras y células de mamífero. Las levaduras a partir de las cuales se preparará el Esferoplasto se incuban primero durante la noche a 30 grados Celsius en 10 mililitros del medio adecuado, según lo determine el diseño del experimento para el día siguiente. Después de medir la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros, diluya las células en el mismo medio de cultivo hasta una DO 600 de 0,2 a 0,4.Cultive las células hasta la fase de crecimiento exponencial con una DO 600 de uno a dos, transfiera 10 equivalentes de DO 600 de células a un tubo de 50 mililitros y centrifugue a 2100 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en cinco mililitros de pipes 100 milimolares y ditiotreitol 10 milimolares a pH 7,3. Incube a 30 grados Celsius durante 10 minutos. Recopile las células mediante centrifugación.Después de desechar el sobrenadante Resus, suspenda las células en cinco mililitros de medio que contenga un molar de sorbitol y cinco miligramos de enzima lítica. Incube la mezcla a 30 grados Celsius con agitación suave durante 30 minutos. Centrifugue la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos para recoger una fracción de pellet que corresponde a las esferoplasmas.Deseche el sobrenadante y re suspenda los esferoplastos en 960 microlitros de medio frío que contenga sorbitol uno molar. Transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros frío. Para comenzar el procedimiento de absorción de nano oro, use una pipeta y mezcle suavemente los esferoplastos con cuatro de partículas de nano oro cargadas positivamente.Resuspender en 40 microlitros de agua. El volumen final de la mezcla debe ser un mililitro. Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 minutos.Transfiera la suspensión a temperatura ambiente e incube durante el tiempo necesario para permitir la internalización de oro nano mediante endocitosis. Cuando se complete la absorción deseada de oro nano, detenga la reacción agregando un mililitro de fijador de doble concentración que contenga sorbitol uno molar a la suspensión celular. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.Invierta suavemente el tubo de microcentrífuga manualmente varias veces durante los 30 minutos para mantener la suspensión y el plasto de PHE. A continuación, centrifugue dos veces a 1700 G durante 25 segundos, deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de fijador fresco de concentración estándar que contenga sorbitol uno molar. Incube durante dos horas a temperatura ambiente en una rueda giratoria lenta. Posteriormente, las células se procesan y secciones criogénicas según lo descrito en el protocolo de texto. Antes de comenzar este procedimiento, retire el kit de realce de plata del congelador y deshiélelo en un incubador a 37 grados Celsius. Coloque el kit descongelado en un incubador de banco a 24 grados Celsius previamente colocado en la sala oscura hasta su uso.Coloque una placa calefactora en una habitación oscura y caliéntela hasta una temperatura final de 24 grados Celsius. Cubra la parte superior de la placa calefactora con una superficie de recubrimiento para banco, colocando el protector con el lado brillante hacia arriba, y sujételo con cinta adhesiva. Coloque una película de parafina sobre el protector de superficie y marque los bordes con un rotulador negro para permitir la visualización en la oscuridad.Colete un termómetro en la parte superior del protector de superficie. Para monitorear la temperatura de la placa calefactora, ajuste gradualmente la temperatura. Si no es de 24 grados Celsius, coloque un tubo de 50 mililitros que contenga agua doblemente destilada.Dentro del incubador, llene una pequeña placa de Petri con agua doblemente destilada, previamente calentada a 37 grados Celsius. Coloque dos rejillas de níquel con las secciones criogénicas en el agua, con el lado del espécimen hacia abajo, durante 30 minutos. Después de 30 minutos, llene una segunda placa de Petri con agua doblemente destilada previamente calentada y coloque las mismas dos rejillas de níquel en el agua durante otros 30 minutos.Lave nuevamente las rejillas pasándolas, con el lado del espécimen hacia abajo, sobre varias gotas de agua doblemente destilada a 24 grados Celsius colocadas sobre el parafina fijada en la placa calefactora. Asegúrese de que otras nueve gotas adicionales de agua doblemente destilada estén preparadas sobre la parafina para el lavado posterior a la reacción de realce con plata. En este punto del procedimiento, todas las luces de la habitación oscura deben apagarse y debe encenderse la luz roja.Sin embargo, únicamente con fines de filmación, la luz permanecerá encendida. En esta demostración, retire las soluciones a y B del kit de amplificación de plata del incubador a 24 grados Celsius en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros: seis gotas de la solución A, seguidas de seis gotas de la solución B, y mezcle bien con una pipeta de vidrio Pasteur, evitando la formación de burbujas. Agite la solución en vórtex.Devuelva brevemente las soluciones a y B al incubador a 24 grados Celsius y retire la solución C. Añada seis gotas de la solución C a la mezcla AB. Vuelva a mezclar con una pipeta Pasteur seguido de vortex, y evite formar burbujas.Utilice esta mezcla final inmediatamente. Coloque gotas sobre el portaobjetos con un par de pinzas limpias y antimagnéticas. Coloque las rejillas sobre la mezcla.Esta es la reacción de realce con plata. Deje las rejillas durante seis a quince minutos, dependiendo del grado de realce deseado para el experimento. Retire las rejillas de la mezcla y páselas rápidamente a través de una serie de seis gotas de agua doblemente destilada colocadas sobre Perfil a 24 grados Celsius durante los tres últimos lavados.Deje las rejillas durante siete minutos por cada gota de agua. Si realiza un experimento real, encienda nuevamente las luces cuando termine el lavado. Posteriormente, los resultados se visualizan mediante marcado con ImmunoGold o tinción de membrana para una investigación en microscopía electrónica.Se pueden marcar diferentes tipos de compartimentos endosomales de levadura con nano oro aumentado con plata y visualizar mediante microscopía electrónica. Una incorporación de cinco minutos de nano oro marca la membrana plasmática y los compartimentos endosomales tempranos, como vesículas individuales, que posiblemente sean vesículas endocíticas, y estructuras tubulares, que muy probablemente sean endosomas tempranos. Una incubación de 30 minutos con nano oro conduce a la marcación de endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares.La potencia de resolución al combinar un procedimiento de microscopía electrónica inmunológica con este protocolo de realce con plata de oro nano queda evidenciada por la conservación y calidad de la morfología de los orgánulos mostrados, en particular, las vesículas internas de los cuerpos multivesiculares. Antes de utilizar el método de realce con plata, es necesario realizar un experimento piloto para determinar los tiempos óptimos de incubación necesarios tanto para el tamaño como para la uniformidad de estas partículas de plata. Siga este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como la marcación inmunológica para responder preguntas como la localización de una proteína particular en un compartimento marino específico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

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La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

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Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

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El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.

Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada

Aprende a visualizar compartimentos endosomales en levadura Saccharomyces cerevisiae mediante nanogold cargado positivamente y microscopía electrónica. Este protocolo supera las limitaciones de los métodos basados en anticuerpos.

Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

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