Name: Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a realizar ensayos de agregación de perlas para caracterizar moléculas de adhesión celular. Este método rápido utiliza dominios ectodérmicos fusionados a FC y perlas magnéticas para evaluar la adhesión homofílica de proteínas en estudio.

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Este trabajo fue apoyado por un premio de la NSF/ARRA (IOS 0920357) y un premio de los NIH (5R21MH098463).

1. Cell preparación (Día de -2 a 0) <ol><li> Dividir celdas HEK293 1: 5 utilizando solución de tripsina-EDTA 0,05% y se incuban en medios de crecimiento a 37 ° C con 5% de CO 2 hasta 60 - 80% de confluencia (2-3 días). Para cada condición, células de cultivo en 2 x 100 mm platos. </li></ol> 2. transfección celular (Día 1) <ol><li> Transfectar células HEK293 con plásmido que codifica Fc-fusion utilizando un reactivo de transfección como Lipofectamine. Los métodos alternativos que resultan en eficiencias de transfección comparables también pueden ser utilizados. </li><li> Volver células transfectadas a la incubadora durante 24 horas. </li></ol> 3. Cell Propagación (Día 2) <ol><li> Precaliente el crecimiento de medios sin suero bovino fetal (FBS) al 37 ° C. </li><li> Lavar platos 2x con 10 ml Growth Medios FBS, y devuelven los platos a la incubadora a 37 ° durante 1 hora. </li><li> Enjuague la culturas platos una vez más con 10 ml Growth Medios FBS, para un total de 3 lavados. </li><li> Incubate las células HEK293 transfectadas a 37 ° C durante otras 48 horas sin FBS antes de recoger los medios de comunicación. </li></ol> 4. bolas Aggregation (Día 4) <ol><li> Para recoger los medios de comunicación a partir de placas de cultivo, transferir los medios de comunicación de cada par de platos para 50 ml tubos cónicos y centrifugado a 500 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares. </li><li> Los medios de filtro de 50 ml tubo cónico de centrífuga en un filtro utilizando una jeringa de 30 ml y 0,45 micras filtro de jeringa. </li><li> Girar filtros centrífugos a 4.000 xg y 4 ° C hasta que el volumen de medios de cultivo concentrado es de aproximadamente 500 l (aproximadamente 15 min). Repita hasta que haya agregado todos los medios de cultivo y se concentró. </li><li> Añadir 1,5 l de perlas magnéticas proteína G a 1 ml de tampón de unión enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada muestra, el lugar en un imán y eliminar el tampón. Inmediatamente después, añadir el medio de cultivo concentrado a la proteína G perlas magnéticas. </li><li> Girar los tubos a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Pltubos as en un imán y eliminar los medios de comunicación. Lavarse rápidamente perlas dos veces con frío hielo 1 ml de tampón de unión, y luego volver a suspender cuentas en 300 l de tampón de unión. </li><li> Dividir volvió a suspender cuentas en 2 tubos, 150 l en cada tubo, y luego añadir 1,5 l de CaCl 2 mM o 200 mM EDTA 200 para la condiciones &quot;no&quot; calcio &quot;calcio&quot;, y, respectivamente. </li><li> Transferencia de 100 l de cada condición a una depresión bien deslice y recoger micrografías utilizando un microscopio de luz transmitida (Figura 2). Recoger imágenes de 5 campos de visión para cada experimento en cada punto de tiempo deseado. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Usando ImageJ, o software de análisis de imagen comparable, abra uno de los cinco conjuntos de datos de imágenes utilizando la Importación / Secuencia de imágenes ... en el menú desplegable Archivo. Éstas se abrirán como de pilas de imágenes. </li><li> En el cuadro de diálogo ... Imagen / Propiedades, cambie la iunidades de magos a píxeles y establecer pixel Ancho y Altura en hasta 1,0. </li><li> Convertir las imágenes a binario utilizando el / Umbral Ajuste ... comando en el menú desplegable de imagen. Establecer el umbral para incluir píxeles que contribuyen a cuentas o agregados de cuentas, pero que excluye fondo y las partículas pequeñas. Aplicar a todas las imágenes de la pila. </li><li> En el cuadro de diálogo Medidas Set, seleccione las casillas de la zona y de pila de posición. </li><li> Ejecute Analizar Partículas ... en el menú desplegable Analizar. Esto generará una lista de partículas identificadas, incluyendo su tamaño (área) y la imagen en la que se identificaron. </li><li> Repita este proceso para el que experimento y la condición experimental. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La adhesión celular es una característica esencial de la vida multicelular y está mediada por una amplia gama de proteínas de la superficie celular. De estos, se entienden las propiedades adhesivas detalladas por sólo una proporción relativamente pequeña. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y rápido para la investigación de la capacidad adhesiva homophilic de ectodominios secretadas fusionados con un cómodo marcador de epítopo. Este enfoque tiene una serie de ventajas importantes. En primer lugar, no se requieren...

Adhesión célula-célula es esencial para el desarrollo y la integridad de los organismos multicelulares y es mediada por un conjunto diverso de moléculas de superficie celular. Muchas de estas moléculas de adhesión se han identificado y caracterizado, aunque muchos aún no se han descubierto. Se utilizan varios métodos para investigar las propiedades de las moléculas de adhesión celular (CAMs), incluyendo ensayos de clasificación de células, ensayos de agregación celular 1-8 y métodos biofísicos, tales como la microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza de superficie 9-12. La complejidad de incluso simplificada en sistemas in vitro utilizando líneas celulares hace que sea difícil determinar las propiedades adhesivas de una CAM putativo. Típicamente, una molécula se considera una CAM si induce la agregación de células cuando se transfecta en una línea celular no adhesiva. Sin embargo, está claro que esto no es evidencia directa de la actividad de adhesivo. Por ejemplo, facilitar la entrega de la superficie celular o la estabilidad de unCAM también se traduciría en un aumento de la agregación de células 1,13. Por otra parte, una verdadera CAM puede fallar para mediar en la agregación de células si la línea celular carece de otros co-factores necesarios para la entrega de la superficie celular o la estabilización. Para evitar estos factores que complican, los ensayos más directos pueden ser empleadas que se basan en la idea de que las interacciones adhesivas deben ser una propiedad bioquímica intrínseca del dominio extracelular. Mientras que los granos fueron utilizados inicialmente para caracterizar Ng-CAM 2, estos ensayos se han ampliado con el fin de investigar la adhesión mediada por cadherina 12,14,15. Uso de fusión de las fusiones C-cadherina ectodominio-Fc, el laboratorio Gumbiner mostró que múltiples repeticiones de cadherina contribuyen a las interacciones homofílicas 14. Usando ensayos de agregación del grano comparables, E-cadherina y de adhesión N-cadherina también se han caracterizado 12,15, como tener un número de protocadherins 1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila <em&gt; 19. Aquí se describe un ensayo relativamente simple y rápido para la caracterización de la actividad adhesiva de secretadas, ectodominios etiquetadas con epítopo de CAMs homofílicas putativo (Figura 1). Hemos usado este ensayo principalmente para caracterizar los miembros de la superfamilia de cadherina.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 plásmido</td><td>Addgene</td><td>A enviar</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 células</td><td>Colección de cultivo tipo americano</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; Proteína G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de depresión</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>filtro de jeringa de 0,45 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Software de análisis de imágenes</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla de tampones/soluciones</td></tr><tr><td>Medios de crecimiento</td><td>DMEM + 10% FBS + Filtro Pen-Strep</td><td>esterilizar y almacenar a 4 &deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>Medios de crecimiento &ndash; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filter esterilizar y almacenar a 4 &deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de unión</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vórtice hasta que se disuelva, mantener en hielo.</td><td></td></tr></tbody></table>

grano de agregación los ensayos para la caracterización de putativos moléculas de adhesión celular

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

La adhesión célula-célula es fundamental a la vida multicelular y está mediada por una serie diversa de proteínas de la superficie celular. Sin embargo, las interacciones adhesivas para muchas de estas proteínas son poco conocidos. Aquí se presenta un método simple, rápido para la caracterización de las propiedades adhesivas de moléculas de adhesión celular homofílicas putativos. Células HEK293 cultivadas se transfectaron con el plásmido de ADN que codifica un secretada, ectodominio epítopo de etiquetado de una proteína de la superficie celular. El uso de perlas funcionalizados específicos para la etiqueta de epítopo, la proteína de fusión soluble, secretada es capturada del medio de cultivo. Las perlas recubiertas se pueden utilizar directamente en ensayos de agregación de talón o en grano fluorescente de clasificación ensayos para probar la adhesión homophilic. Si se desea, la mutagénesis se puede entonces utilizar para dilucidar los aminoácidos o dominios específicos requeridos para la adhesión. Este ensayo requiere sólo pequeñas cantidades de proteína expresada, no requiere la producción de líneas celulares estables, y se puede ACCOmplished en 4 días.

Un ejemplo experimento se presenta en la Figura 2, que muestra la agregación de talón dependiente de calcio por el ectodominio de N-cadherina fusionada a Fc (NcadEC-Fc). En ausencia de calcio, perlas exhiben poca o ninguna tendencia a agregarse y no hay aumento en tamaño de los agregados con el tiempo (Figura 1A, C). En presencia de calcio, perlas recubiertas con NcadEC-Fc muestran robusta agregación, con el aumento de tamaño de los agregados en el tiempo (Figura 1B, C).</strong...

Aquí presentamos un método simple y rápido para caracterizar las propiedades adhesivas intrínsecas de las moléculas de adhesión celular putativas. El ectodominio secretado y marcado con epítopos de una molécula de adhesión celular se captura del medio de cultivo en perlas funcionalizadas pequeñas y uniformes. Estas perlas se pueden utilizar inmediatamente en ensayos simples de agregación de perlas.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

El objetivo general de este procedimiento es probar la capacidad de los dominios ecto de las proteínas para mediar la adhesión homofílica; para lograr esto: los plásmidos que codifican la fusión de un fragmento de dominio ecto a la región FC de IgG humana se transfectan en células HEC 2 93. Las proteínas de fusión Odin FC secretadas se capturan en perlas magnéticas conjugadas con la proteína G y, después de un lavado, se permite que las perlas recubiertas interactúen en solución. A continuación, se obtienen imágenes de las perlas recubiertas para evaluar el grado de agregación y, finalmente, se cuantifican mediante un simple análisis de imágenes, los datos resultantes revelan si la proteína estudiada es capaz de mediar la adhesión homofílica.Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como los ensayos de agregación celular, es que es rápida, sencilla y prueba directamente la actividad adhesiva de la proteína elegida. La demostración de esta técnica estará a cargo de la Dra. Michelle Eman, científica principal del laboratorio. Comience este procedimiento preparando las células cultivadas para NCA aquí ECFC, dos o tres días antes de la transfección.Utilice 0,05%trips en EDTA para separar las células HEC 2 93 de las placas de cultivo. Prepara dos platos de 100 milímetros para cada condición. Divida las celdas de una a cinco y luego cultive.Medio de crecimiento suplementado. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta que tengan un 60 a 80% de confluentes. El día de la transfección, utilice un reactivo como lipo para introducir un plásmido que codifica la fusión FC.Después de la transfección, regrese las células a la incubadora durante 24 horas el día después de la transfección Precalentar, DMEM con estreptococo pentizado y sin suero fetal bovino a 37 grados centígrados. Enjuague cada placa dos veces con 10 mililitros del medio calentado y luego regrese las placas a la incubadora a 37 grados centígrados durante una hora después de la incubación, enjuague las placas de cultivo una vez más con 10 mililitros de DMEM sin suero fetal bovino durante un total de tres lavados, luego incube las células seccionadas a 37 grados centígrados durante otras 48 horas antes de recolectar el medio. Cuatro días después de la transfección, utilice una pipeta serológica para recoger el medio de cada par de placas de cultivo y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros.Luego centrifuga el medio a 500 Gs por cinco minutos para granular los restos celulares después del centrifugado, vierte el medio de cada tubo cónico de 50 mililitros en una jeringa de 30 mililitros y fíltralo a través de una jeringa de 0,45 micras. Filtre en un concentrador centrífugo. Gire los filtros centrífugos hasta que el volumen de medio de cultivo concentrado se haya reducido a aproximadamente 500 microlitros.Esto tarda aproximadamente 15 minutos. Repita este proceso hasta que se haya agregado y concentrado todo el medio de cultivo. A continuación, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada muestra a 1,5 microlitros de perlas magnéticas de proteína G por un mililitro de tampón de unión en frío helado.El aspecto más difícil de este procedimiento es la agregación de cuentas. Para garantizar el éxito, asegúrese de seguir el procedimiento al pie de la letra. Observa las cuentas rápidamente, pero no con demasiada dureza.Nunca se debe permitir que se sequen en el costado del tubo o que permanezcan en el imán demasiado tiempo. Coloque el tubo sobre un imán y, con una pipeta, aspire el tampón. A continuación, añada inmediatamente el medio de cultivo concentrado a las perlas magnéticas de proteína G.Gire los tubos a cuatro grados centígrados durante dos horas. Coloque los tubos en un imán y retire el medio rápidamente. Lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón aglutinante helado y luego vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de tampón aglutinante.Divida las perlas resuspendidas en dos tubos con 150 microlitros en cada tubo. A continuación, añada 1,5 microlitros de cloruro de calcio o EDTA para las condiciones de calcio y sin calcio, respectivamente. Transfiera 100 microlitros de cada condición a una depresión.Deslizamiento del pozo utilizando un microscopio de luz transmitida. Recopile imágenes de cinco campos de visión para cada experimento en cada punto de tiempo deseado. Usar image J o un software de análisis de imágenes comparable.Abra uno de los cinco conjuntos de datos de imagen en la imagen J en el menú desplegable. En la parte superior de la pantalla, seleccione archivo. A continuación, seleccione importar y, a continuación, secuencia de imágenes.Busque la carpeta que contiene los archivos de imagen y, a continuación, ábralos como una pila de imágenes. A continuación, en la barra de menú desplegable, haga clic en la imagen y luego seleccione propiedades. Para abrir la ventana de propiedades allí.Cambie las unidades de imagen a píxeles y establezca el ancho y el alto de píxeles en 1.0. Haga clic en la imagen nuevamente, seleccione ajustar y luego umbral para abrir la ventana de umbral y use el control deslizante para ajustar el umbral de la imagen. Incluya píxeles que contribuyan a las cuentas y excluya y partículas pequeñas.Aplique el umbral a todas las imágenes de la pila de imágenes. A continuación, en la barra de menú desplegable en la parte superior de la pantalla. Haga clic en analizar.A continuación, seleccione establecer medidas para abrir el cuadro de diálogo de medición utilizando las casillas de verificación seleccionar área y posición de pila en la parte superior de la pantalla. Haga clic en analizar y, a continuación, seleccione analizar partículas. Esto generará una lista de partículas identificadas, incluyendo su tamaño y la imagen en la que fueron identificadas.Repita este proceso para cada experimento y cada condición experimental para determinar la capacidad adhesiva dependiente del calcio del pez cebra y la cadherina. Las células HEC 2 9 3 se transfectaron con el dominio NCAT herrin OD fusionado con dos fc y se analizaron las siguientes células de agregación de perlas dependientes de calcio como se describe en este video, como se puede ver en estas imágenes. En ausencia de calcio, las perlas exhiben poca o ninguna tendencia a agregarse, y no hay aumento en el tamaño del agregado con el tiempo en presencia de calcio.Sin embargo, los latidos recubiertos con NCAT aquí y ECFC muestran una agregación robusta con el tamaño del agregado que aumenta con el tiempo como una medida semicuantitativa de la adhesión. Se analizaron las imágenes de luz transmitida de tres experimentos para determinar el tamaño medio de los agregados. Como se puede observar en este gráfico, la agregación de perlas recubiertas de ECFC en presencia de calcio y en ausencia de calcio se determinó a intervalos de 15 minutos.En el transcurso de una hora, estos datos revelan que el dominio ecto del pez cebra n cadherina media la adhesión homofílica dependiente del calcio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar si la adhesión es una propiedad bioquímica intrínseca de su proteína de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

En este video, demostramos la técnica para medir las interacciones transcelulares entre las moléculas de adhesión de células sinápticas a través del ensayo de agregación celular HEK. En este ensayo, un número igual de células HEK que expresan una molécula de adhesión celular presináptica deseada y una proteína fluorescente se mezclan con células HEK que expresan una molécula de adhesión celular postsináptica y otra proteína fluorescente. La interacción entre las moléculas de adhesión celular...

Ensayo de agregación celular para detectar interacciones trans entre moléculas de adhesión celular

Presentamos un método in vitro que permite cuantificar el número real de células adhesivas dentro de una monocapa de células endoteliales.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

adherencias de la superficie celular son fundamentales en mechanotransduction, ya que transmiten la tensión mecánica e inician las vías de señalización implicadas en la homeostasis del tejido y el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para la disección de las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión, utilizando microperlas magnéticas recubiertas con ligando y aplicación de la fuerza a los receptores de adhesión.

El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.

Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.

Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Aprende a realizar ensayos de agregación de perlas para caracterizar moléculas de adhesión celular. Este método rápido utiliza dominios ectodérmicos fusionados a FC y perlas magnéticas para evaluar la adhesión homofílica de proteínas en estudio.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

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