Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

El objetivo general de este procedimiento es probar la capacidad de los dominios ecto de las proteínas para mediar la adhesión homofílica; para lograr esto: los plásmidos que codifican la fusión de un fragmento de dominio ecto a la región FC de IgG humana se transfectan en células HEC 2 93. Las proteínas de fusión Odin FC secretadas se capturan en perlas magnéticas conjugadas con la proteína G y, después de un lavado, se permite que las perlas recubiertas interactúen en solución. A continuación, se obtienen imágenes de las perlas recubiertas para evaluar el grado de agregación y, finalmente, se cuantifican mediante un simple análisis de imágenes, los datos resultantes revelan si la proteína estudiada es capaz de mediar la adhesión homofílica.

Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como los ensayos de agregación celular, es que es rápida, sencilla y prueba directamente la actividad adhesiva de la proteína elegida. La demostración de esta técnica estará a cargo de la Dra. Michelle Eman, científica principal del laboratorio. Comience este procedimiento preparando las células cultivadas para NCA aquí ECFC, dos o tres días antes de la transfección.

Utilice 0,05%trips en EDTA para separar las células HEC 2 93 de las placas de cultivo. Prepara dos platos de 100 milímetros para cada condición. Divida las celdas de una a cinco y luego cultive.

Medio de crecimiento suplementado. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta que tengan un 60 a 80% de confluentes. El día de la transfección, utilice un reactivo como lipo para introducir un plásmido que codifica la fusión FC.

Después de la transfección, regrese las células a la incubadora durante 24 horas el día después de la transfección Precalentar, DMEM con estreptococo pentizado y sin suero fetal bovino a 37 grados centígrados. Enjuague cada placa dos veces con 10 mililitros del medio calentado y luego regrese las placas a la incubadora a 37 grados centígrados durante una hora después de la incubación, enjuague las placas de cultivo una vez más con 10 mililitros de DMEM sin suero fetal bovino durante un total de tres lavados, luego incube las células seccionadas a 37 grados centígrados durante otras 48 horas antes de recolectar el medio. Cuatro días después de la transfección, utilice una pipeta serológica para recoger el medio de cada par de placas de cultivo y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego centrifuga el medio a 500 Gs por cinco minutos para granular los restos celulares después del centrifugado, vierte el medio de cada tubo cónico de 50 mililitros en una jeringa de 30 mililitros y fíltralo a través de una jeringa de 0,45 micras. Filtre en un concentrador centrífugo. Gire los filtros centrífugos hasta que el volumen de medio de cultivo concentrado se haya reducido a aproximadamente 500 microlitros.

Esto tarda aproximadamente 15 minutos. Repita este proceso hasta que se haya agregado y concentrado todo el medio de cultivo. A continuación, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada muestra a 1,5 microlitros de perlas magnéticas de proteína G por un mililitro de tampón de unión en frío helado.

El aspecto más difícil de este procedimiento es la agregación de cuentas. Para garantizar el éxito, asegúrese de seguir el procedimiento al pie de la letra. Observa las cuentas rápidamente, pero no con demasiada dureza.

Nunca se debe permitir que se sequen en el costado del tubo o que permanezcan en el imán demasiado tiempo. Coloque el tubo sobre un imán y, con una pipeta, aspire el tampón. A continuación, añada inmediatamente el medio de cultivo concentrado a las perlas magnéticas de proteína G.

Gire los tubos a cuatro grados centígrados durante dos horas. Coloque los tubos en un imán y retire el medio rápidamente. Lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón aglutinante helado y luego vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de tampón aglutinante.

Divida las perlas resuspendidas en dos tubos con 150 microlitros en cada tubo. A continuación, añada 1,5 microlitros de cloruro de calcio o EDTA para las condiciones de calcio y sin calcio, respectivamente. Transfiera 100 microlitros de cada condición a una depresión.

Deslizamiento del pozo utilizando un microscopio de luz transmitida. Recopile imágenes de cinco campos de visión para cada experimento en cada punto de tiempo deseado. Usar image J o un software de análisis de imágenes comparable.

Abra uno de los cinco conjuntos de datos de imagen en la imagen J en el menú desplegable. En la parte superior de la pantalla, seleccione archivo. A continuación, seleccione importar y, a continuación, secuencia de imágenes.

Busque la carpeta que contiene los archivos de imagen y, a continuación, ábralos como una pila de imágenes. A continuación, en la barra de menú desplegable, haga clic en la imagen y luego seleccione propiedades. Para abrir la ventana de propiedades allí.

Cambie las unidades de imagen a píxeles y establezca el ancho y el alto de píxeles en 1.0. Haga clic en la imagen nuevamente, seleccione ajustar y luego umbral para abrir la ventana de umbral y use el control deslizante para ajustar el umbral de la imagen. Incluya píxeles que contribuyan a las cuentas y excluya y partículas pequeñas.

Aplique el umbral a todas las imágenes de la pila de imágenes. A continuación, en la barra de menú desplegable en la parte superior de la pantalla. Haga clic en analizar.

A continuación, seleccione establecer medidas para abrir el cuadro de diálogo de medición utilizando las casillas de verificación seleccionar área y posición de pila en la parte superior de la pantalla. Haga clic en analizar y, a continuación, seleccione analizar partículas. Esto generará una lista de partículas identificadas, incluyendo su tamaño y la imagen en la que fueron identificadas.

Repita este proceso para cada experimento y cada condición experimental para determinar la capacidad adhesiva dependiente del calcio del pez cebra y la cadherina. Las células HEC 2 9 3 se transfectaron con el dominio NCAT herrin OD fusionado con dos fc y se analizaron las siguientes células de agregación de perlas dependientes de calcio como se describe en este video, como se puede ver en estas imágenes. En ausencia de calcio, las perlas exhiben poca o ninguna tendencia a agregarse, y no hay aumento en el tamaño del agregado con el tiempo en presencia de calcio.

Sin embargo, los latidos recubiertos con NCAT aquí y ECFC muestran una agregación robusta con el tamaño del agregado que aumenta con el tiempo como una medida semicuantitativa de la adhesión. Se analizaron las imágenes de luz transmitida de tres experimentos para determinar el tamaño medio de los agregados. Como se puede observar en este gráfico, la agregación de perlas recubiertas de ECFC en presencia de calcio y en ausencia de calcio se determinó a intervalos de 15 minutos.

En el transcurso de una hora, estos datos revelan que el dominio ecto del pez cebra n cadherina media la adhesión homofílica dependiente del calcio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar si la adhesión es una propiedad bioquímica intrínseca de su proteína de interés.