Name: Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprende a dirigir transgenes al locus PITX3 en células madre embrionarias humanas usando nucleasas dedo de zinc. Este método mejora la recombinación homóloga para estudiar el desarrollo del SNC.

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El trabajo descrito en este protocolo fue posible gracias a la financiación del Gobierno de Victoria como parte de una alianza de colaboración con el Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril. Todos los medios y soluciones se equilibraron a 37 ° C a menos que se especifique lo contrario. 1. Ampliación del PSC Humanos (hESCs y hiPSCs, WA-09 utilizado en el presente Protocolo) para la transfección Nota: No es necesario ampliar hESCs en Matrigel o Geltrex. hESCs Ampliado de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) pueden ser utilizados para la electroporación o nucleofection después de una etapa de eliminación del MEF (ver sección 2.8). <ol><li> Preparar 1 x 100 mm plato y 1 x frasco de 75cm2 DR4 MEFs a 2,0 x 10 4 células por cm 2 en los medios de comunicación del MEF (ver Tabla 1) en los platos pre-recubierto con 0,1% w / v de gelatina. Nota: CF1, BLK6 o MF1 MEFs se puede utilizar, sin embargo, se recomienda que se utilicen líneas MEF resistentes a los antibióticos, por ejemplo, DR410. </li><li> Al día siguiente, hESCs paso en una placa de 100 mm pre-plateado con MEFs preparados en la sección 1.1. Para ello aspitasa hESC medios de culturas platos, lavar hESCs con solución salina equilibrada de Ca2 + / Mg2 + exento de Hanks (HBSS), añadir Dispasa (ver Tabla 2 en volúmenes apropiados), y meterlo en un incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2. Después de 3-5 minutos de incubación, aspirado Dispasa y suavemente lavar 1-2 veces con HBSS para eliminar MEFs. Añadir medios células madre (véase la Tabla 3) y usando un raspador de células, o 5 ml pipeta, raspar suavemente las colonias de la superficie de la placa de cultivo. </li><li> Recoger los fragmentos de colonias en la suspensión de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga de 15 ml. Placa de cultivo Enjuague con medios de comunicación y traslado al tubo de 15 ml de células madre. Tenga cuidado de no romper los grumos en células individuales o pequeños fragmentos. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 160 xg para sedimentar los fragmentos de colonias. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Toque en el fondo del tubo de 15 ml con el dedo para aflojar colonia fragmento de pellets. Fragmentos suavemente volver a suspender las colonias en medios de células madre según la relación de división (normallya dividir relación entre 1: 4 y 1: 8 es apropiado). Tenga mucho cuidado de no hacer grumos en las células individuales o pequeños fragmentos ya que esto afectaría replating eficiencia. </li><li> Antes de resiembra fragmentos de células madre en MEFs lavan 1 vez con HBSS. Poco a poco agregue la cantidad apropiada (véase la Tabla 2) de la suspensión de células que contiene fragmentos de células madre en los medios de comunicación de células madre a los platos pre-plateados, MEFs. </li><li> Coloque placas de cultivo en la repisa en la incubadora y se mueven lentamente hacia adelante y hacia atrás y de lado a otro para distribuir uniformemente fragmentos de colonias. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación de células madre a diario. </li><li> Para preparar los medios de MEFs (MEF-CM) acondicionado lavar el 75 cm 2 frasco de pre-plateado con MEFs 1 x con HBSS. Añadir medios hESC. Después de 24 horas, recoja medio condicionado y reemplazar con los medios de comunicación hESC fresco. Repita todos los días durante un máximo de 12 días. Almacenar MEF-CM a 4 ° C hasta que se necesite. </li></ol> 2 Preparación de los CES Humanos de transfección <ol><li> Observar el crecimiento de hESCsbajo un microscopio todos los días. Cuando las colonias se convierten en un 40-50% de confluencia, la placa 3 x 100 mm platos con 2,0 x 10 5 MEFs por cm 2. </li><li> Cuando las colonias se convierten en 60 - 70% de confluencia que están listos para ser transfectadas. &#39;novio&#39; colonias mediante la eliminación de colonias diferenciadas o núcleos de colonias. Nota: Como creemos más alta eficiencia de transfección y dirigidos ocurren cuando las células están en fase logarítmica de crecimiento, se sugiere que la electroporación se llevó a cabo antes de hESCs alcanzan ≥ 70% de confluencia. </li><li> Lávese las colonias de células madre con HBSS y añadir Accutase. Nota: No es necesario hESCs el pretratamiento con el inhibidor ROCA Y-27632 de inhibición suficiente se producirá cuando se incubaron con Y-27632 durante el paso 2.7 </li><li> Incubar durante 10 - 20 min a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta que las colonias se vuelven células individuales como se observa bajo un microscopio. Las células se tritura con una pipeta de 1 ml. </li><li> Añadir medios hESC y filtro en un tubo cónico de 15 ml utilizando un Straine 40 micras celularR para eliminar grupos de células. </li><li> Se centrifuga a 160 × g durante 5 min. Resuspender pellet de células en medios de células madre recién reconstituido y repetir para eliminar cualquier solución Accutase residual. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación de células madre que contienen 10 M Y-27632 y transferir la suspensión total de células a una placa de 100 mm pre-recubierto con gelatina. </li><li> Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante un mínimo de 30 min. </li><li> Durante este tiempo MEFs se adhiere al plato de gelatina recubierta. Recoger hESCs no adherentes utilizando una pipeta de 1 ml en un tubo de centrífuga de 15 ml fresco y determinar la densidad de células usando un hemocitómetro. </li></ol> 3. electroporación de hESCs <ol><li> Los medios filtrantes-CM MEF que utilizan un filtro de 0,22 micras y añadir 10 ml de factor de crecimiento / fibroblasto humano recombinante ng 2 (rhFGF2). </li><li> Transferir 7,5 x 106 hESCs de la sección 2.9 a un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 160 xg durante 5 min. </li><li> Durante este tiempo configurar el electroporador: Seleccione el programa para ele exponencialctroporation y establezca los siguientes parámetros, Voltaje: 250 V, capacitancia: 500 mF, y Resistance: ∞-. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender pellet de células en 0,8 ml de helado de 0,22 micras HBSS filtrada. Transfiera la solución a un 0,4 cm cubeta de electroporación estéril. </li><li> Añadir construcción de la orientación TV-hPITX3-forward (30 g de ADN) y mezclar suavemente con una pipeta de 200 l. Incubar en hielo durante 5 min. Durante este tiempo, retirar una alícuota de Pitx3 ZFN ARNm y descongelar en hielo. Cuando descongelado transferencia de 7,5 l de ADN ZFN ARNm para mezcla / célula en cubeta de electroporación. Mezclar suavemente con una pipeta de 200 l. Nota: El lugar está dirigido es el principal factor que contribuye a la eficiencia de la focalización. Codificación Loci genes silenciosos, los genes no se expresan en los CES, como Pitx3 son difíciles de destino mediante recombinación homóloga convencional 6. Por lo tanto, este protocolo utiliza ZFNs diseñado a medida para el locus Pitx3 humana para inducir un ADN de doble cadena break. </li><li> Electroporar siguiendo las instrucciones que aparecen en pantalla en el electroporador. </li><li> Usando una pipeta transferir 200 l el contenido de la cubeta de electroporación de un tubo de 15 ml que contiene 10 ml de medio de células madre. Lave la cubeta dos veces con 200 l de los medios de comunicación de células madre cada vez y de transferencia a un tubo de 15 ml. Habrá &quot;-mucosa como&quot; escombros formado por ADN y proteínas de las células lisadas que repercutirán negativamente en la supervivencia celular. Se centrifuga a 160 g durante 5 minutos para eliminar estos desechos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y golpee suavemente sedimento celular para aflojar. Vuelva a suspender en 30 ml suplementadas MEF-CM que contienen 10 M Y-27632 y replate a 3 x 100 mm platos preplated con MEFs. </li><li> Cambie los medios de comunicación todos los días. El día 2, Y-27632 puede ser retirado y las células cultivadas en los medios de prensa de células madre. </li><li> Después de 2-3 días los hESCs deben ser 50-70% de confluencia. En este punto, comenzará la selección de antibióticos (por ejemplo, 0,5 mg / ml de puromicina). </li><li> Mantener selexión añadiendo fresca medios hESC / puromicina diaria. Después de ~ 7 días pequeñas colonias deben ser visibles. Si no se utilizan MEFs resistentes a los antibióticos, MEFs se puede complementar con la adición de una células adicionales 1,0 x 10 4 por cm 2. </li></ol> 4. Picking clones transgénicos de células madre <ol><li> Aproximadamente el 14 - 21 días después de la selección (cuando las colonias han alcanzado ~ 1 mm de diámetro) se preparan placas de expansión y proyección. Comience por descongelar una alícuota de Matrigel o Geltrex a 4 ° C durante un mínimo de 5 horas. Diluir según las instrucciones del fabricante y añadir 75 l a cada pocillo de placas de 3 x 96 pocillos. Preparar placas 3 x 48 pocillos en placas MEF a 2,0 x 10 4 células por cm 2. Incubar ambas placas O / N a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> El día siguiente diseccionar colonias en 16-25 pedazos usando una aguja 21 en el extremo de una pipeta de 2 ml mediante la reducción de una cuadrícula. </li><li> Aspirar Matrigel de placas de 96 pocillos y reemplazar con suplemmedios entados CM-MEF. Lave MEFs en placas de 48 pocillos 1 x con HBSS y añadir medios células madre. </li><li> Usando una pipeta de 200 l transferir suavemente tercio de la colonia diseccionado en una placa de 48 pocillos para la expansión. Transferir el otro 2/3 de la colonia diseccionado en una placa de 96 pocillos correspondiente que contiene medios suplementados CM-MEF. </li><li> Mantener ambas placas cambiando los medios de comunicación al día (complementado los medios de comunicación CM-MEF para placas Matrigel de 96 pocillos recubiertos y medios de células madre para placas de 48 pocillos que contenían MEFs; tanto suplementado con 0,5 mg / ml de puromicina). </li><li> Expandir hasta placas de 96 pocillos son 100% confluentes y luego inicialmente pantalla a través de PCR. </li></ol> 5. Selección y expansión de clones positivos <ol><li> Para preparar ADN genómico (método basado en 11) eliminar todos los soportes de las placas mediante la inversión, luego seque sobre toallas de papel. </li><li> Enjuague cada pocillo dos veces con PBS RT (100 l / pocillo de cada lavado), invertido y blot como para el paso 5.1. Coloque las placas a -80 ° C fo 1 - 2 horas para ayudar en la lisis celular (placas pueden almacenarse indefinidamente como este). </li><li> Mientras que las células son a -80 ° C. hacer Sarcosilo tampón de lisis (véase la Tabla 4) (50 l / pocillo). Para lisar las células, placas calientes durante 5 min a TA, luego tampón de lisis pipeta en cada pocillo. Selle los bordes de cada placa con cinta, colocar en un recipiente hermético que contiene toallas de papel húmedas para crear la humedad, e incubar O / N a 60 ° C. </li><li> Después de la incubación añadir 150 l de NaCl 5 M a 10 ml de -20 ° C etanol absoluto, se mezcla bien y añadir 100 ml a cada pocillo (Nota: etanol irá turbia cuando se añade NaCl). Golpeadores suavemente para mezclar (no pipeta) y salen por un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo la solución irá claro y el ADN se precipitará. </li><li> Retire la solución como en el paso 5.1 a continuación, añadir 150 l de etanol al 70% a cada pocillo. Invierta la placa suavemente y secar como antes. Repita este paso una mayor 2x. Nota: Debido a que el ADN precipitado natural adheres a la de plástico de cultivo de tejidos que no se desplacen durante estas etapas de lavado.) </li><li> Después del lavado final placas de centrifugar brevemente a la máxima velocidad para concentrar el ADN a la parte inferior de cada pocillo a continuación secar al aire a temperatura ambiente (o 37 ° C) durante al menos 30 min. </li><li> Añadir 40 - 50 l T0.1E (pH 8,0) (véase la Tabla 5) o TE (pH 8,0) a cada pocillo y colocar las placas a 65 ° C durante 1 hora oa 4 ° CO / N antes de usarlo por PCR. Resuspender el ADN golpeando suavemente los lados de la placa. Utilice 1-2 l de re-suspendido de ADN / 10 l de reacción de PCR. </li><li> Usando el Sistema de Alto PCR Expand Plantilla con brazo hPITX3 L gen. F y cebadores GFP brazo hPITX3 R L realizan la selección inicial de los clones a 58 ° C de recocido, extensión 45 seg, 35 ciclos. </li><li> Muestras de electroforesis con 1kb Hyperladder en un gel de agarosa al 1% que contiene GelRed a 100 V durante 45 min y detectar los clones positivos a través de iluminación UV. </li><li> Validar clones positivos de PCR mediante la digestión de ADN genómico de expaclones nded (ver más abajo) con HindIII y de hibridación sondas 5 &#39;y 3&#39; de los brazos de homología del vector a una transferencia Southern (como se ha descrito anteriormente en 1). Las sondas se generaron por PCR utilizando los pares de cebadores hPITX3 5 &#39;de la sonda F y R, y hPITX3 3&#39; de la sonda F y R, se digirió con EcoRI y se ligó en un vector de clonación general. </li><li> Dependiendo del número de clones positivos, preparar 2 pocillos de una placa de 6 pocillos pre-chapado con MEFs (2,0 x 10 4 células por cm 2). </li><li> Al día siguiente pretratar clones positivos en la placa de 48 pocillos con 10 M Y-27632 durante un mínimo de 1 hr. </li><li> Lave clones positivos con HBSS y añadir 300 l de Accutase. </li><li> Cuando las colonias se vuelven células individuales, añadir 1 ml de medio de células madre y recoger en un tubo de 15 ml. </li><li> Cambie los medios de comunicación todos los días. El día 2, Y-27632 puede ser retirado y las células cultivadas en medios de células madre. </li><li> Cuando las colonias son de 70 - 80% de confluencia, subcultura y congelar el resto de la colofragmentos ny. </li></ol>

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<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
<li>Collin, J., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+putting+a+finger+on+stem+cell+biology%3A+zinc+finger+nuclease-driven+targeted+genetic+editing+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).</li>
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<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).</li>
<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La generación de líneas celulares reporteras ofrece un medio poderoso para realizar un seguimiento, visualizar y aislar células de interés a partir de una población heterogénea derivadas de hESCs. Sin embargo, la orientación de genes por recombinación homóloga convencional ha demostrado ser extremadamente ineficiente para humanos CES 3. En este protocolo se describe una técnica relativamente sencilla para la introducción de un RP en el exón uno de los locus Pitx3, en hESCs usando un vector de orienta...

Células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales resultan en poblaciones de células heterogéneas, particularmente con respecto a la derivación de fenotipos neuronales específicas. Por lo tanto, aunque los cultivos contienen el fenotipo celular deseada, otra neuronal, tipos celulares disociados de la ONU no neuronal y están a menudo presentes 1. Estas características limitan la aplicación de ESC deriva fuentes de células para su uso en la terapia de reemplazo celular y en el modelado de la enfermedad vitro. Líneas celulares reporteras genéticos ofrecen un medio para visualizar, rastrear y aislar las células de interés, a condición de que la expresión de la proteína indicadora (RP) reproduce la expresión endógena. El uso de promotores inmediatamente aguas arriba de una región codificante del gen se puede utilizar para derivar reporteros genéticos crudo pero tales construcciones carecen de los elementos reguladores precisos que controlan la expresión génica endógena. En contraste, la recombinación homóloga ofrece laoportunidad de asegurar la expresión de alta fidelidad de la RP. En el pasado, apuntando vectores diseñados para la recombinación homóloga en los loci específico de interés se han utilizado para RPs en ratón CES (mESCs) apuntar usando electroporación como medio de suministro de ADN 1,2. Sin embargo, la generación de líneas celulares reportero a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente para CME humanas (hESCs), y por tanto sólo se ha documentado en un puñado de casos (revisado en 3). Mediante el uso de una proteína quimérica de ingeniería que contiene una fusión de una nucleasa Fok I con motivos de dedos de zinc específicos del sitio, conocidas colectivamente como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), la DNA se rompe la doble cadena se pueden introducir en loci genómico predeterminado. Cuando se añade un vector de ADN con homología a ambos lados de la ruptura del ADN de doble cadena, el sitio genómico se puede reparar mediante recombinación homóloga, permitiendo la incorporación de la secuencia donante de ADN. Esta técnica ha demostrado ser útil fo edición genómico tanto en las células primarias humanas 4,5 y 6,7 hESCs. Un trabajo más reciente de transcripción ha utilizado activador de nucleasas efectoras (Talens), factores de transcripción utilizados por fitopatógenos 8, para ayudar en el diseño de nucleasas específicas de sitio 9. En el siguiente protocolo se demuestra la generación de una línea celular de células madre reportero por electroporación de un EGFP que contiene homóloga vector de orientación 6 junto con ZFNs para el homeobox pituitaria humana 3 (Pitx3) locus. Tras la selección de antibióticos durante 2-3 semanas, hESCs con ADN integrado correctamente pueden ser recogidos manualmente, se expandieron y se seleccionaron inicialmente mediante PCR, y posteriormente validados por transferencia de Southern.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células - 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0,22 &mu; filtro m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>cubeta de electroporación de 0,4 cm</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Human TV-hPITX3-forward construct de orientación Addgene</td><td></td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; PITX3</td><td>humano Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino, Calificado, Inactivado por Calor, Origen de EE. UU. (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales&nbsp; (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina solución salina sódica (Sarcosyl) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Clorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K solución (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Expandir Sistema de PCR de Plantilla Larga</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L brazo gen. F (cebador): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brazo hPITX3 L GFP R (imprimación): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Australia</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Una de las principales limitaciones con células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales es la generación de poblaciones de células heterogéneas. Estos cultivos contienen las células de interés, pero también se contaminan con los CES indiferenciadas, derivados no neurales y otros subtipos neuronales. Esto limita su uso en in vitro y en aplicaciones in vivo, tales como el modelado in vitro para el descubrimiento de fármacos o la terapia de reemplazo celular. Para ayudar a superar esto, las líneas celulares reporteras, que ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés, se pueden diseñar. Sin embargo, para lograr esto en células madre embrionarias humanas a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente. Este protocolo describe la orientación de la homeobox pituitaria 3 (Pitx3) locus de células madre embrionarias humanas mediante nucleasas de dedos de zinc de diseño personalizado, que introducen rupturas de doble hebra de ADN específicas del lugar, junto con unPitx3 - EGFP específico de vector donante de ADN. Después de la generación de la línea celular reportera Pitx3, entonces se puede diferenciar usando protocolos publicados para su uso en estudios in vitro tales como el modelado de la enfermedad o el reemplazo de células en la terapia de Parkinson.

Después de co-electroporación de la Pitx3 par zinc-finger de diseño personalizado junto con el Pitx3 - EGFP ADN específico de vector donante, y la selección de puromicina posterior, los clones de células madre positivas se detectaron inicialmente a través de la selección por PCR genómico (Figura 1). Hibridación de transferencia Southern de estos clones positivos de PCR con 5 'y 3' sondas específicas confirmó la orientación correcta para el exón 1 del locus Pitx3 <stro...

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

El objetivo general de este protocolo es dirigir de manera eficiente los transgenes a los loci de interés en las células madre embrionarias humanas utilizando nucleasas de dedos de zinc diseñadas a medida para hacer esto. Las células madre embrionarias humanas o HSC se expanden para generar suficiente material para la electroporación, y luego se digieren para producir células individuales. A continuación, el ARNm que codifica dos nucleasas de dedos de zinc de diseño personalizado se coelectropora en las HSC con la secuencia lineal del donante de EGFP y las células se siembran en embriones de ratón frescos, fibroblastos o MEF.Las nucleasas electroporadas de dedos de zinc introducen una rotura de doble cadena en el primer exón de la fosa X tres locus en las células. A continuación, la secuencia del donante EFGP, que está flanqueada por brazos dirigidos con homología con homología con la secuencia del sitio Brake de la hebra doblete de ADN, se incorpora durante la división celular después de 14 a 21 días. Un tercio de una colonia individual de HESC se pasa a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta de matrigel y los otros dos tercios se transfieren a un pocillo correspondiente de una placa de 48 pocillos que contiene ME Fs frescos. Cuando las células de las placas de 96 pocillos alcanzan la cofluidez, se examinan para la incorporación de la secuencia del donante mediante PCR.A continuación, se realiza la transferencia de Southern para confirmar la correcta integración. Una vez que se confirman los clones positivos, se expanden y luego se congelan para su uso posterior. La principal ventaja de esta técnica sobre la metodología existente, como la recombinación homóloga convencional, es que los dedos de zinc crean roturas de doble cadena de ADN predeterminadas, lo que facilita la selección eficiente de transgenes para predeterminar loci en células madre embrionarias humanas.Aunque aquí introducimos un gen trans en el foso X tres locus de células madre humanas, este método se puede adaptar a cualquier otro sistema en el que el uso de líneas celulares reporteras sea ventajoso. Comience este protocolo expandiendo las células madre embrionarias humanas o HSC para la transfección como se describe en el documento adjunto. Cuando las colonias confluyan entre un 60 y un 70%, coloque la placa de cultivo de tejidos en un microscopio de disección.Utilice una aguja de calibre 21 en el extremo de una pipeta de dos mil litros para acicalar las colonias eliminando las colonias diferenciadas o los núcleos de las colonias. A continuación, para lavar las colonias HESC aspirar el medio. A continuación, añade cinco mililitros de HBSS e incuba durante dos minutos.Después de la incubación, el HBSS agrega cinco mililitros de Accutane e incuba durante 10 a 20 minutos a 37 grados Celsius y 5% de CO2 hasta que las colonias se convierten en células individuales vistas bajo un microscopio. Usando una pipeta de un mililitro tri las células. A continuación, agregue 10 mililitros de medio HESC y, con un colador de celdas de 40 micras, fíltrelo en un tubo cónico de 15 mililitros.Para eliminar cualquier grupo de células, centrifugar el flujo a 160 veces la gravedad durante cinco minutos. Después del centrifugado Resus, suspenda el pellet de celda en cinco mililitros de medio HESC fresco y vuelva a girar para eliminar cualquier solución residual de Accutane. Vuelva a suspender las células en un medio HESC que contenga 10 micromolares Y 2 7 6 3 2 y transfiera a un plato de 100 milímetros pre-recubierto con gelatina incubada a 37 grados Celsius, 5% CO2 durante un mínimo de 30 minutos.Durante este tiempo, los MEFs se adherirán al plato recubierto de gelatina. Después de la incubación, utilice una pipeta de un mililitro para recoger las SSC HE no adherentes en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mililitros y determine la densidad celular con un hemocitómetro en preparación para la electroporación. Transfiera 7,5 millones de HSC como se preparó en la sección anterior de este video a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y centrífugo a 160 veces la gravedad durante cinco minutos.Después del centrifugado Resus, suspenda el pellet celular en 0,8 mililitros de HBSS filtrado helado de 0,22 micras, transfiera la solución a un veterinario de electroporación estéril de 0,4 centímetros. A continuación, agregue 30 microgramos de TVH pit X three forward targeting. Construya el ADN y mézclelo suavemente con una pipeta de 200 microlitros, incube en hielo durante cinco minutos durante la incubación, la descongelación y la alícuota de la fosa X, tres ARNm ZFN en hielo.Una vez descongelado, transfiera 7,5 microlitros a la mezcla de células de ADN en la electroporación Q vet mezclado suavemente con una pipeta de 200 microlitros. Presione el botón rojo en el electro para transfectar las celdas. A continuación, con una pipeta de 200 microlitros, transfiera el contenido del Electroporation Q Vet a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio HESC.Lave el Q VET dos veces con 200 microlitros de medio HESC y recoja las soluciones de lavado en el mismo tubo de 15 mililitros. Para eliminar la mucosidad resultante, como los residuos que consisten en ADN y proteínas de las células lisadas. Centrifugar a 160 veces la gravedad durante cinco minutos.Después del centrifugado, aspire el sobrenadante y golpee suavemente la celda de la celda para aflojar el gasto de Reese en 30 mililitros. M-E-F-C-M suplementado con RH FGF de dos y 10 micromolares Y 2 7 6 3 2 y placa en tres placas de 100 milímetros que contienen MEFs. Incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2, 95%O2.Cambiando el medio diariamente el segundo día, retire Y 2 76 32 y las celdas brutas solo en medio HESC. Después de dos o tres días, el HES CS debería tener un 50 a 70% de confluente en este punto. Comience la selección de antibióticos.Mantenga la selección añadiendo HESC fresco por medio de micina diariamente. Después de unos siete días, las colonias pequeñas deben ser visibles si no se utilizan MEF resistentes a los antibióticos. Los MEFs se pueden complementar añadiendo una adicional una vez 10 de la cuarta celda por centímetro cuadrado.De 14 a 21 días después de la selección cuando las colonias han alcanzado aproximadamente un milímetro de diámetro. Prepare las placas para la expansión y el cribado añadiendo 75 microlitros de matrigel o gel TRE a cada pocillo de 3 96. Las placas de pocillos también preparan 3 placas de 48 pocillos de MEF a dos veces 10 a la cuarta celdas por centímetro cuadrado, incuban ambos conjuntos de placas durante la noche a 37 grados Celsius, 5% de CO2 al día siguiente.Use una aguja de calibre 21 en el extremo de una pipeta de dos mililitros para diseccionar las colonias de HESC en 16 a 25 pedazos cortando una rejilla. A continuación, aspire el matrigel de placas de 96 pocillos y reemplácelo con medio CM MEF suplementado con R hf, GF dos y por micina. Lave los MEF en las placas de 48 pocillos con HBSS y luego agregue medio HESC con micina usando una pipeta de 200 microlitros.Transfiera suavemente un tercio de la colonia diseccionada a una placa de 48 pocillos para su expansión. Transfiera los otros dos tercios de la colonia diseccionada a la placa de 90 pocillos correspondiente que contenga medio C-M-M-E-F suplementado. El aspecto más difícil de este procedimiento es el traslado de las piezas de la colonia.Le sugerimos que practique la transferencia y disección de piezas de color de antemano. Mantenga ambas placas cambiando diariamente los medios suplementados con antibióticos. Expanda hasta que las placas de 96 pocillos sean 100% confluentes una vez que las placas sean confluentes.Retire todo el medio de los platos invirtiéndolo, luego seque sobre toallas de papel. Proceda a preparar el ADN genómico para la PCR como se describe en el documento adjunto después de que Resus suspenda el ADN en TE o TO 0.1 E.Realice la PCR utilizando el sistema de PCR de plantilla larga expandida como se describe en el documento adjunto, use uno a dos microlitros de ADN resuspendido por reacción de PCR de 10 microlitros después de la prueba de PCR para clones positivos por electroforesis y confirme por transferencia de sur. Una vez que se confirman los clones positivos, proceda con el subcultivo y congele el resto de los fragmentos de la colonia para diseñar un PIT X tres.Línea celular reportera hecs. Se combinaron con un par de dedos de zinc de la fosa X tres y el vector donante de ADN específico de EGFB de la fosa X tres, como se describe en este artículo de video, después de PERY y la selección, se detectaron clones positivos de HESC mediante la detección de PCR genómica, como se puede ver aquí. Hubo numerosos clones positivos, como lo indican las bandas en 9 84 pares de bases.A continuación, se realizó la hibridación con Southern blot de estos clones positivos para PCR utilizando cinco y tres sondas específicas. Esta ilustración muestra el esquema del vector de orientación linealizado, así como la ubicación de las sondas externas cinco y tres aquí. Se muestran las cinco y tres manchas del sur, tanto del tipo salvaje como de los alelos objetivo.La banda única en el carril de tipo salvaje indica dos alelos idénticos después de la correcta orientación del transgén a la fosa, se observan tres locus y dos bandas. Uno corresponde al alelo correctamente dirigido, el otro al alelo de tipo salvaje. Una vez dominada, esta metodología se puede realizar en dos o tres meses.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo dirigirse a las células madre humanas utilizando nucleasas de dedos de zinc, así como de cómo utilizar las estrategias de PCR y Southern blot para detectar CLS correctamente dirigidos.

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Investigación

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Biología

A pesar de los recientes avances en la modificación genética, la transfección de células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) sigue siendo un proceso caprichoso. Para nuestro conocimiento, los métodos sistemático y eficiente para transfectar las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) no se han reportado. Aquí se describen los protocolos robustos para transfectar eficiente y nucleofect CMPi humanos.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

El CompoZr personalizado nucleasa dedo de zinc (ZFN) Servicio permite la edición precisa en el genoma de cualquier organismo o línea celular en cualquier lugar definido por el usuario. En este artículo se describe el proceso para el diseño, fabricación, validación e implementación del Servicio de CompoZr ZFN personalizado.

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

La edición génica mediada por TALEN en el locus AAVS1 de puerto seguro permite la adición de transgenes de alta eficiencia en iPSCs humanas. Este protocolo describe los procedimientos para la preparación de iPSCs para TALEN y la administración de vectores donantes, la transfección de iPSCs y la selección y aislamiento de clones de iPSC para lograr la integración dirigida de un gen GFP para generar líneas reporteras.

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Aquí se presenta un método de edición gen rápida y eficiente basado en RMCE en el locus de AAVS1 humanas pluripotentes células madre (hPSCs) que mejora los sistemas anteriormente descritos. Usando esta técnica, líneas isogénicas se pueden generar rápida y fiable para los estudios comparativos adecuados, facilitar la investigación transgénesis mediada con hPSCs.

Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Aprende a dirigir transgenes al locus PITX3 en células madre embrionarias humanas usando nucleasas dedo de zinc. Este método mejora la recombinación homóloga para estudiar el desarrollo del SNC.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

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