Name: Un Protocolo de vídeo de la infección retroviral en Primaria Intestinal organoide Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a realizar transducción retroviral en organoides intestinales primarios para estudios genéticos funcionales. Este método permite la sobreexpresión o el silenciamiento inducibles de transgenes en un sistema organotípico in vitro.

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Koo BK y Mustata RC son apoyados por el Sir Henry Dale Fellowship de la Wellcome Trust y Andersson-Rolf A es apoyado por el Consejo de Investigación Médica (MRC). Fink J es apoyada por el Programa de Doctorado de 4 años Wellcome Trust.

Todos los ratones utilizados en el siguiente protocolo se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos, y todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a los reglamentos de los Estados Unido Home Office. 1. Preparación <ol><li> Preparar los medios de comunicación de 1 hora antes de su uso (véase la Tabla 1 y Lista de Materiales para más detalles) y pre-calentamiento en un baño de agua a 37 ° C por lo menos 10 minutos antes de su uso. </li></ol> 2. El cultivo del Intestino Delgado (SI) Organoides NOTA: A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizaron a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado. Equipo y reactivos entren en contacto con las células vivas deben ser estériles. Pre-calentamiento de la placa de cultivo tisular es importante ya que evita que la matriz de sótano (Matrigel o BME) gotas se propague hacia fuera cuando la siembra. Además, la matriz de sótano debe mantenerse en hielo en todo momento. Almacenar a -20 ° C y descongelaciónen hielo antes de su uso. <ol><li> Aislar Criptas <ol><li> Para el aislamiento del intestino delgado sacrificar el ratón de acuerdo con las normas y reglamentos nacionales, a continuación, colocar al animal a su espalda y lavar el abdomen con etanol al 70%. Realizar una incisión de línea media longitudinal desde la ingle hasta el esternón. En primer lugar, cortar la piel y luego el tejido subcutáneo. Retire el intestino delgado desde el ciego hasta el estómago. Criptas aisladas de duodeno, yeyuno y el íleon se pueden utilizar para el cultivo de organoide. </li><li> Lavar el intestino delgado aislado con pre-enfriado solución salina tamponada con fosfato sin calcio o magnesio (PBS0). </li><li> Cortar el tejido en 3-5 cm piezas largas y usar las tijeras para cortar abrir longitudinalmente. Extender el tejido mediante el uso de fórceps. </li><li> Raspe vellosidades utilizando un cubreobjetos. Precaución, demasiada fuerza hará que el tejido a desgarrarse y se reducirá el rendimiento de las criptas en los siguientes pasos. </li><li> Transferir el tejido a un tubo de 50 ml que contiene pre-enfriado usin PBS0fórceps g. Lave los fragmentos de tejido a través de una agitación vigorosa y cambiar el PBS0. Repita 2-3 veces o hasta que el PBS0 resulta menos nublado. </li><li> Incubar el tejido en un tubo de 50 ml que contiene 30 ml de PBS0 con 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 30 min a 4 ° C en un tubo de rodillo. </li><li> Agite vigorosamente el tubo y transferir el tejido a otro tubo de 50 ml que contiene 30 ml de PBS0 con EDTA 5 mM. La solución 1 mM de EDTA (anteriormente que contiene el tejido) contendrá una mezcla de criptas y vellosidades. Esta fracción no es adecuado para la siembra de organoides ya que a menudo contiene un alto porcentaje de las vellosidades. </li><li> Incubar el tejido adicionalmente durante 1 hora a 4 ° C en un tubo de rodillo. </li><li> Agite vigorosamente el tubo y recoger la solución en un tubo de 50 ml limpio. Confirmar la presencia de criptas y estimar el número, por ejemplo, contando las criptas en 50 l por microscopía de luz. Calcular el volumen necesario para obtener 50-100 criptas y la transfiere a un 1,5 ml de tube. </li><li> Gira a 300 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 50 l de matriz sótano, y la semilla en una placa de 24 pocillos pre-calentado. Incubar la placa en un incubador de cultivo tisular durante 5-15 min por lo que la matriz de sótano polimeriza. </li><li> Superposición con 500 l medio ENR (ver Tabla 1). Aproximadamente 24 horas después de la siembra los organoides mostrará una pequeña forma quística ronda y después de otros 2-3 días en ciernes estructuras se hacen visibles. Cambie a los medios ENR frescas cada 3 días. </li><li> Pasaje organoid culturas cada 7 días. </li></ol></li><li> Propagación y Organoides Mantenimiento <ol><li> Mantener los organoides mediante la actualización de los medios cada 3 días y el paso 1: 3 o 1: 5 como el lumen se llena con las células muertas, aproximadamente cada 7 días. </li><li> Romper la cúpula matriz sótano con medio usando 1 ml punta Pipetman y transferirla desde el pozo a un tubo de 1,5 ml. </li><li> Mecánicamente disociar los organoides a través de un pipeteoproximadamente 50x utilizando un fino (por ejemplo, 200 l) de punta. </li><li> Gira a 300 xg durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 150-250 l de matriz sótano. Semilla en un pre-calentó placa de 24 pocillos (50 l de matriz de sótano / pocillo). Antes de la siembra de la matriz sótano pipeta arriba y abajo una vez para recubrir la pared de la punta. Pipeta lentamente para evitar burbujas y semilla en el centro del pozo para evitar la matriz sótano se propague hacia fuera. Se desea obtener una cúpula de matriz sótano en el centro del pozo. </li><li> Incubar en un incubador de cultivo tisular durante 5-15 min por lo que la matriz de sótano polimeriza. Superposición con 500 l de medios ENR por pocillo. </li></ol></li></ol> 3. Pre-tratamiento de la infección SI Organoides NOTA: La Figura 1 ilustra el procedimiento de transducción. <ol><li> Intercambio ENR a ENRWntNic (ver Tabla 1) medio y crecer los organoides en tsu medio por un mínimo de 3 días o hasta que hayan adoptado una morfología quística. Wnt3a aumenta el número de células madre y de Paneth mientras nicotinamida (NIC) mejora la eficiencia de la cultura. </li></ol> Producción 4. Virus <ol><li> Se necesita un 150 mm placa de células Platinum-E por infección. Semilla de aproximadamente 5 x 10 6 células con 15-18 ml de medio (DMEM + 10% FBS) en presencia de puromicina (1 mg / ml) y blasticidina (10 g / ml). Transfectar células después de 2-3 días, cuando han alcanzado el 70-80% de confluencia. Cambie el medio a DMEM + FBS al 10% y sin puromicina y blasticidin antes de la transfección. </li><li> Añadir 30 g de constructo de ADN retroviral y 240 l de polietilenimina (PEI) para separar tubos que contenían 1 ml de Opti-MEM. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Reunir las dos soluciones y se incuba a temperatura ambiente durante 20-30 min. Añadir la mezcla completa al medio de las células Platinum-E y agitar con cuidado el plate para garantizar la distribución equitativa de los complejos ADN-PEI. </li><li> Se incuban las células Platinum-E con la mezcla de transfección durante la noche y refrescar el medio al día siguiente. Mantener las células en el nuevo medio durante 2 días. </li><li> Recoger sólo el medio en un tubo Falcon de 50 ml, pasarla a través de un filtro de 0,45 micras y se centrifuga a 8000 xg a 4 ° C durante 12-16 h. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 250 l de medio de transducción (ver Tabla 1). </li></ol> 5. organoide Preparación Fragmento <ol><li> Por una infección se necesita un pocillo de una placa de 24 pocillos. Romper la cúpula matriz sótano con medio usando 1 ml punta Pipetman y transferirlo a un tubo de 1,5 ml. </li><li> Utilice una punta de volumen más fino (por ejemplo, 200 l consejos) para interrumpir mecánicamente los organoides través de pipeteado (30-50x). La solución se enturbie ni organoides enteros debe ser visible. </li><li> Centrifugar a temperatura ambiente, 900 xg durante 5 min<html> . </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l de proteasa recombinante de calidad para cultivo celular (por ejemplo, TrypLE). Se incuba a 37 ° C durante 5 min. Después de la incubación comprobar el tamaño de los fragmentos de organoides utilizando microscopía de luz, contando el número de células por fragmento. Los fragmentos que contienen 5-10 células son ideales. Si la mayoría de los fragmentos contienen un mayor número de células el tiempo de incubación puede aumentarse por 2 min a la vez. </li><li> Terminar el proceso de disociación mediante la adición de 500 l de medio ENR. </li><li> Centrifugar a temperatura ambiente, 900 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y mantener el sedimento en hielo o 4 ° C. </li></ol> 6. Transducción retroviral <ol><li> Combinar fragmentos de organoides con 250 l de la solución retroviral (de la sección 4.5) en un pocillo de una placa de 48 pocillos. Mezclar suavemente con la pipeta lentamente usando 1 ml de punta Pipetman. </li><li> Sellar la placa con Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. espinoculación y Plating <ol><li> Centrifugar la placa a 32 ° C, 600 xg, durante 1 hora. Retire con cuidado el Parafilm e incubar la placa en un incubador de cultivo tisular durante 6 horas. </li></ol> 8. Siembra de infectados Fragmentos organoid <ol><li> La transferencia de los fragmentos de organoides infectadas y medios de transducción del pozo a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 900 xg durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y poner el tubo que contiene el sedimento en hielo durante 5 min a fresco. Añadir 100 l de matriz sótano y volver a suspender el precipitado pipeteando lentamente arriba y abajo. </li><li> Gotas de semillas de &#39;matriz sótano -Cell mezclar&#39; 50 l en una nueva placa de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 ° C durante 5-15 minutos hasta que se solidifica la matriz sótano. </li><li> Añadir un medio de transducción sin polibreno a los pocillos y se incuba la placa en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambie los medios de comunicación cada 2-3 días. </li></ol> 9. Selección <ol><li> Iniciar sílection después de 2-3 días por la adición de puromicina (1 mg / ml) a los medios de comunicación. </li><li> Cuando los fragmentos están empezando a formar organoides reemplazar el medio de transducción con los medios suplementados con puromicina ENR (1 mg / ml). </li></ol> 10. Post-Tratamiento de la infección de la IS Organoides <ol><li> Cultura transdujo organoides de acuerdo con la &quot;Propagación y mantener organoides&quot; protocolo (sección 2.2.1). Después de 1-2 semanas los organoides SI recuperarán sus estructuras en ciernes. </li><li> Tras la aparición de estructuras en ciernes inducir la expresión de los genes miARN o de ADNc mediante la adición de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) en una concentración de trabajo de 1 mM. Tenga en cuenta que este paso es válida sólo si el uso de vectores retrovirales Addgene (pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-dsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), y pMSCV -flip-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) y organoides que expresan Cre-ERT2. </li></ol> 11. La confirmación de la infección y Expresión / Supresión del gen de interés <ol><li> Si usando vectores retrovirales de Addgene (32702, 32703 y 32704) eficiencia de transducción puede ser confirmado por la observación de la expresión dsRed. Además, la expresión o supresión del gen de interés pueden ser confirmados por Western Blot, utilizando la GFP o 3xHA epítopo (por sobreexpresión de genes) y qPCR (por caída de genes), como se ejemplifica en Koo et al 4. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses declarado.

<html> Para lograr ciertos aspectos de alta eficiencia de transducción son críticos. Uno es el pre-tratamiento de organoides con medios ENRWntNic hasta que adoptan una forma quística ronda. Esto aumenta el número de células madre y por lo tanto la posibilidad de obtener una integración estable del transgén, así como el aumento de la tasa de supervivencia de los organoides SI durante todo el procedimiento de transducción. Otro parámetro es el tiempo de incubación siguiente espinoculación. Resultados de incubación demasiado corto o demasiado largo en una pobre eficiencia de transducción y pobre supervivencia de los organoides, respectivamente. El paso espinoculación no es esencial aunque aumenta significativamente el porcentaje de organoides transducidas. Finalmente, el virus de alto título es clave para la transducción con éxito. Esto depende del tipo de línea celular de empaquetamiento y el virus. La combinación de la línea celular Platinum-E y virus murino de células madre (MSCV), fue encontrado para producir un título lo suficientemente alto como para la transducción de organoides. ve_content &quot;&gt; A continuación se presentan consejos para la solución de problemas que puede ayudar a lograr la transducción exitosa. primer lugar, si la transfección de la línea celular de empaquetamiento es pobre, asegúrese de que la confluencia de las células es entre 70 a 80% y que el tiempo de incubación de la mezcla combinado PEI-ADN es entre 20-30 min. La supervivencia de los organoides durante la transducción depende en gran medida del tamaño de los fragmentos. Demasiado largo tripsinización hace que la mayoría de los fragmentos que consisten en menos de 3 células y por lo tanto disminuye la supervivencia organoide. Otro factor es la actividad de Wnt el medio acondicionado, si la actividad es demasiado baja impulsando a través de la adición de CHIR99021 en una concentración de trabajo de 5 M pueden aumentar la supervivencia. CHIR99021 inhibe la GSK3, lo que resulta en un aumento de la señalización de Wnt. Además, Y-27362, lo que impide anoikis se añade a los medios de transducción para mejorar la supervivencia organoide, ya que los organoides se interrumpen a fragmentos (que contienen 1-10 células) antes de la transducción. Como60; mencionado, el tiempo de incubación después de la espinoculación no debe exceder de 6 hr. Por último, si se observa pobre transducción se deben considerar los factores antes mencionados que influyen en el título viral y el límite de tamaño de la inserción para el vector retroviral. La eficiencia de la caída es altamente dependiente de los genes miARN. Dado que la eficiencia varía con la combinación del gen diana y los genes miARN vale la pena realizar una pantalla de eficiencia para identificar los que mejor funcionan. La técnica se limita a los fenómenos epiteliales del sistema organoide. En el futuro puede ser que sea posible estudiar enfermedades infecciosas o inmunes mediadas a través de co-cultivo de patógenos o la reconstitución con componentes derivados del sistema inmune, respectivamente. Además, los retrovirus sólo se pueden llevar a insertos de un tamaño relativamente pequeño. En consecuencia, de origen natural regiones reguladoras tienen que ser excluidos y por lo tanto la expresión del transgén no pueden imitar la deel gen endógeno. Como se mencionó anteriormente, la eficiencia de caída depende de la gen diana y los genes miARN. Si no miARN con eficiencia desmontables adecuado se puede encontrar que puede limitar el uso de la técnica para ese gen diana particular. Teóricamente, organoides son compatibles con todas las técnicas de manipulación normalizados que se utilizan para las líneas celulares. Transducción retroviral fue el primer método que se informaron 4, y recientemente BAC (cromosomas artificiales bacterianos) -transgenesis se ha convertido en disponible 5. Con un tiempo total de generación de 2-3 semanas, después de la transfección del plásmido viral en la línea celular de empaquetamiento, que es significativamente más rápido que la generación de un transgénico (TG) de ratón. Por el mantenimiento de la arquitectura de las criptas in vivo-vellosidades mientras que contiene células madre, así como todos los linajes de células diferenciadas del epitelio intestinal, el sistema de cultivo organoide cierra la brecha entre el animal y tg cultivo celular utilizado anteriormente. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; El protocolo descrito aquí proporciona un método para realizar análisis fenotípico de epitelio endodérmico in vitro a través de ganancia y deficitarias de estudios de la función. Esto hace que sea posible para hacer frente a las preguntas fisiológicamente relevantes de la biología de células madre adultas, con una necesidad mínima de ratones tg. Por ejemplo, la generación de ratones knockout condicional podría evitarse mediante el uso de organoides derivados de mutantes recién nacidos con letalidad perinatal 6. Además, la técnica se puede aplicar a organoides derivados de ratones knockout previamente establecidos para estudiar el papel de paralogues 7,8 mediante la realización de caída adicional. Tras el establecimiento de pequeños organoides intestinales, la adaptación del protocolo de cultivo original ha permitido el cultivo de páncreas, hígado, colon y estómago epitelios 9-11. Además, organoides intestinales humanos y organoides tumorales han sido derivados a partir de biopsias humanas normales, aden primariaoma y el cáncer colorrectal biopsias 10. El protocolo de infección viral se puede ampliar fácilmente a estos tipos de organoides y proporciona una manera sin precedentes de la realización de estudios funcionales en los tejidos humanos derivada. En conjunto, la transducción retroviral de pequeños organoides intestinales es un recurso valioso para la investigación de mantenimiento de células madre, diferenciación, y la decisión del destino celular, así como la señalización celular y de células por células interacciones.

Se necesita genética funcional de alta rendimiento para aumentar nuestra comprensión biológica del cuerpo, para mejorar la ciencia básica y la medicina actual. Genética del ratón ha sido el estándar de oro para la investigación de la función de genes in vivo, a pesar de que es a la vez que consume tiempo y costoso. Las líneas celulares, siendo la otra opción común, tienen una capacidad de caudal superior mientras que es menos costoso. Sin embargo, están impedidos por su incapacidad para reproducir el microambiente apropiado y con ello las respuestas fisiológicas visto in vivo. Por lo tanto, existe una necesidad inequívoca para un sistema de modelo-fácil de manejar, lo que permite costo / eficiente en el tiempo de análisis de alto rendimiento, mientras imitando las respuestas fisiológicas observadas en experimentos in vivo transgénicos (TG) de ratón. Para el epitelio endodérmico un sistema de este modelo apareció en 2009 1. Entre los conocimientos adquiridos desde el descubrimiento de las células madre intestinales Lgr5-positivos seinformación sobre el nicho correspondiente a los factores de crecimiento y de la matriz extra-celular necesarias para el mantenimiento de células madre. Utilizando esta información se hizo posible establecer &#39;mini-guts&#39; también conocidos como organoides 2. Recientemente se sugirió una nomenclatura de consenso para los cultivos in vitro, donde organoides se denominan &#39;enteroids&#39;, 3. Al igual que las líneas celulares, los organoides son cada vez más amplia y fácil de tratar con ligandos e inhibidores. Sin embargo, en lugar de ser de dos dimensiones que son estructuras tridimensionales de auto-organización que retienen la organización cripta-vellosidad, así como las células madre y linajes de células diferenciadas del intestino delgado (SI). Organoides constan de una sola capa de células epiteliales que rodean un área luminal. Estructuras salientes en ciernes corresponden a pequeñas criptas intestinales que contienen el compartimento de células madre. A partir de la punta de la estructura en ciernes células progenitoras se diferencian como MIrallar hacia el revestimiento epitelial, donde las células diferenciadas terminales se desprenden hacia la luz. En comparación con las líneas celulares, este sistema ex vivo recapitula más de cerca la fisiología normal y por lo tanto es un sistema modelo prometedor para el epitelio del intestino delgado. En este protocolo de vídeo de la transducción retroviral, se presenta un método que permite a los estudios ex vivo de la función de genes en este novedoso sistema de cultivo organoid. Comenzamos describiendo organoid cultura de una manera paso a paso, y seguimos demostrando la generación de los retrovirus, seguido por el procedimiento de transducción. Por último, hay una sección de consejos adicionales para la solución de problemas. Una ventaja de esta técnica es que se puede combinar con imágenes en vivo o cribado de fármacos para estudiar homeostasis, las decisiones del destino celular y las interacciones célula-célula en el epitelio intestinal. Debido a su arquitectura simple y tasa de rotación rápida, organoides representan un modelo s idealesistema para el estudio de la biología de células madre adultas. Además transducción retroviral se puede aplicar a organoides derivadas de ratones transgénicos preestablecidos, así como muestras de pacientes humanos. Cuando se acerca el knock-in y knock-out no puede extenderse a los seres humanos, los organoides humana SI constituyen una alternativa atractiva. En resumen, la manipulación genética a través de la transducción retroviral permite el análisis fenotípico en pequeñas organoides intestinales derivadas de ratones o muestras de tejidos humanos, complementando así la genética del ratón y líneas celulares, mientras que la apertura de nuevas vías para estudios en tejidos de origen humano. Transducción retroviral permite ganancia y la pérdida de función de los estudios a realizar en el sistema de cultivo organoide 4. Esto hace que sea un recurso valioso para la investigación de la función de genes, biología de células madre adultas y la enfermedad mientras está de acuerdo con las tres R (reducción, refinamiento y reemplazo).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 avanzado;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-acetilcisteína 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ratón EGF 500 &micro; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro; g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Medio acondicionado</td><td></td><td></td> R-Spondin <td>El medio acondicionado se genera a partir de células HEK293, para más detalles, véase Sato y Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Medio condicionado</td><td></td><td></td><td>Wnt El medio condicionado se genera a partir de celdas L, para más detalles, consulte Sato y Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamida 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro; M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &micro; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) suministrado por AMSBIO se puede utilizar como alternativa.</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 pocillos</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Células Platinum-E</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polietileneimina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de vídeo de la infección retroviral en primaria intestinal organoide cultura

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Células madre LGR5 positivos se pueden complementar con el crecimiento esencial Factores Egf, Noggin, y R-Spondin, lo que nos permite a la cultura cada vez más amplia de estructuras epiteliales 3D primarias in vitro. Tanto las propiedades de arquitectura y fisiológicas de estos &quot;mini-guts &#39;, también llamados organoides, se parecen mucho a sus contrapartes en vivo. Esto les un sistema de modelo atractivo para el epitelio del intestino delgado hace. Uso de la transducción retroviral, genética funcional ahora se pueden realizar por la sobreexpresión de genes condicional o caída. Este vídeo muestra el procedimiento de la cultura organoide, la generación de los retrovirus, y la transducción retroviral de organoides para asistir el análisis fenotípico de la pequeña epitelio intestinal in vitro. Este novedoso sistema modelo organotípico en combinación con la expresión génica mediada por retroviral proporciona una valiosa herramienta para el análisis rápido de la función génica in vitro sin la necesidad de costlGeneración Y y requiere mucho tiempo para animales transgénicos.

Organoides están listos para ser dividido cuando el lumen central se oscurece debido a la presencia de células muertas (Figura 2). Después de 2-3 días de organoides pre-tratamiento debe adoptar una morfología quística redonda (Figura 3). Esto aumenta el número de células madre, la mejora de las posibilidades de obtener la integración estable. El tamaño de la pastilla viral puede variar después de la centrifugación del sobrenadante viral, lo más probable debido a la variación contribución de los residuos celulares con el tamaño del pellet. No se ha observado una clara correlación con la eficiencia de transducción. Durante el procedimiento de selección organoides no transducidas morirán, mientras que los que tiene una integración estable se mantendrá. La proteína fluorescente de retrovirus MSCV-eGFP se observa en células procedentes de organoides supervivientes, que tienen una morfología quística, el plazo de 2-3 días después de la transducción (Figura 4). <img alt> = "Figura 1" fo: contenido-width = src "6 pulgadas" = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /&gt; Figura 1 Un dibujo esquemático del procedimiento de transducción retroviral. Antes de organoides de infección son pre-tratados con ENRWntNic hasta que adoptan una estructura quística (paso 1). Células Platinum-E se utilizan como la línea celular de empaquetamiento, y se cultivan hasta que alcanzan 70-80% de confluencia. A partir de entonces son transfectadas con el constructo retroviral usando PEI. Los virus se recogieron 2 días más tarde (etapa 2). Organoides se tratan con tripsina para obtener fragmentos que contienen 1-10 células (paso 3), y luego se infectan (paso 4). Después de la espinoculación para aumentar la eficiencia de infección (paso 5), los fragmentos de organoides infectadas se sembraron (paso 6) y 2-3 días después de selección de clones positivos con la integración estable puede ser realizado (paso 7). 1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/&gt; Figura 2. imagen Representante de organoides después de 4-6 días de cultivo. El lumen se llena de células muertas, lo que parece oscuro. Organoides en esta etapa están listos para ser pases. <img alt="Imagen de microscopía de burbujas de aire en un líquido durante el estudio de equilibrio estático, que demuestra la tensión superficial." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. imagen Representante de pequeños organoides intestinales cultivadas en medios ENRWntNic durante 3-4 días. Los organoides adoptar una morfología quística. <img alt="Imágenes de morfología celular, microscopio de campo claro y fluorescencia, análisis de estructura celular." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. imagen Representante de pequeños organoides intestinales (a) que muestran la expresión del transgén viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaCNED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Advanced DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Medio ENRWntNic (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a 4 ° C durante 2 semanas </td></tr><tr><td> Advanced DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 l </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> n-acetilcisteína (500 mM) </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> EGF de ratón (500 mg / ml) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> Noggin ratón (100 mg / ml) </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> R-Spondin Conditmedio ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a medio acondicionado </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamida (1 M) </td><td> 200 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Transducción medio (para 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Preparar fresco </td></tr><tr><td> Medio ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 mM) </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> Polibreno (8 ug / ml) </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Medio ENR (para 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Advanced DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 l </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> n-acetilcisteína (500 mM) </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> EGF de ratón (500 mg / ml) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> Noggin ratón (100 mg / ml) </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> R-Spondin medio acondicionado </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Medios de células Platinum-E (por 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a 4 ° C durante 12 semanas </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 g / ml) </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> Blasticidina (10 g / ml) </td><td> 500 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. composición de Medios para Advanced DMEM / F12 +++, medio ENRWntNic, medio Transducción medio ENR, y medio para las células Platinum-E.

Este protocolo explica cultura organoid-Lgr5 positve primaria y la posterior ejecución de la transducción retroviral. Esto permite la sobreexpresión Cre-inducible o caída del transgén entregado y permite estudios funcionales que se llevarán a cabo en la novela en organotípico vitro sistema modelo.

Un Protocolo de vídeo de la infección retroviral en Primaria Intestinal organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo realizar estudios genéticos funcionales en organoides. Esto se logra primero pretratando los organoides con medios que contienen WINT tres A para facilitar su adopción de una forma quística y aumentar su número de células madre. En el segundo paso, se produce el virus y los fragmentos de organoides se transducen e inoculan.En el paso final, los organoides transfectados se asientan y luego se seleccionan para una integración viral estable. En última instancia, la expresión o supresión del gen de interés puede evaluarse mediante fluorescencia GFP. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a los modelos de AL existentes como el ratón, es que con esta técnica se pueden realizar experimentos genéticos funcionales in vitro con los organoides intestinales.Para aislar las criptas, comience lavando el intestino delgado con PBS libre de calcio y magnesio previamente enfriado. Luego corta el pañuelo en trozos de tres a cinco centímetros de largo y abre los trozos longitudinalmente con unas tijeras. Use pinzas para abrir los tejidos, raspe el exceso de vellosidades con un cubreobjetos y luego transfiera las piezas a un tubo de 50 mililitros que contenga PBS enfriado.Lave los fragmentos de tejido dos o tres veces agitando vigorosamente, cambiando el PBS hasta que el PBS se vuelva menos turbio después del último lavado, incube el tejido en un tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de PBS suplementado con un milimolar de EDTA a cuatro grados centígrados en un rodillo de tubo. Después de 30 minutos vigorosamente, agite el tubo nuevamente y transfiera el tejido a otro tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de PBS suplementado con cinco milimolares de EDTA. Después de una hora, incube vigorosamente a cuatro grados centígrados en el rodillo de tubo.Agite el tubo nuevamente y transfiera la solución a un nuevo tubo de 50 mililitros. Luego cuenta el número de criptas en 50 microlitros. Calcule y transfiera el volumen que contiene de 50 a 100 criptas en un tubo de 1,5 mililitros.A continuación, gire las criptas y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de matriz de base. A continuación, siembre la solución de la cripta en una placa precaliente de 24 pocillos e incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante cinco a 15 minutos. Una vez que la membrana basal se haya polimerizado, incubar la matriz con 500 microlitros de medio ENR en una incubadora de cultivo celular.Al refrescar los medios cada tres días aproximadamente 24 horas después de sentarse, los organoides exhibirán una pequeña forma quística redonda. Después de otros dos o tres días, las estructuras en gemación se harán visibles mientras los organoides adoptan su morfología quística Semilla, aproximadamente cinco veces 10 a las seis células E de platino en un plato de 150 milímetros con 15 a 18 mililitros de medio suplementado con pur, micina y blastina. Después de dos o tres días, cambie el medio a medio sin antibióticos y agregue 30 microgramos de ADN retroviral y 240 microlitros de pi a dos tubos individuales que contengan un mililitro de óptimo cada uno.A continuación, mezcle los tubos e incube a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, agrupe las dos soluciones e incube a temperatura ambiente durante otros 20 a 30 minutos. Agregue la mezcla completa a las células E de platino y agite cuidadosamente la placa para asegurar una distribución uniforme de los complejos PI de ADN.Después de una incubación de toda la noche, refresque el medio y vuelva a incubar las células. Después de dos días, recoja solo el medio en un tubo Falcon de 50 mililitros y cuélelo a través de un filtro de 0,45 micras. A continuación, centrifugar la solución durante 12 a 16 horas a 8.000 veces G y cuatro grados Celsius, y resuspender el pellet en 250 microlitros de medio de transducción.Para preparar los fragmentos de organoides para la transducción retroviral, primero pipetee el cultivo de 30 a 50 veces con una punta de pipeta de 200 microlitros para interrumpir mecánicamente los organoides, la solución se volverá turbia y no se deben detectar organoides completos. Después de centrifugar los fragmentos, incubar el pellet en 500 microlitros de cultivo celular, grado proteasa recombinante a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, utilice un microscopio óptico para evaluar el tamaño de los fragmentos de organoides y contar el número de células por fragmento.A continuación, añada 500 microlitros de medio ENR para finalizar el proceso de disociación y reducir los fragmentos de células. Después de desechar el sobrenadante, coloque la bolita en hielo y luego siembre los fragmentos en un pozo de 48. Placa de pocillo en 250 microlitros de la solución retroviral previamente preparada.Mezcle suavemente la solución celular con una punta de pipeta de un mililitro y luego selle la placa con param para realizar la primera centrífuga de inoculación. La placa de 48 pocillos durante una hora a 600 veces G y 32 grados Celsius. A continuación, retire con cuidado la película para e incube la placa durante seis horas más en una incubadora de cultivos celulares.Después de la incubación, transfiera los fragmentos infectados a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, vuelva a girar los fragmentos de organoide y enfríe el pellet en hielo durante cinco minutos. Una vez que el pellet se haya enfriado, agregue 100 microlitros de matriz basal al tubo y pipetee lentamente el pellet hacia arriba y hacia abajo para volver a suspenderlo.A continuación, siembre 50 gotas de microlitros de la suspensión de la matriz de fragmentos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco a 15 minutos Después de que la matriz del basamento se haya solidificado, incube los organoides con medios de transducción sin policerebro. Después de dos o tres días, agregue medios que contengan purmicina a los pocillos para comenzar la selección. Cuando los fragmentos comiencen a formar organoides, reemplace el medio de transducción con un medio ENR suplementado.Con puram, los organoides de micina están listos para dividirse cuando sus lúmenes centrales se oscurecen debido a la presencia de células muertas. Después de dos o tres días de pretratamiento con los medios de Wint tres, los organoides deben adoptar una morfología quística cercana, aumentando el número de células madre y mejorando las posibilidades de obtener una integración estable en las células madre. En estas imágenes, se puede observar la expresión de la proteína fluorescente del retrovirus M-S-C-V-E-G-F-P en las células procedentes de los organoides supervivientes que adquirieron la morfología quística esperada dentro de los dos o tres días posteriores a la transducción.Al intentar este procedimiento, es importante verificar el tamaño de los fragmentos de organoide, ya que afecta en gran medida su supervivencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la transducción retroviral de organoides.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

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Aprende a realizar transducción retroviral en organoides intestinales primarios para estudios genéticos funcionales. Este método permite la sobreexpresión o el silenciamiento inducibles de transgenes en un sistema organotípico in vitro.

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