Name: Hidrogel Nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a concentrar biomarcadores de baja abundancia en plasma y orina mediante nanopartículas de hidrogel funcionalizadas. Este método mejora la sensibilidad diagnóstica en ensayos proteicos estándar.

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Michael Henry, Dublin City University, amablemente ayudó con la recopilación de datos y el análisis se muestra en la Figura 5. Este trabajo fue apoyado en parte por (1) George Mason University, (2) el italiano IstitutoSuperiore di Sanita &#39;en el marco de la Italia / EE.UU. convenio de colaboración entre el Departamento de Salud y Servicios Humanos, la Universidad George Mason, y el Ministerio de Salud Pública italiana, (3) de los NIH, subvenciones del programa IMAT 1R21CA137706-01 y 1R33CA173359-01 a LAL, y (4) Nanociencias Ceres, Inc .

El plasma humano y se recogió la orina de donantes voluntarios sanos, con el consentimiento informado por escrito, después de George Mason University Institutional Review Board aprobó protocolos. Los donantes se distribuyeron por igual entre hombres caucásicos y mujeres entre las edades de 25 y 42 muestras fueron analizadas de forma individual y no se agruparon. 1. Nanoparticle Procesamiento de suero o plasma Muestras Biomarcadores abundantes bajas potenciales en plasma son capturados, en solución, con nanopartículas de hidrogel. Las partículas se añaden al plasma, se incubaron, separadas por centrifugación, se lavaron, y las proteínas capturadas se eluyen. Las proteínas eluidas se secan bajo flujo de nitrógeno durante aguas abajo secuenciación de espectrometría de masas y la identificación. <ol><li> Diluir 500 l de suero de 1: 2 con 50 mM Tris HCl pH 7 (500 l de suero + 500 l Tris HCl) en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 500 l de poli (Nipam / AAC) nanop núcleoartículos. Incubar durante 15 min a TA. </li><li> Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 l tiocianato de sodio (25 mM) al sedimento. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 700 l de acetonitrilo a 300 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe ser prepared inmediatamente antes del uso. No guarde el tampón de elución. </li><li> Añadir 300 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA. </li><li> Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y guarde el eluido en un tubo de microcentrífuga limpio, etiquetado. </li><li> Repita los pasos 1.9 a 1.10. Combinar los dos eluidos en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Secar los eluidos bajo flujo de nitrógeno en un colector del evaporador de nitrógeno a 42,1 ° C, con flujo de aire se establece en 8 (Figura 2F). </li><li> Almacenar el producto eluido se secó a temperatura ambiente durante O / N de almacenamiento, o a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo, antes de la espectrometría de masas, el Western Blot, o ensayos ELISA (opcional). </li></ol> 2. Procesamiento de nanopartículas de Muestras de orina La orina normal contiene menos de 30 mg / dl de proteína ymenos de 1+ sangre. Sin embargo, muchas enfermedades / condiciones pueden alterar los niveles normales de proteína en la orina y la sangre. Para ayudar en la determinación del volumen óptimo de nanopartículas para añadir a la muestra de orina, un análisis de orina se lleva a cabo antes de la recolección de nanopartículas. Pueden existir biomarcadores de orina en concentraciones extremadamente bajas, que pueden requerir la optimización de la relación de las nanopartículas con el volumen de orina. Este procedimiento describe nanopartículas recolección de muestras de orina para el análisis de transferencia de Western aguas abajo. <ol><li> Recoger muestras de orina en un vaso de plástico limpio y seco. Se requiere un volumen mínimo de 22 ml. Orina conserve las muestras a -80 ° C hasta el momento de analizar. </li><li> Descongele la orina congelada a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mezclar brevemente en un vórtex. Vierta al menos 22 ml de orina en un tubo de polipropileno de fondo cónico de 50 ml. </li><li> Gira la orina en una centrífuga con un rotor oscilante en 3700 xg durante 15 min. Decantar la orina, sin perturbar el sedimento, en un polypr fondo cónico de 50 ml limpiotubo opylene. Deseche el sedimento. </li><li> Realice un análisis de orina usando un multi-analito &quot;tira reactiva de orina&quot; tira reactiva. Nota: almacene las tiras reactivas en un recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz solar directa y la humedad 17, 18. <ol><li> Coloque la tira reactiva, boca arriba, sobre una toalla de papel limpia y seca. </li><li> Usar una pipeta desechable para aspirar 1 ml de la orina preparado en la etapa 2.3. </li><li> Establecer un temporizador durante 2 minutos, pero no lo inicie. Dispensar rápidamente 1 - 2 gotas de orina en cada almohadilla de prueba de la tira de reactivo. Iniciar inmediatamente el temporizador. Nota: No sumerja la tira reactiva directamente en el recipiente de la orina. Los indicadores de colorante / químicas en la tira de reactivo potencialmente pueden filtrarse fuera de la tira de reactivo en el recipiente de orina. </li><li> A la hora indicada en el envase tira de reactivo, registrar los resultados cualitativos para los diversos analitos en la tira de reactivo mediante la comparación del color de las tiras reactivas individuales en los correspondientes indica un código de coloresres en el recipiente de reactivo. Resultados de orina normales típicos son: (normal o negativo) de sangre, proteínas, leucocitos, nitrito, glucosa, cetona, bilirrubina y urobilinógeno; PH de la orina (5,5 a 7,0); gravedad específica (1,001-1,020). Nota: Los niveles altos de proteína en una muestra de orina, pueden competir con la proteína de interés en los puntos de las nanopartículas vinculante. Para maximizar la cosecha proteína con nanopartículas, la relación de volumen de volumen de nanopartículas / orina se puede ajustar a cualquiera de limitar la competencia de las proteínas de alta abundancia, o puede ser optimizado para cosechar las proteínas que existen en concentraciones muy bajas. Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir volúmenes 2x de las nanopartículas en el paso 2.5 a continuación. Si el analito de interés es una proteína abundante muy bajo, puede ser necesario aumentar el volumen de las nanopartículas hasta 2 ml (Figura 3). </li></ol></li><li> Transferir 20 ml de la orina aclarado desde el paso 2.3 en un tubo de polipropileno de 50 ml de fondo cónico limpio. Noperturbar cualquier residuo / pellet que puede estar en la parte inferior del tubo de la orina. Añadir 200 l de nanopartículas a la muestra 20 ml de orina. Mezclar brevemente en un vórtex. Nota: Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir 400 l de nanopartículas a 20 ml de orina. </li><li> Incubar la mezcla de orina / nanopartícula durante 30 min a RT, sin balanceo / mezcla. </li><li> Haga girar la suspensión orina / nanopartícula en una centrífuga equipada con un rotor oscilante en 3700 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible después de la centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min. </li><li> Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas. </li><li> Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Transferir la solución de nanopartículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. </li><li> Girar las nanopartículas en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible folLowing centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min. </li><li> Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Repita los pasos 2,8 y 2,11 (dos veces) con 200 l 18 MilliQ agua para lavar las nanopartículas. </li><li> Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 970 l de acetonitrilo a 30 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe prepararse inmediatamente antes de su uso. No guarde el tampón de elución. </li><li> Añadir 20 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA. </li><li> Haga girar las muestras de nanopartículas a 16.100 xg durante 10 min. Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. No perturbar el sedimento de nanopartículas. Deseche el sedimento en la basura de riesgo biológico. </li><li> Colocar las muestras en un estante en una campana para vapores químicos. Abra las tapas y aumUbaté a TA durante 30 min. Alternativamente, colocar las muestras bajo flujo de nitrógeno a 40 ° C hasta que se seque (1 - 2 h). </li><li> Añadir 15 l de Tris-glicina SDS tampón de muestra (2x) a las muestras. Se calienta a 100 ° C en un bloque de calor seco durante 5 minutos con las tapas abiertas o hasta que el volumen que queda en el tubo no es más de 20 l. Nota: no utilizar un baño de agua hirviendo. La humedad del baño de agua será evitar la evaporación de la memoria intermedia. </li><li> Coloque la tapa en los tubos. Sacar los tubos del bloque de calor. La muestra puede ser almacenada a -80 ° C o utilizarse inmediatamente para el análisis de transferencia de western aguas abajo. </li></ol>

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<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina es un empleado de Ceres Nanosciences, Inc. que produce los reactivos utilizados en este artículo. Lance Liotta, Alessandra Luchini y Virginia Espina son titulares de patentes (patente estadounidense 7.935.518 y/o 8.497.137) sobre la tecnología de nanopartículas utilizada en este artículo. Como empleados de la universidad, tienen derecho a recibir regalías de estas patentes según la política de la universidad. Lance Liotta y Alessandra Luchini son accionistas de Ceres Nanosciences y forman parte del Consejo Asesor Científico.

Importancia clínica Se cree que una muestra de suero o plasma para contener baja abundancia de proteínas y péptidos que pueden proporcionar una rica fuente de información sobre el estado del organismo en su conjunto en circulación. A pesar de la promesa de la proteómica en suero, hay tres barreras fisiológicas fundamentales y serios que frenan el descubrimiento de biomarcadores y la traducción al beneficio clínico 10, 11, 16, 25. Puede...

A pesar de la finalización de la secuenciación del genoma humano, no se ha logrado avances significativos en la identificación de biomarcadores predictivos de la enfermedad en etapa temprana, o que se correlacionan con el resultado terapéutico o pronóstico 1. Una razón para esta falta de progreso es que existen muchas biomarcadores potencialmente significativos a una concentración por debajo del límite de detección de espectrometría de masas convencional y otras plataformas de descubrimiento de biomarcadores. Espectrometría de masas (MS) y Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) tienen una sensibilidad de detección típicamente mayor que 50 ng / ml, mientras que la mayoría de los analitos medidos por inmunoensayos en una caída de laboratorio clínico en el intervalo entre 50 pg / ml y 10 ng / ml . Esto significa que muchos biomarcadores, en particular en la etapa temprana de una enfermedad no pueden ser detectados por MS convencional y MRM 2. Además, la presencia de proteínas de alta abundancia tales como la albúmina y la inmunoglobulina en fluidos biológicos complejos, con frecuencia máscara por exc mil millones de vecesess de baja abundancia, proteínas de bajo peso molecular y péptidos 3, 4. Por esta razón se requieren varias etapas preparatorias de la muestra antes de la secuenciación de espectrometría de masas y la identificación. Uno de tales paso preparatorio emplea el agotamiento de proteínas de alta abundancia con columnas de agotamiento disponibles comercialmente 5-8. Desafortunadamente este paso conduce a la reducción del rendimiento de biomarcadores candidatos porque son a menudo asociadas no covalentemente con proteínas portadoras que están siendo eliminados. Otro desafío está representado por la estabilidad de biomarcadores candidatos ex vivo una vez que se recogieron las muestras. Las proteínas están sujetos a la degradación por proteasas endógenas o exógenas 9. Nanopartículas hidrogel puede superar estos retos críticos mediante la amplificación de la concentración de biomarcador putativo a un nivel dentro del rango del ensayo, mientras que la protección de la proteína de la degradación 10-13. Es importante señalar ªLMW en proteínas en la sangre son una mezcla de proteínas intactas pequeñas, así como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas del tejido derivado de más de 60 kDa son demasiado grandes para entrar pasivamente el flujo de sangre a través de la membrana basal vascular, pero pueden ser representados en la sangre como péptidos o fragmentos de proteínas 14. Nuestro objetivo es medir los biomarcadores novedosos de circulación que pueden ser candidatos para la detección temprana de la enfermedad, estratificación de los pacientes para la terapia y el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Nuestros nanopartículas se crean para excluir selectivamente inmunoglobulinas alta abundancia y albúmina, mientras que la captura simultáneamente proteínas y péptidos más pequeños y concentrándolos hasta 100 veces, dependiendo del volumen de partida. Nuestro grupo identificó un conjunto de pequeñas colorantes orgánicos que pueden actuar con éxito como de alta afinidad cebos moleculares para proteínas y péptidos. Colorante de unión a proteínas se cree que es debido a una combinación de interacción hidrófoba y electrostáticas. Los anillos aromáticos en el tinte se intercalan con las proteínas a través de bolsillos hidrófobos sobre la superficie de la proteína 11. Los cebos, dependiendo de su química, muestran una afinidad particular para las clases de analitos seleccionados. Los cebos compiten con las proteínas portadoras, como la albúmina, para las proteínas o péptidos. El peso de proteínas / péptidos de bajo peso molecular se quedan atrapados en la partícula. Proteínas de alto peso molecular tales como la albúmina y la inmunoglobulina se impide la entrada de la partícula debido a la capacidad de tamizado debido a la restrictiva de poro del hidrogel 11 (Figura 1). Nanopartículas de hidrogel son sintetizados por polimerización por precipitación iniciada por persulfato de amonio 11. N-isopropilacrilamida (Nipam), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) y alilamina (AA) y el agente de reticulación N, N &#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) se dejó reaccionar a 70 ° C durante 6 horas en condiciones diluidas 11, 13. La afinidad de unión de alta proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis logrado mediante la incorporación de covalentemente colorantes que contienen grupos amino (es decir., Colorantes sulfonatedanthraquinonetriazine) en las nanopartículas a través una reacción de amidación se realiza en disolventes acuosos u orgánicos dependiendo de las características hidrófilas / hidrófobas de los colorantes 11, se utiliza 13. sustitución nucleofílica de los grupos amina en la nanopartícula con el átomo de cloruro de un colorante anthraquinonetriazine para crear poli contiene el colorante (Nipam -CO-alilamina) (AA) nanopartículas 11, 12. Un procedimiento de polimerización de dos etapas se utiliza para crear nanopartículas de hidrogel que contiene una capa exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) 11, 13. Nanopartículas de hidrogel se pueden aplicar a diversos fluidos biológicos, incluyendo sangre entera, plasma, suero, fluido cerebroespinal, sudor, y orina. En un solo paso, en solución, la nanoparticles realizan una rápida (en minutos) el secuestro y la concentración de analitos de bajo peso molecular 10, 11, 13, 15-18. Las proteínas se eluyeron posteriormente de las nanopartículas y se detectaron usando Western Blot 19-21, espectrometría de masas 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, inmunoensayos / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​o microarrays de proteínas de fase inversa 16, 24 ensayos. Las nanopartículas funcionalizadas con el cebo químico, y la presentación de un núcleo o núcleo de la arquitectura cáscara, captura y se concentran las proteínas sobre la base de las propiedades fisicoquímicas de cebo / corteza. Diferentes colorantes incorporados en las nanopartículas, por lo tanto capturar diferentes subconjuntos de proteínas con eficiencia basado en la afinidad de tinte, el pH de la solución, y la presencia / ausencia de competir proteínas de alto abundante 13 variable. Además, la cantidad de nanopartículas en relación con el volumen de la solución afectará a la producción de proteína a partir de las nanopartículas. Estos aspectos dehidrogel nanopartícula cosecha se demostró utilizando tres cebos nanopartículas diferentes para las proteínas de recolección de muestras de plasma que contienen altas cantidades de proteínas, y de las muestras de orina que normalmente no contienen grandes cantidades de proteína. En este protocolo se demuestra la recolección y la concentración de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) a partir de muestras de plasma utilizando poli (NIPAM-co-AAC), poli (NIPAM / tinte), y las nanopartículas core-shell (poli (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanopartículas se muestran para concentrar el antígeno especies Mycobacterium que se añadió a las muestras de orina humanos, para imitar los individuos infectados por el Mycobacterium tuberculosis.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de hidrogel</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP partículas</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm de agua</td><td></td><td></td> de <td>grado reactivo tipo 1</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Disponible en VWR</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Disponible en VWR, ensayado al 28-30 % de NH3</td></tr> <tr><td>tiocianato de sodio 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Para muestras de suero/plasma</td></tr><tr><td>Tiras de reactivos de orina multianalito</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Para muestras</td></tr><tr><td>de orina Tampón de muestra Tris-Glycine SDS (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Úselo en RT para evitar que el SDS precipite</td></tr><tr><td>Incubadora de baño seco (100 oC) con bloque calefactor</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>No sustituya un baño de agua hirviendo</td></tr><tr><td>Colector del evaporador de nitrógeno</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Para muestras de suero/plasma</td></tr><tr><td>Centrífuga, rotor basculante</td> Serie <td>Sorvall</td><td>Legend Capacidad</td> del <td>tubo de 50 ml, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga, rotor de ángulo fijo</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Capacidad de microcentrífuga de 1,7 ml, rcf 16.000 x g</td></tr><tr><td>centrífuga cónica de 50 ml&nbsp; tubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Con tapón de rosca para muestras de orina</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Mezclador</td> de vórtice Eppendorf <td>22363204</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Segundos/minutos</td></tr></tbody></table>

hidrogel nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

El descubrimiento de biomarcadores Novela juega un papel crucial en la prestación de detección de la enfermedad más sensible y específica. Desafortunadamente muchos biomarcadores de baja abundancia que hay en fluidos biológicos no pueden ser fácilmente detectados con espectrometría de masas o inmunoensayos, ya que están presentes en muy baja concentración, son lábiles, y son a menudo enmascarados por proteínas de alta abundancia tales como albúmina o inmunoglobulina. Bait contiene poli (N-isopropilacrilamida) (Nipam) nanopartículas a base son capaces de superar estas barreras fisiológicas. En un paso que son capaces de captar, concentrar y preservar biomarcadores de fluidos corporales. -Analitos de bajo peso molecular entran en el núcleo de la nanopartícula y son capturados por diferentes tintes químicos orgánicos, que actúan como cebos de proteína de alta afinidad. Las nanopartículas son capaces de concentrar las proteínas de interés en varios órdenes de magnitud. Este factor de concentración es suficiente para aumentar el nivel de proteína de tal manera que las proteínas están dentro de lalímite de detección de los espectrómetros de masas actuales, el Western Blot, e inmunoensayos. Las nanopartículas se pueden incubar con una plétora de fluidos biológicos y que son capaces de enriquecer en gran medida la concentración de proteínas y péptidos de bajo peso molecular mientras que excluye la albúmina y otras proteínas de alto peso molecular. Nuestros datos muestran que una amplificación de 10.000 veces en la concentración de un analito particular se puede lograr, lo que permite espectrometría de masas y los inmunoensayos para detectar biomarcadores previamente indetectables.

Hidrogel Nanoparticle Tamaño y Uniformidad Poli (Nipam-AAC) partículas se han producido con muy alto rendimiento y reproducibilidad entre y dentro de los lotes. Las partículas tienen muy buena estabilidad coloidal a temperatura ambiente durante el tiempo necesario para la captura, almacenamiento, y la elución de las proteínas (por lo menos 48 h), y la precipitación de nanopartículas no se ha observado (Figura 1) 11. La estabilidad coloidal puede s...

Varios biomarcadores patológicos no pueden ser fácilmente detectados por las técnicas actuales debido a su baja concentración en fluidos biológicos, la presencia de enzimas degradantes y grandes cantidades de proteínas de alto peso molecular. Las nanopartículas de hidrogel funcionalizadas químicamente pueden recolectar, preservar y concentrar proteínas de baja abundancia, lo que permite la detección de biomarcadores previamente indetectables.

Hidrogel Nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar, concentrar y preservar biomarcadores de baja abundancia y bajo peso molecular a partir de fluidos biológicos en concentraciones adecuadas. Para los ensayos de proteínas estándar, esto se logra agregando primero nanopartículas de hidrogel químicamente funcionalizadas al fluido biológico, de bajo peso molecular. Los analitos entran en el núcleo de la nanopartícula y son capturados por diferentes tintes químicos orgánicos, que actúan como cebos de proteínas de alta afinidad.El segundo paso es separar las partículas del biofluido mediante centrifugación. Las nanopartículas concentran las proteínas de interés en varios órdenes de magnitud. A continuación, las nanopartículas se lavan con agua para eliminar las proteínas superfluas.El paso final es eluir las proteínas capturadas de las nanopartículas. En última instancia, se utilizan la transferencia de Western, la espectrometría de masas o los ensayos de aminoácidos para mostrar la presencia y/o la concentración de los biomarcadores de baja abundancia cosechados previamente indetectables. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las nanopartículas deben lavarse y volver a suspenderse.Sin obstruir la punta de la pipeta, las nanopartículas no se suspenden tan fácilmente como una célula P.So debe pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender adecuadamente las nanopartículas después de la primera incubación. En el caso de las nanopartículas, es importante enjuagar las paredes del tubo para recoger cualquier residuo de nanopartículas que pueda haberse adherido al tubo. Para realizar el procesamiento de nanopartículas de muestras de suero, diluya 500 microlitros de suero humano uno a dos con 50 milimolares tris, HCL pH siete en un tubo de microcentrífuga.Agregue 500 microlitros de acrilamida de poli y propilo isop o monómeros de poli nipam co de nanopartículas de núcleo de ácido acrílico e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar la muestra a 16, 100 veces G y 25 grados centígrados durante 10 minutos. En una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo, retire y deseche la natina SUP antes de agregar 500 microlitros de tiocianato de sodio al altículo y vuelva a suspender las nanopartículas pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces.Gire la muestra como antes y deseche el sobrenadante antes de agregar 500 microlitros de agua mili Q al gránulo de nanopartículas. Una vez más, resus suspende las nanopartículas pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de volver a centrifugar la muestra, tomé 300 microlitros de elucian fresco, tampón y resuspensión utilizando la técnica demostrada.Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un último centrifugado de la muestra, retire y guarde el EIT en un tubo de microcentrífuga limpio y etiquetado. Eluir por segunda vez y combinar los dos EIT en una microcentrífuga. Dos.A continuación, seque los EIT bajo flujo de nitrógeno y un colector de evaporador de nitrógeno a 42,1 grados Celsius con el flujo de aire ajustado a seis. Almacene el EIT seco a temperatura ambiente para su almacenamiento durante la noche, o agregue 20 grados centígrados negativos para el almacenamiento a largo plazo antes de los ensayos de espectrometría de masas, Western blot o EISA para realizar el procesamiento de nanopartículas de muestras de orina. Recoja un volumen mínimo de 22 mililitros y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para analizar.Descongele la orina congelada a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante la noche. Una vez descongelado, mezcle brevemente en un mezclador de vórtice. Luego vierta al menos 22 mililitros de orina en un tubo de polipropileno de fondo cónico de 50 mililitros.A continuación, centrifugar la orina en una centrífuga con un rotor oscilante a 3.700 veces G durante 15 minutos sin alterar el pellet. Decanta la orina en un tubo de polipropileno limpio de 50 mililitros y desecha el pellet. Realice el análisis de orina con una tira reactiva de tira reactiva de orina multianalito.Coloque la tira de reactivo boca arriba sobre una toalla de papel limpia y seca. Utilice una pipeta desechable para aspirar un mililitro de orina. Dispense rápidamente una o dos gotas de orina en cada almohadilla de prueba de la tira reactiva.Inicie inmediatamente un temporizador que se configuró previamente para dos minutos a la hora indicada en el contenedor de la tira reactiva. Registre los resultados cualitativos de los distintos analitos de la tira de reactivo comparando el color de las tiras de reactivo individuales con los indicadores codificados por colores correspondientes en el recipiente de reactivos. Los resultados normales típicos de la orina se caracterizan por un pH de 5,5 a 7,0 y una gravedad específica de 1,001 a 1,020.La orina debe ser negativa para proteínas sanguíneas, leucocitos, nitrito, glucosa, cetona, bilirrubina y urobilinógeno. A continuación, transfiera 20 mililitros de la orina clarificada a un tubo limpio de polipropileno de fondo cónico de 50 mililitros. No moleste ningún residuo que pueda haber en el fondo del tubo de orina del que está extrayendo la orina.Agregue 200 microlitros de nanopartículas a la muestra de orina de 20 mililitros y mezcle brevemente en un mezclador de vórtice. A continuación, incubar la mezcla de nanopartículas de orina durante 30 minutos a temperatura ambiente sin que se balancee ni se mezcle. Haga girar la suspensión de nanopartículas de orina en una centrífuga equipada con un rotor oscilante a 3.700 veces G durante 10 minutos.Después de quitar y desechar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de agua Milli Q al pellet de nanopartículas. Vuelva a suspender las nanopartículas pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera la solución de nanopartículas a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros.A continuación, haga girar las nanopartículas en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo a 16, 100 veces G durante 10 minutos. Retire y deseche el sobrenadante antes de repetir estos pasos con agua. Para lavar las nanopartículas, agregue 20 microlitros de tampón de elución fresco al gránulo de nanopartículas y vuelva a suspender las nanopartículas pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces.Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a girar las muestras de nanopartículas antes de retirar el snat sin alterar la pelletización de nanopartículas y guarde el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Deseche el pellet en la basura de riesgo biológico.Coloque las muestras en una rejilla en una campana de gases químicos. Abra las tapas e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Alternativamente, coloque las muestras bajo un flujo de nitrógeno a 40 grados centígrados hasta que se sequen.Agregue 15 microlitros de tampón de muestra SDS de tris glycine a las muestras. Calentar a 100 grados centígrados en un bloque de calor seco durante cinco minutos con las tapas abiertas o hasta que el volumen que quede en el tubo no supere los 20 microlitros. Coloque la tapa en los tubos y retire los tubos del bloque de calor.La muestra puede almacenarse a menos 80 grados Celsius o utilizarse inmediatamente para el análisis de Western blot aguas abajo. La electroforesis en gel 1D con tinción de plata demuestra la captura de nanopartículas y la concentración del factor de necrosis tumoral alfa a partir de plasma humano. La banda que representa el factor de necrosis tumoral alfa solo está presente en las EIT de nanopartículas designadas por la letra P para partículas, pero no en las nanopartículas sobrenadantes Funcionalizado con dos cebos químicos diferentes, el ácido acrílico o la cáscara del núcleo VSA pueden recolectar varias concentraciones de IL 17 a partir de la transferencia occidental plasmática del sobrenadante y la nanopartícula.El EIT demuestra claramente la presencia de IL 17 en la banda de 17,5 kilodalton en el eit, pero no en la nanopartícula de sobrenadantes. La recolección de muestras de orina puede revelar antígenos bacterianos y citocinas en esta página SDS teñida de plata. Análisis de muestras de orina Las muestras de los carriles U cuatro y U seis son EIT de nanopartículas procedentes de muestras de orina que contienen RET ESAT seis, una proteína asociada a Mycobacterium tuberculosis, y citocina IL dos A.Estas proteínas están representadas por las bandas prominentes a 15 kilodaltons. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se pueden usar las nanopartículas de gel para recolectar, concentrar y preservar biomarcadores poco abandonados en fluidos biológicos, al mismo tiempo que excluye las moléculas abandonadas no deseadas, lo que aumenta drásticamente la sensibilidad de detección de los métodos analíticos actuales.

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