Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las propiedades fisiológicas y farmacológicas del tejido muscular liso de la vejiga. Esto se logra diseccionando la vejiga de rata, abriéndola en una hoja plana y cortando tiras que contienen el músculo liso y los nervios del urotelio. En el segundo paso, el tejido se conecta a un transductor de fuerza conectado a amplificadores y estimuladores para medir la contractilidad muscular.

En el siguiente paso, se establece el tono basal y la viabilidad del tejido, y luego las tiras se exponen a estimulación farmacológica y/o eléctrica. En última instancia, se pueden medir los efectos de los estímulos sobre la contractilidad del tejido muscular liso de la vejiga. Este método se utiliza para caracterizar los efectos de los compuestos patológicos y farmacológicos en toda la vejiga, así como componentes específicos del tejido vesical, como los nervios del músculo liso en el urotelio, en humanos y en animales.

Esta técnica se ha utilizado ampliamente durante el desarrollo de terapias para diversas disfunciones vesicales porque representa un método de cribado rápido, fácil y reproducible para agentes farmacológicos en un entorno bien definido y controlado. Después de confirmar la anestesia por la pérdida de la extremidad posterior, retire el reflejo, afeite el abdomen del animal y luego exponga los órganos pélvicos a través de una incisión abdominal en la línea media. A continuación, identifique la vejiga y la uretra, y luego corte en el cuello de la vejiga cerca de la uretra proximal.

Para extraer la vejiga, coloque el pañuelo inmediatamente en un plato recubierto de protector de alféizar lleno de solución de Creb aireada. Luego, después de sacrificar al animal, inserte clavos de disección de tejido a través de la cúpula de la vejiga, el cuello y los uréteres para estabilizar el tejido para una mayor disección sin estirar el tejido. Recorte la vejiga de tejido extraño y luego abra el tejido desde la base hasta la cúpula para crear una cirrosis en lámina plana con el lado hacia abajo y con el lado luminal hacia arriba.

Coloque clavos de disección en cada esquina del tejido y luego retire el tejido de la vejiga, el cuello y la cúpula. A continuación, corta el tejido a lo largo desde la base hasta la cúpula en tiras de unos dos por ocho milímetros, colocando una pinza de tejido en ambos extremos de cada tira. Transfiera las tiras a las cámaras experimentales uniendo un extremo de cada tira a un transductor de fuerza y el otro a una varilla fija.

Ahora, estire suavemente los tejidos hasta que la tensión basal alcance un gramo. Inicialmente, el tejido tiende a relajarse, lo que se registra como una disminución de la tensión basal. Lave las tiras aproximadamente cada 15 minutos con crebs aireados tibios y ajuste la tensión base a un gramo.

Después de cada lavado, deje que los pañuelos se equilibren durante aproximadamente una o dos horas hasta que ya no se relajen. Una vez que la tensión basal sea estable, agregue cloruro de potasio directamente al baño durante cinco minutos o hasta que se alcance una respuesta de meseta para probar la viabilidad del tejido. A continuación, lave los tejidos de tres a cinco veces con crebs aireados tibios para permitir que el tejido vuelva a sus condiciones previas al tratamiento.

Para la estimulación farmacológica del músculo liso, agregue medicamentos de soluciones concentradas directamente al baño. Por ejemplo, para la estimulación de carbahol, agregue 10 microlitros de cada una de las concentraciones del estímulo a cada baño de tejido de 10 mililitros. Tan pronto como la respuesta de la concentración anterior alcanza una meseta.

En tiras paralelas, agregue cantidades iguales del vehículo para la estimulación neural del músculo liso o la estimulación del campo eléctrico. Establezca la duración del tren en tres a 10 segundos y el intervalo entre trenes con al menos un minuto de diferencia. Después de establecer la frecuencia de los estímulos del tren, ejecute una curva de respuesta en frecuencia que oscile entre 0,5 y 50 hercios para establecer la intensidad del estímulo.

Aumentar sistemáticamente el voltaje hasta que la amplitud de las contracciones alcance una meseta, manteniendo la frecuencia constante. Una vez que se han establecido los parámetros de estimulación, espere unos 20 a 30 minutos para que la estimulación del campo eléctrico, las contracciones evocadas se estabilicen antes de la prueba de drogas. Luego, para probar los efectos de alfa beta metileno a TP y atropina en la estimulación del campo eléctrico, por ejemplo, realice dos curvas de respuesta de frecuencia de control y luego agregue 10 microlitros de alfa beta metileno a TP a la tira de prueba y 10 microlitros de vehículo a las tiras de control.

El alfa beta metileno A TP estimula directamente los receptores púricos en el músculo liso y desensibiliza estos receptores, causando una contracción inicial de referencia. Después de que la respuesta vuelva a la línea de base, repita las curvas de respuesta de frecuencia en todas las tiras. Agregue 10 microlitros de atropina a la tira reactiva y 10 microlitros de vehículo a las tiras de control, y repita las curvas de respuesta de frecuencia al final de la estimulación del campo eléctrico.

Verificar la selectividad de la estimulación del campo eléctrico mediante el bloqueo de la transmisión neuronal con el bloqueador de canales de sodio tetra a toxina. Por último, suelta las tiras. Bloquéalas suavemente en un trozo de papel de seda para eliminar cualquier exceso de líquido y mide el peso de cada tira en una balanza para determinar los efectos sobre el tono muscular liso.

Utilice el software de análisis de datos adecuado para seleccionar una ventana de al menos 10 a 30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por el fármaco, y mida la amplitud de la contracción para determinar los efectos de los tratamientos experimentales en las contracciones neuronalmente evocadas. Mida la amplitud, la duración y el área bajo la curva de al menos tres contracciones antes y en el pico de la respuesta inducida por el fármaco. Por último, normalizar los datos para comparar los resultados entre las tiras y los tratamientos farmacológicos.

La actividad miogénica espontánea es una característica del músculo liso que cambia durante el desarrollo postnatal y la patología. En este experimento representativo, las tiras de ratas neonatas exhiben contracciones rítmicas de baja frecuencia y gran amplitud, mientras que las tiras de ratas adultas exhiben actividad de alta frecuencia y pequeña amplitud después de una lesión de la médula espinal. El patrón neonatal resurge otin, A-K-C-N-Q abridor de canales disminuye la amplitud de la actividad espontánea en tiras de rata adulta músculo liso tono y propiedades de contractilidad, que pueden ser influenciadas por el urotelio y la mucosa son factores importantes para la función adecuada de la vejiga durante el almacenamiento y la micción de la orina.

Por ejemplo, en este gráfico, la concentración dependiente aumenta en el tono del músculo liso. Se ilustra la activación de los receptores muscarínicos en tiras de vejiga de cerdo mediante llamada carica. Se observa una reducción de la contractilidad muscular en respuesta al tratamiento con carbahol en presencia de la mucosa.

Como se muestra en este gráfico, cinco receptores HT cuatro se expresan previamente en los nervios parasimpáticos, y su activación aumenta los niveles de acetilcolina. Estos gráficos ilustran la diferente eficacia y potencia del efecto excitador del agonista de cinco HT y cuatro receptores cisaprida en la vejiga humana frente a las tiras de íleon. Las diferencias de especies que existen en varios receptores se pueden evaluar utilizando este método de tira vesical.

Por ejemplo, estos datos muestran que los antagonistas de los receptores de bombesina tienen efectos excitatorios en la vejiga de rata, mientras que no tienen efectos en las tiras de vejiga de ratón o cerdo. Para la estimulación farmacológica, es importante prestar atención a la concentración, el momento y la duración de la aplicación del medicamento. Con el fin de evitar efectos inespecíficos sobre otros receptores o la desensibilización de los receptores objetivo para la estimulación neuronal, es importante elegir los parámetros correctos para la estimulación del campo eléctrico de acuerdo con el objetivo del experimento y asegurarse de que el estímulo no active directamente el músculo liso.