Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología
18 de agosto de 2014
Este manuscrito presenta una simple, pero potente, método in vitro para evaluar la contractilidad del músculo liso en respuesta a agentes farmacológicos o la estimulación nerviosa. Las principales aplicaciones son la detección de drogas y la comprensión fisiología del tejido, la farmacología y la patología.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar las propiedades fisiológicas y farmacológicas del tejido muscular liso de la vejiga. Esto se logra diseccionando la vejiga de rata, abriéndola en una hoja plana y cortando tiras que contienen el músculo liso y los nervios del urotelio. En el segundo paso, el tejido se conecta a un transductor de fuerza conectado a amplificadores y estimuladores para medir la contractilidad muscular.
En el siguiente paso, se establece el tono basal y la viabilidad del tejido, y luego las tiras se exponen a estimulación farmacológica y/o eléctrica. En última instancia, se pueden medir los efectos de los estímulos sobre la contractilidad del tejido muscular liso de la vejiga. Este método se utiliza para caracterizar los efectos de los compuestos patológicos y farmacológicos en toda la vejiga, así como componentes específicos del tejido vesical, como los nervios del músculo liso en el urotelio, en humanos y en animales.
Esta técnica se ha utilizado ampliamente durante el desarrollo de terapias para diversas disfunciones vesicales porque representa un método de cribado rápido, fácil y reproducible para agentes farmacológicos en un entorno bien definido y controlado. Después de confirmar la anestesia por la pérdida de la extremidad posterior, retire el reflejo, afeite el abdomen del animal y luego exponga los órganos pélvicos a través de una incisión abdominal en la línea media. A continuación, identifique la vejiga y la uretra, y luego corte en el cuello de la vejiga cerca de la uretra proximal.
Para extraer la vejiga, coloque el pañuelo inmediatamente en un plato recubierto de protector de alféizar lleno de solución de Creb aireada. Luego, después de sacrificar al animal, inserte clavos de disección de tejido a través de la cúpula de la vejiga, el cuello y los uréteres para estabilizar el tejido para una mayor disección sin estirar el tejido. Recorte la vejiga de tejido extraño y luego abra el tejido desde la base hasta la cúpula para crear una cirrosis en lámina plana con el lado hacia abajo y con el lado luminal hacia arriba.
Coloque clavos de disección en cada esquina del tejido y luego retire el tejido de la vejiga, el cuello y la cúpula. A continuación, corta el tejido a lo largo desde la base hasta la cúpula en tiras de unos dos por ocho milímetros, colocando una pinza de tejido en ambos extremos de cada tira. Transfiera las tiras a las cámaras experimentales uniendo un extremo de cada tira a un transductor de fuerza y el otro a una varilla fija.
Ahora, estire suavemente los tejidos hasta que la tensión basal alcance un gramo. Inicialmente, el tejido tiende a relajarse, lo que se registra como una disminución de la tensión basal. Lave las tiras aproximadamente cada 15 minutos con crebs aireados tibios y ajuste la tensión base a un gramo.
Después de cada lavado, deje que los pañuelos se equilibren durante aproximadamente una o dos horas hasta que ya no se relajen. Una vez que la tensión basal sea estable, agregue cloruro de potasio directamente al baño durante cinco minutos o hasta que se alcance una respuesta de meseta para probar la viabilidad del tejido. A continuación, lave los tejidos de tres a cinco veces con crebs aireados tibios para permitir que el tejido vuelva a sus condiciones previas al tratamiento.
Para la estimulación farmacológica del músculo liso, agregue medicamentos de soluciones concentradas directamente al baño. Por ejemplo, para la estimulación de carbahol, agregue 10 microlitros de cada una de las concentraciones del estímulo a cada baño de tejido de 10 mililitros. Tan pronto como la respuesta de la concentración anterior alcanza una meseta.
En tiras paralelas, agregue cantidades iguales del vehículo para la estimulación neural del músculo liso o la estimulación del campo eléctrico. Establezca la duración del tren en tres a 10 segundos y el intervalo entre trenes con al menos un minuto de diferencia. Después de establecer la frecuencia de los estímulos del tren, ejecute una curva de respuesta en frecuencia que oscile entre 0,5 y 50 hercios para establecer la intensidad del estímulo.
Aumentar sistemáticamente el voltaje hasta que la amplitud de las contracciones alcance una meseta, manteniendo la frecuencia constante. Una vez que se han establecido los parámetros de estimulación, espere unos 20 a 30 minutos para que la estimulación del campo eléctrico, las contracciones evocadas se estabilicen antes de la prueba de drogas. Luego, para probar los efectos de alfa beta metileno a TP y atropina en la estimulación del campo eléctrico, por ejemplo, realice dos curvas de respuesta de frecuencia de control y luego agregue 10 microlitros de alfa beta metileno a TP a la tira de prueba y 10 microlitros de vehículo a las tiras de control.
El alfa beta metileno A TP estimula directamente los receptores púricos en el músculo liso y desensibiliza estos receptores, causando una contracción inicial de referencia. Después de que la respuesta vuelva a la línea de base, repita las curvas de respuesta de frecuencia en todas las tiras. Agregue 10 microlitros de atropina a la tira reactiva y 10 microlitros de vehículo a las tiras de control, y repita las curvas de respuesta de frecuencia al final de la estimulación del campo eléctrico.
Verificar la selectividad de la estimulación del campo eléctrico mediante el bloqueo de la transmisión neuronal con el bloqueador de canales de sodio tetra a toxina. Por último, suelta las tiras. Bloquéalas suavemente en un trozo de papel de seda para eliminar cualquier exceso de líquido y mide el peso de cada tira en una balanza para determinar los efectos sobre el tono muscular liso.
Utilice el software de análisis de datos adecuado para seleccionar una ventana de al menos 10 a 30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por el fármaco, y mida la amplitud de la contracción para determinar los efectos de los tratamientos experimentales en las contracciones neuronalmente evocadas. Mida la amplitud, la duración y el área bajo la curva de al menos tres contracciones antes y en el pico de la respuesta inducida por el fármaco. Por último, normalizar los datos para comparar los resultados entre las tiras y los tratamientos farmacológicos.
La actividad miogénica espontánea es una característica del músculo liso que cambia durante el desarrollo postnatal y la patología. En este experimento representativo, las tiras de ratas neonatas exhiben contracciones rítmicas de baja frecuencia y gran amplitud, mientras que las tiras de ratas adultas exhiben actividad de alta frecuencia y pequeña amplitud después de una lesión de la médula espinal. El patrón neonatal resurge otin, A-K-C-N-Q abridor de canales disminuye la amplitud de la actividad espontánea en tiras de rata adulta músculo liso tono y propiedades de contractilidad, que pueden ser influenciadas por el urotelio y la mucosa son factores importantes para la función adecuada de la vejiga durante el almacenamiento y la micción de la orina.
Por ejemplo, en este gráfico, la concentración dependiente aumenta en el tono del músculo liso. Se ilustra la activación de los receptores muscarínicos en tiras de vejiga de cerdo mediante llamada carica. Se observa una reducción de la contractilidad muscular en respuesta al tratamiento con carbahol en presencia de la mucosa.
Como se muestra en este gráfico, cinco receptores HT cuatro se expresan previamente en los nervios parasimpáticos, y su activación aumenta los niveles de acetilcolina. Estos gráficos ilustran la diferente eficacia y potencia del efecto excitador del agonista de cinco HT y cuatro receptores cisaprida en la vejiga humana frente a las tiras de íleon. Las diferencias de especies que existen en varios receptores se pueden evaluar utilizando este método de tira vesical.
Por ejemplo, estos datos muestran que los antagonistas de los receptores de bombesina tienen efectos excitatorios en la vejiga de rata, mientras que no tienen efectos en las tiras de vejiga de ratón o cerdo. Para la estimulación farmacológica, es importante prestar atención a la concentración, el momento y la duración de la aplicación del medicamento. Con el fin de evitar efectos inespecíficos sobre otros receptores o la desensibilización de los receptores objetivo para la estimulación neuronal, es importante elegir los parámetros correctos para la estimulación del campo eléctrico de acuerdo con el objetivo del experimento y asegurarse de que el estímulo no active directamente el músculo liso.
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Resumen
Este manuscrito presenta un método para evaluar las propiedades fisiológicas y farmacológicas del tejido muscular liso de la vejiga. La técnica consiste en diseccionar la vejiga de rata y medir la contractilidad muscular en respuesta a agentes farmacológicos o a la estimulación nerviosa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Farmacología
- Fisiología
Antecedentes
- Comprender la contractilidad del músculo liso es fundamental para la selección de fármacos.
- El método proporciona información sobre la fisiología y la patología del tejido.
- El músculo liso de la vejiga es esencial para la función urinaria.
- Evaluar la contractilidad puede ayudar a comprender diversos trastornos de la vejiga.
Objetivo del estudio
- Caracterizar los efectos de estímulos farmacológicos y eléctricos sobre el músculo liso de la vejiga.
- Establecer un método confiable para evaluar la viabilidad y contractilidad del tejido.
- Mejorar los procesos de cribado de fármacos para afecciones relacionadas con la vejiga.
Métodos Utilizados
- Disecar la vejiga de rata en una lámina plana.
- Cortar tiras que contengan urotelio, músculo liso y nervios.
- Fijar el tejido a un transductor de fuerza para la medición de la contractilidad.
- Exponer las tiras a estimulación farmacológica y eléctrica.
Resultados principales
- Se estableció con éxito el tono basal y la viabilidad del tejido.
- Las respuestas de contractilidad a los estímulos se midieron con precisión.
- El método caracterizó eficazmente los efectos de diversos compuestos.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar futuros estudios farmacológicos.
Conclusiones
- Este método es una herramienta poderosa para evaluar la contractilidad del músculo liso de la vejiga.
- Puede ayudar a comprender la fisiología y la farmacología de la vejiga.
- El enfoque es aplicable tanto a estudios en humanos como en animales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos de contractilidad de tiras de músculo liso vesical proporcionan una plataforma in vitro sólida para evaluar respuestas farmacológicas y fisiológicas relevantes para trastornos del tracto urinario inferior. Este método permite una interrogación precisa de los efectos de fármacos, la neurotransmisión y los mecanismos específicos del tejido, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos urológicos. Su reproducibilidad y adaptabilidad entre especies y estados patológicos lo convierten en una herramienta fundamental para la selección de carteras y la continuidad de la investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación directa de los efectos de fármacos sobre la contractilidad del músculo liso de la vejiga y la neurotransmisión.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de las respuestas del músculo liso, la mucosa y los nervios.
- Facilita la validación funcional del blanco mediante mediciones cuantitativas de la contractilidad.
- Permite evaluar cambios relevantes para la enfermedad, como alteraciones tras una lesión o cambios durante el desarrollo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema reproducible y controlado para la selección de agentes farmacológicos que afectan la función vesical.
- Normaliza las condiciones del ensayo para la comparación cruzada de compuestos y tipos de tejido.
- Genera resultados cuantitativos (amplitud, duración, área bajo la curva) para una evaluación robusta de compuestos.
- Permite escalabilidad y reutilización de la plataforma entre especies y condiciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los hallazgos preclínicos con mecanismos relevantes para la enfermedad observados en tejidos humanos y animales.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la modelización de estados patológicos y del desarrollo.
- Facilita la toma de decisiones sobre avances ajustados al riesgo basada en respuestas funcionales de los tejidos.
- Permite evaluar las diferencias entre especies y órganos en la respuesta farmacológica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este ensayo de contractilidad conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos activos y la validación preclínica al proporcionar una lectura estandarizada y cuantitativa de la función del tejido vesical.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías de neurotransmisores y la función de receptores en tejido vesical.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de contractilidad para la selección y optimización de compuestos.
- Análisis: Permite la medición de amplitud, duración y área bajo la curva para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Modela estados de enfermedad y desarrollo para orientar la alineación de biomarcadores y estrategias terapéuticas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma validada y adaptable para estudios farmacológicos y mecanicistas continuos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos de farmacología vesical.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos funcionales robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de candidatos a fármacos urológicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos, la medición de la contractilidad y el análisis de datos.
- Necesita instrumentación como transductores de fuerza, amplificadores y sistemas de adquisición de datos.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de ensayo y los métodos analíticos.
- Adaptable a diversas especies, etapas de desarrollo y modelos patológicos.
- Es fundamental prestar atención a la concentración del fármaco, el momento temporal y los parámetros de estimulación para garantizar la integridad de los datos.
